仿刺參中三萜皂苷類抗真菌化合物HolotoxinD～I及其製備方法

2023-12-03 20:07:56 4

專利名稱：：仿刺參中三萜皂苷類抗真菌化合物HolotoxinD～I及其製備方法
技術領域：
：本發明涉及醫藥
技術領域：
，是從海洋動物仿刺參中分離到的新的三萜皂苷類抗真菌化合物HolotoxinD、E、F、G、H、I及其製備方法。
背景技術：
：仿刺參(J/wW/c/zopw57'";w"/cwSelenka)是一種廣泛分布於我國山東、遼寧和河北、江蘇北部沿海的海參綱動物，屬刺參科仿刺參屬動物。已從該種海參動物中分離得三萜皂苷類化合物HolotoxinA、A,、B、B、C(KitagawaI.,YamanakaH.，KobayashiM.,efa/.SaponinandSapogenol,XV.Antifungalglycosidefromtheseacucumber幼c/zo/7wsy"/纖'cwsSelenka.(2).StructuresofHolotoxinAandHolotoxinB.CTzewPZ/ar5w〃，1976，24(2):275;Kitagawl.a,YamanakaH.,KobayashiM,,"cr/.SaponinandSapogenol.XXVII.RevisedstructureofHolotoxinAandHolotoxinB，twoantifungaloliglycosidesfromtheseacucumber5Wc/7opwsj'apomcwsSelenka.C/jew￡w〃，1978，26(12):3722;MaltserI.I,StonikVA,KalinovskyAI，"a/.Triterpeneglycosidesfromseacucumber5Wc/o;^y'a;ow/c船5We"^.Cowp.說oc/ew.fw'o/.1984,78B(2):421),但未見有關從該種仿刺參中分離得到HolotoxinD~I及其抗真菌活性的報導。
發明內容本發明提供從生長於我國渤海海域的仿刺參中提取分離到的6種新的三萜塏苷類化合物，分別命名為HolotoxinD，HolotoxinE，HolotoxinF，HolotoxinG，HolotoxinH，HolotoxinI，它們的化學結構通式如下0^^>OH其中，基團R,為CH20H或Me112為OMe或OHformulaseeoriginaldocumentpage5Rj為OH或OH或HA為雙鍵，分別位於7，8位或9，11位所說化合物的基團搭配分別如下formulaseeoriginaldocumentpage51、HolotoxinD:為無色結晶性粉末，熔點209-211°C，分子式C66H14032。Liebermann-Burchard反應和Molish反應陽性。電噴霧-正離子質譜(ESI-MS+):/n/z1431[M+Na]+;電噴霧-負離子質譜(ESI-MS)w/z1407[M-H]+。'H-NMR和13C-NMR譜數據見表1和表2。以15%的HC1水解皂苷後得到組成皂苷糖鏈的單糖，將其製備成組成糖腈乙酸酯衍生物，進行氣相色譜-質譜聯用分析，經與標準糖的糖腈乙酸酯衍生物比較對照，確定HolotoxinD的糖鏈由D-木糖、D-葡萄糖和3-0-甲基D-葡萄糖組成，比例為2:2:2。2、HolotoxinE:為無色結晶性粉末，熔點245-247。C，分子式C65H1Q2031。Liebermann-Burchard反應和Molish反應陽性。電噴霧-正離子質譜(ESI-MS+):m/z1401[M+Na]+;電噴霧-負離子質譜(ESI-MS-):w/z1377[M-H]+。tfl-NMR和l3C-NMR譜數據見表3和表4。以15%的HC1水解皂苷後得到組成皂苷糖鏈的單糖，將其製備成組成糖腈乙酸酯衍生物，進行氣相色譜-質譜聯用分析，經與標準糖的糖腈乙酸酯衍生物比較對照，確定HolotoxinE的糖鏈由D-木糖、D-喹諾糖、D-葡萄糖和3-0-甲基D-葡萄糖組成，比例為2:1:2:1。3、HolotoxinF:為無色結晶性粉末，熔點227-229。C，分子式C66H1Q6033。Liebermann-Burchard反應和Molish反應陽性。電噴霧-iH離子質譜(ESI-MS+):w/21449[M+Na]+;電噴霧-負離子質譜(ESI-MS》w/z1425[M-H]+。'H-NMR和l3C-NMR譜數據見表5和表6。以15%的HC1水解皂苷後得到組成皂苷糖鏈的單糖，將其製備成組成糖腈乙酸酯衍生物，進行氣相色譜-質譜聯用分析，經與標準糖的糖腈乙酸酯衍生物比較對照，確定HolotoxinF的糖鏈由D-木糖、D-喹諾糖、D-葡萄糖和3-(9-甲基D-葡萄糖組成，比例為2:1:1:2。4、HolotoxinG:為無色結晶性粉末，熔點197-199。C，分子式C65H12032。Liebermann-Burchard反應和Molish反應陽性。電噴霧-正離子質譜(ESI-MS+):w/z1417[M+Na]+;電噴霧-負離子質譜(ESI-MS-):w/z1393[M-H]+。'H-NMR和13C-NMR譜數據見表7和表8。以15%的HC1水解皂苷後得到組成皂苷糖鏈的單糖，將其製備成組成糖腈乙酸酯衍生物，進行氣相色譜-質譜聯用分析，經與標準糖的糖腈乙酸酯衍生物比較對照，確定HolotoxinG的糖鏈由D-木糖、D-喹諾糖、D-葡萄糖和3-0-甲基D-葡萄糖組成，比例為2:1:h2。5、HolotoxinH:為無色結晶性粉末，熔點164-166°C，分子式C58H94025。Liebermann-Burchard反應和Molish反應陽性。電噴霧-正離子質譜(ESI-MS+):w/z1213[M+Na]+;電噴霧-負離子質譜(ESI-MS》w/z1189[M-H]+。'H-NMR和13C-NMR譜數據見表9和表10。以15%的HCI水解皂苷後得到組成皂苷糖鏈的單糖，將其製備成組成糖腈乙酸酯衍生物，進行氣相色譜-質譜聯用分析，經與標準糖的糖腈乙酸酯衍生物比較對照，確定HolotoxinH的糖鏈由D-木糖、D-喹諾糖和D-葡萄糖組成，比例為2:1:2。6、Holotoxinl:為無色結晶性粉未，熔點164-166°C，分子式C59H96025。Liebermann-Burchard反應和Molish反應陽性。電噴霧-正離子質譜(ESI-MS+):Wz1227[M+Na]+;電噴霧-負離子質譜(ESI-MS-):w/z1203[M-H]+。'H-NMR和13C-NMR譜數據見表11和表12。以15%的HC1水解皂苷後得到組成皂苷糖鏈的單糖，將其製備成組成糖腈乙酸酯衍生物，進行氣相色譜-質譜聯用分析，經與標準糖的糖腈乙酸酯衍生物比較對照，確定HolotoxinI的糖鏈由D-木糖、D-喹諾糖、D-葡萄糖和3-0甲基D-葡萄糖組成，比例為2:1:1:1。tableseeoriginaldocumentpage8表2.HolotoxinD糖鏈部分的13C-NMR和^-NMR數據Position-MeGlc6126OMe105.483.276.877.764.1105.676.975.880.578.561.4105.173.887.869.366.7105.975.388.270.778.562.460.9103.073.388.169.978.562.2105.975.388.270.778.562.460.94.84d(7.2)4.20m4.26m4.33m3.94m，4.26m5.32d(7.0)3.93m4.24m4.46m3.99m4.53m，4.67m5.19d(7.3;)4.07m4.28m4.29m3.68m,4.22m5.34d(7.9)4.07m3.79m4.18m4.05m4.31m，4.55m3.94s5.18d(7.4)4.07m楊m4.16m4.02m4.31m,4.55m5.31dC7.7)4.07m3.79m4.18m4.05m4.31m，4.55m3.94sC-3(Aglycone)C-2(Xyl1)C-4(Glc勺C-3(Xyl,C-4(Xyl1)C-3(Gl)9據Position<5h(JinHz)HMBC136.21.51m,1.57m227.42.0m,2.18m389.23.35dd(3.8,11.9)4,30,31,439.8\548.6Ulm3,4,6,10.19.30623.52.09m7122.15.72m8144.2\947.33.79m1036.0\1122.71.66m,1.90m1229.92.14m,2.33m1356.91445.91552.22.55d(15.8),2.74d(15.8)13,14,16，17，3216213.1\1763.82.90,s12,13,16,18,20,2118178.81924.31.34s1,5，9，102083.5\2126.41.51s17,20,222238.61.75m,1.90m2322.61.50m,1.90mm2438.22.05m25145.8\26110.74.87s24,25，272722.31.78s24,25,262817.51.24s3,4,5,312928.91.39s3,4,5,303032.11.25s8,13，14,15表4.HolotoxinE糖鏈部分的13C-NMR和"H-NMR數據tableseeoriginaldocumentpage11tableseeoriginaldocumentpage12表6.HolotoxinF糖鏈部分的13C-NMR和'H-NMR數據Position<5h(/inHz)顧BCXyl11105.374.82d(7.)C-3(Aglycone)283.714.10m375.934.28m477.594.45m564.213.73tn，4.53mQui21105.665.23d(7.4)C-2(Xyl1)276.704.16m375.694.20m486.113.73m571.993.80m618.231.83d(5.7)Xyl31105.434.94d(7.5)C-4(Qui2)273.674.12m387.614.24m469.254.10m566.723.73m,4.45mMeGlc41105.795.38d(8.1)C-3(Xyl3)275.314.10m388.213.77m470.834.24m578.494.05m662,354.33m，4.53mOMe60.963.94(3H，s)Glc51103.015.05d(8.0)C-4(Xyl')273.334.12m388.214.28m469.864.18m578.493.94m662.234.33m,4.53mMeGlc61105.855.34d(7.8)C-3(Glc5)275.264.10m388.213.77m470.704.24m578.494.05m662.354.33m，4.53mOMe60.923.94(3H，s)表7.HolotoxinG苷元部分的13C-NMR和'H-NMR數據tableseeoriginaldocumentpage14表8.HolotoxinG糖鏈部分的13C-NMR和'H-NMR數據Position<5hinHz)腹BCXyl1124Qui212346Xyl31MeGlc41246OMeGlc51246MeGlc'126OMe6105.4483.7875.9577.5764.26105.5776.7275.7086.1171.9918.23105.3673.6387.7069.2666.77105.7675.3188.1570.9378.5762.4760.94103.0373.3088.1469.8778.4562.35105.7675.2688.1570.7578.5762.4760.904.82d(7.2)4.18m4.27m4.35m3.72m,4.38m5.23dC7.0)4.12m4.14m3.75m3.81m1.83d(5.9)4.93d(7.6)4.08m4.31m4.14m3.70m，4,21m5.37d(7.5)4.05m3.77m4.14m4.08m4,30m,4.47m3.94(3H，s)5.06d(7.9)4.08m4.31m4.14m4.08m4,30m,4.47m5.33d(7.9)4.05m3.77m4.14m4.08m4.30m,4.47m3.94(3H，s)C-3(Aglycone)C-2(Xyl1)C-4(Qui2)C-3(Xyl3)C-4(Xyl1)C-3(Glc')tableseeoriginaldocumentpage16表10.HolotoxinH糖鏈部分的13C-NMR和'H-NMR數據Position<5H(/inHz)bHMBCXyl11105.484.82,d,(7.3)C-3(Aglycone)283.604.11m376.134.28m477.514.39m564.393.76m，4.48mQui21105.845.25，d,(7.6)C-2(Xyl1)276.724.19m375.724.18m486.183.73m571.993.87m618.251.83d(5.8)Xyl31105.364.95,d,(7.6)C-4(Qui2)273.714.08m387.944.18m469.294.12m566.733.71m,4.29mGlc41105.765.41,d，(7.9)C-3(Xyl3)275.724.19m378.434.29m471,824.27m578.974.07m662.704.41m,4.61mGlc51103,575.08(overlap)C-4(Xyl1)274.534.10m378,374.29m471.824.27m578.804.07m662.704.41m,4.61m表11.HolotoxinI苷元部分的13C-NMR和工H-NMR數據Position3h(JinHz)腹BC136.451.48m，1.83m227.342.02m,2.28m388.913.30,dd(3.9,11.7)4,30,31,1(Xyl')440.16-553.151.00(overlap)3,4,6,10，19,30,31621.461.547m,1.78m728.681.61m840.802.39m9,11,14,329149.77-1039.82-11115.405.45m1236.772.23m，2.49m9,11,13,14,201344.28-1441.38-1549.772.19d(17.7)，2.41d(17.7)13，14,16,17,3216221.02-1764.722.97s12,13,16,18，20,211817.161.20s12,13,14,171922.601.18s1,5,9，102074.552126.651.57s17,20,222241.952.012m2322.601.81m，1.92m2438.772.19m25146.50-26110.594.92,d(16.1)24，25,272722.201.81s24,25,262816.981.20s3,4,5,312928.351.37s3，4,5，303019.021.00s8，13,14,1518tableseeoriginaldocumentpage19本發明化合物HolotoxinDI的製備方法如下(1)製備總皂苷提取物將新鮮的仿刺參冷凍乾燥後，粉碎成粉末，用重量比為510倍的50%95%乙醇水溶液熱水浴提取，提取液減壓回收得流浸膏，將流浸膏混懸於水中，過HP20或DA101大孔吸附樹脂柱，分別用純水、70%乙醇和95%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，回收至無醇味，用重量比為36倍的正丁醇萃取，取萃取液，回收溶劑濃縮至幹，得仿刺參總皂苷提取物；(2)分離純化上述總皂苷提取物進行正相矽膠柱層析，以氯仿甲醇水的體積比為106:1~4:0.10.8的溶劑洗脫，根據薄層層析檢測，收集含皂苷的流分，再經過ODS反相柱層析，以甲醇水的體積比5090:5010的溶劑洗脫，根據薄層層析檢測，收集含皂苷的流分，最後進行C,8高效液相色譜分離，以甲醇水的體積比為7090:3010作為流動相洗脫，分別得到HolotoxinDI的純nBPo本發明化合物HolotoxinD1經體外抗真菌活性實驗，表明這些化合物有明顯的抑制真菌生長的效果。具體實施例方式下面結合實施例，對本發明作詳細描述，但保護範圍不局限於實施例。實施例1從仿刺參中製備HolotoxinD~I將新鮮的冷凍乾燥後的仿刺參3.0kg，粉碎成粉水，用重量比為6倍的60%乙醇熱水浴提取，提取液減壓回收得流浸膏，將流浸膏混懸於水中，過HP20大孔吸附樹脂柱，分別用純水、70%乙醇和95%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，回收至無醇味，用重量比為4倍的iH丁醇萃取3次，合併萃取液，回收溶劑濃縮至幹，得仿刺參總皂苷提取物，再進行IH相矽膠柱層析，以氯仿甲醇水的體積比為7:3:0.5的溶劑洗脫，根據薄層層析檢測，收集含皂苷的流分，再經過ODS反相柱層析，以甲醇水的體積比70:30洗脫，根據薄層層析檢測，收集含皂苷的流分，最後進行Cw高效液相色譜分離，以甲醇水的體積比為80:20的溶劑作為流動相洗脫，分別得到HolotoxinD~I的純品為20.1mg，18.4mg，12.7mg，7.2mg，17.8mg，15.9mg。實施例2從仿刺參中製備HolotoxinD~I將新鮮的冷凍乾燥後的仿刺參4.5kg，粉碎成粉末，用重量比為5倍的70%乙醇水溶液熱水浴提取，提取液減壓回收得流浸膏，將流浸膏混懸於水中，過DA101大孔吸附樹脂柱，分別用純水、70%乙醇和95%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，回收至無醇味，用重量比為4倍的正丁醇萃取3次，合併萃取液，回收溶劑濃縮至幹，得仿刺參總皂苷提取物，再進行正相矽膠柱層析，以氯仿甲醇水的體積比為6:4:0.8的溶劑洗脫，根據薄層層析檢測，收集含皂苷的流分，再經過ODS反相柱層析，以甲醇水的體積比75:25洗脫，根據薄層層析檢測，收集含皂苷的流分，最後進行Cw高效液相色譜分離，以甲醇水的體積比為85:15的溶劑作為流動相洗脫，分別得到HolotoxinD1的純品為30.5mg，26.8mg，18.7mg，10.4mg，25.8mg，21.3mg。抗真菌活性實驗實驗所用真菌菌株白念珠菌(Ca"tfe/aa/Wcara)SC5314、新生隱球菌(Co^ococc^"eo/wwara)BLS108由第二軍醫大學長徵醫院菌種保存中心提供；熱帶念珠菌(Qm&Via"ci/)/cafc)、紅色毛癬菌(7Hc/zop/y^own/6n/w)、石膏狀,」、f包子菌(AZ/cros^ww附gy/^ew附)、薫'煙曲霧菌(^s/^rg/〃w51/w附/ga/i^)由第二軍醫大學長海醫院真菌室提供。陽性對照藥為伊曲康唑、特比芬、兩性黴素B、活力康唑、氟康唑和酮康唑。實驗前，用接種圈從4'C保存的沙堡葡萄糖瓊脂培養基上挑取新生隱球菌、白念珠菌和熱帶念珠菌少量，接種至lmlYEPD培養液，於35。C，250rpm振蕩培養，活化16h，使真菌處於指數生長期後期。取該菌液至lmlYEPD培養液中，用上述方法再次活化，16h後，用血細胞計數板計數，以RPMI1640培養液調整菌液濃度至lxl035xl3個/ml。將燻煙麴黴菌、紅色毛癬菌和石膏狀小孢子菌接種至沙堡葡萄糖瓊脂培養基斜面，其中，燻煙麴黴菌於35t:培養一周；紅色毛癬菌和石膏狀小孢子菌於28"培養兩周。各菌活化兩次後，加適量RPMI1640培養液於沙堡葡萄糖瓊脂培養基斜面，用吸管吹打菌落，使真菌孢子游離於RPMI1640培養液中，然後經四層無菌紗布過濾。培養液經血細胞計數板計數後，加RPMI1640培養液調整孢子濃度至lxl035xl。3個/ml。將本發明化合物及對照藥物分別用DMSO配成6.4g，L—1溶液，一20"C保存，實驗前，將分別取出置35'C溫箱融化備用。取無菌96孔藥敏板，於每排1號孔加RPMI1640培養液100、1作空白對照；312號孔各加新鮮配製的菌液120、1;2號孔分別加菌液160、1和受試化合物溶液1.6、1。211號孔10級4倍稀釋，使各孔中的藥物終濃度分別為64、16、4、1、0.25禾卩0.0625、0.0156、0.0039、0.00097、0.00024mg'L-1，各孔中DMSO含量均低於1%;12號孔不含藥物，作陽性對照。念珠菌(白色念珠菌和熱帶念珠菌)、新生隱球菌及絲狀菌(燻煙麴黴菌、紅色毛癬菌和石膏狀小孢子菌)藥敏板分別於35"C培養24h、72h和一周後，用酶標分析儀於630nm測各孔OD值。與陽性對照孔比，以OD值下降80^以上的最低濃度孔中的藥物濃度為MIQo(真菌生長80%被抑制時的藥物濃度)。實驗結果見表13。表13.HolotoxinD~I對真菌菌株的抑制作用(MIC80，mg'I/1)藥名山色念珠菌SC5314新生隱球菌BLS108熱帶念珠菌紅色毛癬菌0501124石膏狀小孢了菌31388燻煙曲荒菌0504656HolotoxinD848828HolotoxinE8484216HolotoxinF>641664646432HolotoxinG>64>64>6464816HolotoxinH1681616832HolotoxinI881616816伊曲康唑0.06250.1250.1250.1250.06252特比芬80.540.250.1250.25酮康譁0.06250.06250.1250.062564從表11可見，這六種化合物對6種真菌菌株均顯示明顯的抑制作用，因而可用於製備抗真菌藥物。本發明為研製新的抗真菌藥物提供了新的先導化合物，對開發利用中國的海洋藥用生物資源具有重要意義。權利要求1、三萜皂苷類抗真菌化合物HolotoxinD～I，其特徵在於化學結構通式如下其中，基團R1為CH2OH或MeR2為OMe或OHΔ為雙鍵，位於7，8位或9，11位所說化合物的基團搭配分別如下2、權利要求1所述抗真菌化合物的製備方法，步驟如下(1)製備總皂苷提取物將新鮮的仿刺參冷凍乾燥後，粉碎成粉末，用重量比為510倍的50%95%乙醇水溶液熱水浴提取，提取液減壓回收得流浸膏，將流浸膏混懸於水中，過HP20或DA101大孔吸附樹脂柱，分別用純水、70%乙醇和95%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，回收至無醇味，用重量比為36倍的正丁醇萃取，取萃取液，回收溶劑濃縮至幹，得仿刺參總皂苷提取物；(2)分離純化上述總皂苷提取物進行正相矽膠柱層析，以氯仿甲醇水的體積比為106:1~4:0.1~0.8的溶劑洗脫，根據薄層層析檢測，收集含皂苷的流分，再經過ODS反相柱層析，以甲醇水的體積比5090:5010的溶劑洗脫，根據薄層層析檢測，收集含皂苷的流分，最後進行<:18高效液相色譜分離，以甲醇水的體積比為70卯3010作為流動相洗脫，分別得到HolotoxinDI的純品。3、權利要求1所述三萜皂苷類化合物在製備抗真菌藥物中的應用。全文摘要本發明涉及醫藥
技術領域：
，是從仿刺參中分離到的6種三萜皂苷類抗真菌化合物HolotoxinD～I，化學結構通式如右，體外抗真菌試驗表明，這些化合物對白念珠菌SC5314、新生隱球菌BLS108、熱帶念珠菌、紅色毛癬菌、石膏狀小孢子菌和薰煙麴黴菌有明顯的抑制作用。本發明可為研製新的抗真菌藥物提供先導化合物，對開發利用中國的海洋藥用資源具有重要價值。文檔編號A61K31/704GK101671385SQ20091019614公開日2010年3月17日申請日期2009年9月23日優先權日2009年9月23日發明者劉寶姝,文張,張宏偉,易楊華,玲李,華湯,王增蕾,袁衛華申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學