多種微量試樣的注入和轉移方法

2023-12-10 23:22:27 1

專利名稱：多種微量試樣的注入和轉移方法
技術領域：
本發明涉及多種的微量液體試樣同時並行地向容器的注入、和轉移方 法。特別地，本發明涉及在進化工程、製藥、食品、生物風險、臨床檢驗 機構、化合物質毒性檢驗機構等中，在使多種微量液體試樣反應時所必需 的、可以同時並行地進行試樣的分取的方法。
背景技術：
將多種(例如1000種以上)、微量(例如亞鈉升)試樣塗布或結合
在板上來並行、同時地進行相同處理的微型板已得到實用。另一方面，人
們也開發出了將各種試樣結合到各自的小珠上進行操作的方式(on-beads 法)
但是，目前的方式中，需要用於將試樣塗布到板上的特別裝置(微型 描繪器(Micro-plotter)或微型分注器(Micro-dispenser))，其操作既費 事又費時間。另外，如此塗布的試樣在進行反應時，通常僅在一定的反應 條件下是可能的，即使轉移至不同的反應條件，所有的試樣也都置於相同 的反應的條件下，從而無法對超過1000種的多種試樣進行不同階段的反 應，或將這些所有試樣分別置於不同的反應條件下。另一方面，也有使用 小珠，在其中結合各自的試樣進行操作的方式，但目前沒有將這些小珠一 個一個地分開(空間分離)來進行操作。其理由是進行單獨分離的操作需 要開發特別的裝置，而且即使使用這些裝置，分離、配置時也很繁瑣，且 尚未公開後續處理較容易的方式(即，同時並行、快速地轉移試樣的方 式)。此外，製作超過1000種的不同的反應條件的簡便的方式也尚未想 到。
一方面，人們已知了在具有多個(multi)微孔的基板(plate)上，可 以同時進行例如PCR之類的生物化學反應(日本專利文獻特開平5 — 317030號公報(專利文獻O )。然後，還進行了為使微孔的容量更小，
並且能順利進行反應的改良(WO2002/025289 (專利文獻2))。但是， 使用目前的多孔板的方法或裝置時，雖然其他種類的試樣也同時進行反 應，但各反應的條件相同，不能對每一個孔的反應條件進行單獨地控制。

發明內容
發明要解決的課題
然而，很多時候想要對於相同的試樣，在反應液的組成不同的條件下 進行反應來研究其結果。但是，這種情況下，需要在各容器(孔)中單獨 地調整反應液的組成，但當其數目超過1000時，這種調整是不現實的， 實際上實施幾乎不可能。通常採用實驗設計法來代替，按照各條件的代表 性的設定進行實驗，再演繹出結果。
這是由於存在如下問題的緣故，即向超過1000的容器(孔)中填 充反應液太複雜，另外，在該情況下需要改變組成。
因此，本發明的第一目的在於提供一種即使對於超過1000的容器 (孔)，且即使容器(孔)的尺寸、形狀和表面狀態不允許溶液向容器 (孔)內的流入，也可以簡單地填充反應液等溶液的方法。
進而，本發明的第二目的在於提供一種即使對於超過1000的容器 (孔)，且即使容器(孔)的尺寸、形狀和表面狀態不允許溶液向容器 (孔)內的流入，也可以簡單地填充反應液等溶液，並且在該情況下也可 以容易地改變組成的方法。
特別地，本發明的目的在於提供一種即使容器(孔)的容量微小，也 可以進行上述操作的方法。 解決課題的手段
解決上述課題的本發明如下所述。 一種向由在至少一個主表面上具有多個孔的基板構成的多孔板的 孔內注入溶液的方法，其中，
上述孔具有如下的尺寸、形狀和表面狀態，即當上述孔的開口處於 向上的狀態，靜置多孔板時，即使上述孔的開口被上述溶液覆蓋，也不能
將溶液注入到孔內，
在上述多孔板的具有上述孔的主表面上放置溶液，施加從孔的開口朝 向底部的離心力將上述溶液注入到上述孔內。如[1]所述的方法，上述離心力為10Xg以上。如[l]所述的方法，上述孔的開口的最大內徑為5mm以下。如[3]所述的方法，上述離心力為20Xg以上。如[1]所述的方法，上述孔的開口的最大內徑為lmm以下。如[5]所述的方法，上述離心力為100Xg以上。如[1] [6]的任一項中所述的方法，上述孔的內部容量為lOiU以下。如[1] [6]的任一項中所述的方法，上述孔的內部容量為lul以下。如[1] [8]的任一項中所述的方法，上述多孔板具有1000個以上的孔。如[1] [9]的任一項中所述的方法，在上述主表面上放置具有多個 開口的濾膜，進而在該濾膜上放置溶液，施加從孔的開口到底部方向的離 心力，將上述溶液通過上述濾膜的開口注入到上述孔內。如[10]所述的方法，是將溶液通過上述濾膜注入到上述多個孔的 一部分孔內。 —種從由在至少一個主表面上具有多個孔的基板構成的多孔板 (2)的至少一部分的孔，將該孔內容納的溶液的至少一部分轉移至由在 至少一個主表面上具有多個孔的基板構成的多孔板(1)的孔內的方法， 其中，
上述多孔板(2)的孔具有如下的尺寸、形狀和表面狀態，即當上 述孔的開口處於向下的狀態，靜置多孔板(2)時，上述孔內的溶液不會 從孔中流出，
將上述多孔板(1)和多孔板(2)進行固定以使得兩塊板具有的至少 一部分孔彼此相對，施加從上述多孔板(1)的開口朝向底部的離心力， 將上述多孔板(2)的孔內的溶液注入到上述多孔板(1)的孔內。[13]如[12]所述的方法，上述多孔板(1)具有如下的尺寸、形狀和表
面狀態，即當上述孔的開口處於向上的狀態，靜置多孔板(1)時，即 使上述孔的開口被上述溶液覆蓋，也不能將溶液注入到孔內。如[12]或[13]所述的方法，將具有多個開口的濾膜放置在上述多孔 板(1)和多孔板(2)之間，施加從上述多孔板(1)的開口朝向底部的 離心力，通過上述濾膜的開口進行上述溶液的轉移。如[14]所述的方法，將溶液通過上述濾膜轉移到上述多個孔的一 部分孔內。如[12] [15]的任一項中所述的方法，上述多孔板(1)的孔和多 孔板(2)的孔的開口尺寸和形狀、以及排列是相同的。如[12] [15]的任一項中所述的方法，上述多孔板(1)的孔和多 孔板(2)的孔的開口尺寸和形狀、容量以及排列的至少一部分是不同 的。如[12] [17]的任一項中所述的方法，上述離心力為100Xg以上。
發明效果
根據本發明，可以進行迄今實現不了的極微量多種試樣的同時並行操 作(注入、、_y7° (Mess up)、轉移、多層、分割、計量等)。


圖l是本發明的方法(第一方式)的說明圖2是本發明的方法中使用濾膜的例的概略圖3是本發明的方法(第二方式)的說明圖4是本發明的方法(第二方式)的說明圖5是MMV製作原理的說明圖6是MMV製作方法說明圖7是MMV製作方法說明圖8是MMV的1個孔的說明圖9是使用MMV的培養狀況的說明圖10是使用MMV的培養結果(上為由螢光強度測定裝置得到的圖 片，下為照片)；
圖11是由螢光強度測定裝置得到的複製品製作的情況的圖(左為原
始，右為複製(replica);
圖12是多種溶液的逐次轉移的說明圖。
具體實施例方式
本發明的第一方式是向多孔板的孔內注入溶液的方法，所述多孔板由 在至少一個主表面上具有多個孔的基板構成。
本發明的方法中使用的多孔板(以下有時也稱為MMV (Multi Micro Vessel)(多重並行微小容器))是由在至少一個主表面上具有多個孔的 基板構成的。多個孔可以設在主表面上，也可以僅設在任何一個主表面 上。對設在多孔板的一個主表面上的孔的數目沒有特別的限定，但可以為 例如每平方英寸(2.5X2.5cm2) 1000個以上，處於1000 100,000的範圍 內。孔的數目可以根據使用多孔板的目的進行適當決定。
對孔的內部容量沒有特別限定，可以參考基板的大小、孔的數目、反 應(溶液的容量)等，進行適當決定。例如，孔的內部容量可以為10ul 以下，也可以為liU以下。對基板的材質沒有特別限定，例如可以由塑 料、矽、凝膠等構成。
上述孔具有如下的尺寸、形狀和表面狀態，§卩當上述孔的開口處於
向上的狀態，靜置多孔板時，即使孔的開口被應填充進孔的溶液所覆蓋， 也不能將溶液注入到孔內。即，當孔的開口具有某種程度的大小時，如果 在設有孔的主表面上放置一定量以上的溶液，則溶液會自然地流入孔內， 進行填充。但是，如果孔的開口的尺寸在一定值以下，由於表面張力，溶 液不會自然地流入孔內，需要使用微型注射器等來注入。這種現象的出現 不僅是由於孔的開口的尺寸，還由於孔的開口的形狀以及孔的開口和孔內 的表面狀態(特別是距開口較近部分的表面狀態)。進而，根據欲注入孔 內的溶液(液體)的物理性質的不同，也會產生這種現象。本發明的方法
是針對這種多孔板將溶液注入到孔內的方法，如上所述，所述多孔板即使 在設有孔的主表面上放置一定量以上的溶液，溶液也不會自然地流入孔 內。
即使在設有孔的主表面上放置一定量以上的溶液，溶液也不會自然地 流入孔內的孔，取決於孔的尺寸、形狀和表面狀態，但例如當孔的開口的
最大內徑為5mm以下時，溶液幾乎都自然地流入孔內。當孔的開口的最 大內徑為3mm以下時，溶液通常不會自然地流入孔內。當孔的開口的最 大內徑為lmm以下時，溶液不會自然地流入孔內，此時本發明的方法的 效果得到最佳發揮。
對孔的開口的形狀沒有特別限定，但可以列舉出例如圓形、方形(正 方形、長方形)、菱形、多邊形(例如六邊形、八邊形等)等。進而，孔 的開口可以是具有突出的尖端(唇形)的形狀，或者相反也可以對其進行 了倒角的形狀。
對於孔的深度，可以參考孔的開口的尺寸和孔內填充溶液的容量，進 行適當決定。 一般地，孔的深度相對於孔的開口尺寸的比例越大，溶液越 難以填充到孔內，當孔的深度相對於孔的開口的尺寸的比例為1以上時， 本發明的方法特別有效，當孔的深度相對於孔的開口的尺寸的比例為2以 上時，也能產生有效的功能。孔的深度相對於孔的開口的尺寸的比例例如 可以是1 10的範圍，優選為2 8的範圍，更優選為2.5 5的範圍。但 是，孔的深度最終要考慮到孔內填充溶液的容量和孔的開口的尺寸進行適 當決定，本發明的方法即使孔的深度相對於孔的開口的尺寸的比例超過 10，也能沒有問題地發揮功能，即，可以進行溶液的填充。另外，根據本 發明，也可以適用於孔為無底的類型(即，管狀)，此時，通過調節為適 當的條件(例如，離心力)，可以將溶液注入到孔(管)的中部，或者也 可以通到另一側。
對於構成多孔板的基板的厚度，可以參考上述孔的深度、和多孔板要 求的強度、特別是孔的底部要求的強度，進行適當決定。通常，基板的厚 度與上述孔的深度為同等程度以上時較合適。孔的正面各面的4條邊有時 可能未經精加工地切制而成，有時也可能具有設計成一定高度的邊緣的凸
起。
在本發明的方法中，在具有上述多孔板的孔的主表面上放置溶液，然 後施加從孔的開口到底部方向的離心力，將溶液注入孔內。對於離心力， 可以考慮到孔開口的尺寸等、溶液向孔內流入的困難程度，進行適當決
定，例如可以為10Xg以上。例如，當孔的開口的最大內徑為5mm以下 時，離心力優選為20Xg以上。進而，當孔的開口的最大內徑為lmm以 下時，離心力優選為100Xg以上，更優選為100 2000Xg的範圍。但 是，也可以根據孔的形狀或容量等，施加更高的離心力。
參照圖1進一步說明本發明的方法。圖1是在離心管內設置MMV的 說明圖。由於所使用的離心管的底部不是平面(是球面)，因此為使 MMV的設置面水平而向離心管內填充瓊脂糖凝膠(瓊脂糖凝膠的表面呈 水平狀)。但是，不必一定要是瓊脂糖凝膠，也可以使用其他的材料，另 外，也可以準備並使用底部為平面的離心管。在離心管內的瓊脂糖凝膠的 上面載置MMV，然後加入向MMV的孔內填充的試樣溶液(圖的左 側)。圖中，使用大腸桿菌溶液作為試樣溶液。然後，將該離心管安裝到 離心分離機上，採用規定的離心力進行離心。通過離心，試樣溶液被注入 進孔內(圖的右側)。
在通過離心而注入溶液時，如果能滿足施加離心力、MMV設置面是 平坦的、MMV的上方浸滿試樣溶液等條件，也可以使用除離心管以外的 工具。例如，首先在底部為平面的容器中放置MMV，然後向其上方加入 試樣溶液，通過手動旋轉容器來給予離心力，也可以將溶液注入MMV的 孔內。
本發明的方法中，將具有多個開口的濾膜置於多孔板的主表面上，進 而在該濾膜上放置溶液，施加從孔的開口到底部方向的離心力，也可以將 上述溶液通過上述濾膜的開口，注入到上述孔內。使用濾膜可以僅將溶液 注入到一部分孔中。濾膜的開口的圖案可以根據用途進行適當選擇。濾膜 的例子如圖2所示。
圖2示出了濾膜1 10。黑色圓點是溶液通過部分的開口。另外，在 圖的右下方表示組合使用該濾膜的多孔板。黑色圓點是孔，在縱和橫向的
列中分別設計了32個孔，合計有1024個孔。
濾膜l是每隔l行，設計l行開口 (l行32個)，合計16行。 濾膜2是每隔2行，設計2行開口 (l行32個)，合計16行。 濾膜3是每隔3行，設計3行開口 (l行32個)，合計16行。 濾膜4是每隔4行，設計4行開口 (l行32個)，合計16行。 濾膜5 8是將濾膜1 4的縱向和橫向(行和列)交替的濾膜。 濾膜9和IO是在一半的表面上設計16行或16列的開口 (1行或1列 32個)，合計16行或16列。
通過使用上述濾膜，且改變注入溶液的種類進行多次溶液注入，可以 控制孔內的溶液組成。如圖2所示，依次使用10張濾膜，每張濾膜向 MMV內注入不同組成的溶液。具體地說，在MMV上裝載濾膜1採用本 發明的離心法同時注入溶液。由此溶液進入的孔和無溶液進入的孔取決於 濾膜1的圖案。依次從濾膜2到濾膜IO進行該操作。這樣一來，對每1個 孔注入不同的溶液、或不注入溶液的這種選擇共有10次。換句話說通過 該操作可以填充2"種組成不同的溶液。§卩，在1024孔中可以填充21二 1024種組成不同的溶液。
如圖2的右下方所示，從具有1024個孔的MMV的左上方的孔開始， 標記成孔0 孔1023。依此進行整理。通過IO張濾膜實現1024種溶液環 境時，如將每1個孔的溶液狀態用10個數位(通過各濾膜的溶液注入成 為遍。10張即為10個數位)的二進位法(對於1張濾膜，有溶液進入時 為1，無溶液進入時為O)來表示，則孔O的溶液狀態為
。另 外，孑L 1023為[llllllllll]。如上所述，本發明的方法中，使用濾膜可以 自由且容易地(花費的功夫少)調整填充至孔內的組成。
本發明的方法中，對於孔內填充的溶液沒有特定的限定，但可以列舉 出在進化工程、製藥、食品、生物風險、臨床檢驗機構、化合物質毒性檢 驗機構等中，進行多種的微量液體試樣反應時使用的反應液或培養液。例 如，在鑑定微生物的種類時進行的營養需求試驗(胺基酸、糖、維生素或 無機離子等)或某種生物種類的基因變異試驗(即，考察新的營養需求性 或環境耐受性)的時候，並行處理多種條件的研究將變得容易。特別是，對於基因的種類，分別缺乏1種成分時症狀輕，但同時缺乏2種以上的成 分時，有時會受到發育阻礙(可以看到滲出變異體等。存在補充代謝系時 可以看到這種現象。)。這時在探尋哪種成分的組合是其原因時運用本方 法，由於可以同時實現數量龐大的種類的組合，因此很有效。即使僅涉及 2種成分，但存在數量的問題時，也可以同樣如此。例如，對於某種酶活
性，Mg+十和^111++具有替代性，假設其濃度分別在O.lmM到1M的範圍 內(假設有30種條件O.lmM、 0.2mM、 0.3mM……)進行各種變化，即 使僅僅進行組合也有數量龐大(900種條件)的種類。對此大致可以一次 進行。
本發明的第二方式是如下的一種方法，即從由在至少一個主表面上
具有多個孔的基板構成的多孔板(2)的至少一部分孔，將該孔內容納的 溶液的至少一部分轉移至由在至少一個主表面上具有多個孔的基板構成的 多孔板(1)的孔內。
本發明的第二方式中，使用了兩塊多孔板，將一個多孔板(2)的孔 內的溶液轉移到另一個多孔板(1)的孔內。這時，多孔板(2)的孔具有
如下的尺寸、形狀和表面狀態，即當孔的開口處於向下的狀態，靜置多
孔板(2)時，孔內的溶液不會從孔中流出。對於除此之外的方面，多孔 板(2)可以與上述第一方式中說明的多孔板相同。另外，多孔板(1)的
孔不必一定要具有如下的尺寸、形狀和表面狀態，即當孔的開口處於向
下的狀態，靜置多孔板(1)時，孔內的溶液不會從孔中流出，但是，如 果是這種多孔板也可以。或者，多孔板(1)與上述第一方式中說明的多
孔板相同，可以具有如下的尺寸、形狀和表面狀態，即當孔的開口處於 向上的狀態，靜置多孔板時，即使孔的開口被溶液覆蓋，也不能將溶液注 入到孔內。但是，並不限定於此。對於除此之外的方面，多孔板(1)可 以與上述第一方式中說明的多孔板相同。
本發明的第二方式中，將多孔板(1)和多孔板(2)固定起來，使得
兩塊板具有的至少一部分的孔彼此相對，施加從多孔板(1)的開口朝向
底部的離心力，將上述多孔板(2)的孔內的溶液注入到上述多孔板(1)
的孔內。該狀況如圖3所示。離心力與上述第一方式中相同，可以是10X g以上。為使溶液的轉移僅在孔間良好地進行，為使多孔板(1)的有孔的 主表面和多孔板(2)的有孔的主表面無間隙地密封，優選進行多孔板 (1)與多孔板(2)之間的固定。因此，優選兩基板的上述主表面的平面 性和平滑性非常優異，並且有時也優選使用固定兩基板的工具。
如圖3所示，多孔板(1)的孔與多孔板(2)的孔的開口尺寸和形 狀、以及排列例如可以相同。或者，多孔板(1)的孔與多孔板(2)的孔 的開口尺寸和形狀、容量以及排列的至少一部分也可以是不同的。例如， 對於多孔板(1)的孔與多孔板(2)的孔的形狀，也可以選擇成多孔板
(1) 的1個開口對應於多孔板(2)的2個以上的開口 (圖4的 (A))。或者，對於多孔板(1)的孔與多孔板(2)的孔的形狀，也可
以選擇成多孔板(1)的2個以上的開口對應於多孔板(2)的1個開口 (圖4的(B))。這種情況下，可以選擇各孔的開口形狀，使相互的開 口適當地匹配。
進而，如圖3所示，可以進行固定以使得多孔板(1)的孔與多孔板
(2) 的孔全部相對，也可以是固定使得僅一部分的孔相對(圖4的 (C))。另外，多孔板(1)的孔與多孔板(2)的孔可以具有相同的開
口形狀，也可以具有不同的開口形狀(圖4的(D))。
此外，將具有多個開口的濾膜放置在多孔板(1)和多孔板(2)之 間，施加從多孔板(1)的孔的開口朝向底部的離心力，通過上述濾膜的 開口也可以進行上述溶液的轉移。這裡使用的濾膜可以與上述第一方式中 說明的濾膜相同。通過濾膜，可以將溶液轉移到多個孔的一部分孔內。另 外，使用的濾膜不限於1張，也可以數張重疊使用。這樣一來，利用少數 幾張濾膜就可以大量變換開口的圖案。
實施例
下面，通過實施例進一步詳細地說明本發明。 實施例1 MMV製作
多孔板(MMV)分為幹型(SU—8等的塑料)和溼型(丙烯醯胺凝
膠)。本實施例中對於使用由丙烯醯胺凝膠製作的MMV的情況進行說 明。但是，使用幹型的多孔板也可以同樣地實施。
超高壓水銀燈的強光由於通過被稱為組合模塊的透鏡陣列，光呈總體
上模糊且均勻地照射。經過反射，將與置於DMDTM中由電腦輸入的數字
模式數據相同的模式投影到凝膠溶液上。由於核黃素的作用，紫外光照射 的地方產生聚合凝膠化。相反未經紫外光照射的地方則沒有開始聚合而保
持液體狀態，將該液體除去即形成空間(圖5)。利用該原理，製作了如 圖6所示形狀的2種MMV (a)和(b)。
為了製作這樣2種形狀的MMV，在作為MMV的聚合過程的紫外光 照射時，採用了分階段的投影方法(圖7)。
MMV (a)的情況首先將紫外光全面投影到凝膠溶液上，形成作為 孔底的^:y於0夕、'(Betting)凝膠，再在該Betting凝膠上充滿凝膠溶 液，投影紫外線形成孔。然後洗淨並除去孔中的未凝膠化的凝膠溶液。孔 的尺寸如圖8所示。
MMV (b)的情況首先用形成小孔的模具將紫外線照射到凝膠溶液 上，再在其上充滿凝膠溶液並用形成大孔的模具進行照射紫外線。然後洗 淨並除去孔中的未凝膠化的凝膠溶液。然後在事先製作好的Betting凝膠上 裝載形成2層孔的凝膠並照射紫外線，進行粘合。
凝膠溶液的組成如下
40%雙丙烯醯胺(1: 39) 10ml
20XTBE緩衝液 1.25ml
砂糖 12.5g
0.001%核黃素水溶液 > 、7 7 7 :y 7° (mess up) 合計 25ml
這裡，雙丙烯醯胺(1: 39)是表示N， N， 一亞甲基雙丙烯醯胺和丙 烯醯胺按重量比1: 39的比例的混合物。將該溶液流入聚合凝膠上，根據 如圖7所示的模具圖案進行光致抗蝕劑紫外光照射。製作具有與模具圖案 相同的均勻形狀的孔。
實施例2
MMV作為反應器的一種應用——進行大腸桿菌培養
(1) 使用的MMV是在25平方mm內有100個孔或1024個孔的 16%聚丙烯醯胺凝膠MMV。
(2) MMV交換凝膠薄片的凝膠緩衝液。相對於1片MMV在IX SSC 300ml中輕微振蕩45分鐘。進行2次該操作。
(3) 去除進行緩衝液交換的MMV的孔中的緩衝液。作為該方法， 是通過經過乾熱滅菌的濾紙從孔中進行吸出操作。
(4) 事先將綠色螢光蛋白(GFP)產生大腸桿菌TOPO10以或1或無 的程度的濃度置於MMV各孔中，並將大腸桿菌溶液充滿MMV各孔。作 為將大腸桿菌溶液充滿MMV各孔的方法，採用本發明的離心法(圖 1)。如果僅浸於大腸桿菌溶液中，則大腸桿菌溶液不會流入MMV的各 孔中，但施加約lOOOXg的離心力，可以將大腸桿菌溶液填充進全部孔 內。
(5) 將充滿大腸桿菌溶液的MMV轉移至培養皿中，並將進行緩衝 液交換的凝膠薄片覆蓋在MMV上，在1XSSC氣氛中密封培養皿，置於 孵卵器中在37i:下培養18小時(圖9)。
(6) 用螢光強度測定裝置檢測培養後GFP的螢光，檢測出大腸桿菌 的增殖情況。結果如圖10所示。
以概率分布的大腸桿菌增殖的MMV為基礎，製作圖案與該圖案完全 相同MMV。 [方法]
作為製作複製品的基礎的MMV是上述進行大腸桿菌培養的MMV。 (1)如上述在MMV中的大腸桿菌培養中所述，在MMV中進行大 腸桿菌培養。這時通過離心法將大腸桿菌溶液充滿孔時，存在有概率的有 大腸桿菌的孔和沒有大腸桿菌的孔，如圖10所示，適當地調整大腸桿菌 溶液濃度。
(2) 在培養大腸桿菌的MMV上疊放新的MMV (在1XSSC中進行 緩衝液交換，已吸出孔中的溶液)，使孔彼此對應，再裝進離心管，通過 在1000Xg下進行離心將孔中的溶液轉移到新的孔中(圖3)。
(3) 在兩MMV的孔中充滿LB培養基，在37。C下培養18小時。
(4) 用螢光強度測定裝置檢測培養後GFP的螢光，檢測出大腸桿菌 的增殖情況。結果如圖ll所示。圖的左側是原先的MMV，右側複製後的 MMV。兩者被檢測出的發生螢光的孔的圖案幾乎一致，可知含有大腸杆 菌的溶液的孔間轉移良好。另外，上述離心中， 一部分的大腸桿菌溶液殘 留在原先的MMV的孔內，其培養的結果被檢測出來。
上述實施例中，使用正常形成的1024孔的MMV，進行離心注入，使 其每一個孔中有概率地存在作為期望值的1細胞大腸桿菌，繼續進行37°C 下的培養，結果如圖10所示，增殖成功並可見能觀測到菌落的孔。這些 孔的分布為泊松分布。這顯示了通過離心法成功地將大腸桿菌同時注入， 或該MMV作為培養大腸桿菌的容器發揮了功能。這種情況下，由於大腸 桿菌內含螢光性的蛋白質(綠色螢光蛋白質GFP)，因此從側邊觀察可以 看見綠色光，從而表示了其螢光性。
進而，使用培養成功的MMV與同型號的1024孔MMV，頂對頂 (top-to-top)地進行重合，離心並同時轉移試樣(參照圖3)。這裡，向 試樣被移空的一方的MMV離心注入新鮮的培養基，進行培養，得到(幾 乎)同型的模式的複製品(參照圖ll)。這表示可以進行同時並行轉移。
另外，圖3中的溶液的轉移僅為1次，但如圖12所示也可以將多種溶 液進行逐次轉移，其結果是可以向孔內充填具有希望組成的溶液。進而這 時，通過使用上述濾膜，也可以進行調整，適當改變孔內的組成。
工業實用性
本發明可以在進化工程、製藥、食品、生物風險、臨床檢驗機構、化 合物質毒性檢驗機構等中，在使多種微量液體試樣反應時所必需的、同時 並行地進行試樣的分取的領域裡得到應用。
權利要求
1.一種向由在至少一個主表面上具有多個孔的基板構成的多孔板的孔內注入溶液的方法，其中，所述孔具有如下的尺寸、形狀和表面狀態，即當所述孔的開口處於向上的狀態，靜置多孔板時，即使所述孔的開口被所述溶液覆蓋，也不能將溶液注入到孔內，在所述多孔板的具有所述孔的主表面上放置溶液，施加從孔的開口朝向底部的離心力，將所述溶液注入到所述孔內。
2. 如權利要求1所述的方法，其中，所述離心力為10Xg以上。
3. 如權利要求l所述的方法，其中，所述孔的開口的最大內徑為5mm 以下。
4. 如權利要求3所述的方法，其中，所述離心力為20Xg以上。
5. 如權利要求1所述的方法，所述孔的開口的最大內徑為lmm以下。
6. 如權利要求5所述的方法，其中，所述離心力為100Xg以上。
7. 如權利要求1 6的任一項中所述的方法，其中，所述孔的內部容 量為10tU以下。
8. 如權利要求1 6的任一項中所述的方法，其中，所說孔的內部容 量為lul以下。
9. 如權利要求1 8的任一項中所述的方法，其中，所述多孔板具有 1000個以上的孔。
10. 如權利要求1 9的任一項中所述的方法，其中，在所述主表面上 放置具有多個開口的濾膜，進而在該濾膜上放置溶液，施加從孔的開口朝 向底部的離心力，將所述溶液通過所述濾膜的開口注入到所述孔內。
11. 如權利要求IO所述的方法，其中，將溶液通過上述濾膜注入到所 述多個孔的一部分孔內。
12. —種從由在至少一個主表面上具有多個孔的基板構成的多孔板 (2)的至少一部分孔，將該孔內容納的溶液的至少一部分轉移至由在至 少一個主表面上具有多個孔的基板構成的多孔板(1)的孔內的方法，其 中，所述多孔板(2)的孔具有如下的尺寸、形狀和表面狀態，S卩當所 述孔的開口處於向下的狀態，靜置多孔板(2)時，所述孔內的溶液不會 從孔中流出，將所述多孔板(1)和多孔板(2)固定起來使得兩塊板具有的至少一 部分孔彼此相對，施加從所述多孔板(1)的開口朝向底部的離心力，將 所述多孔板(2)的孔內的溶液注入到所述多孔板(1)的孔內。
13. 如權利要求12所述的方法，其中，所述多孔板(1)的孔具有如下的尺寸、形狀和表面狀態，即當所述孔的開口處於向上的狀態，靜置 多孔板(1)時，即使所述孔的開口被所述溶液覆蓋，也不能將溶液注入 到孔內。
14. 如權利要求12或13所述的方法，其中，將具有多個開口的濾膜 放置在所述多孔板(1)和多孔板(2)之間，施加從所述多孔板(1)的 開口朝向底部的離心力，通過所述濾膜的開口進行所述溶液的轉移。
15. 如權利要求14所述的方法，其中，將溶液通過所述濾膜轉移到所 述多個孔的一部分孔內。
16. 如權利要求12 15的任一項中所述的方法，其中，所述多孔板 (1)的孔和多孔板(2)的孔的開口尺寸和形狀、以及排列是相同的。
17. 如權利要求12 15的任一項中所述的方法，其中，所述多孔板 (1)的孔和多孔板(2)的孔的開口尺寸和形狀、容量以及排列的至少一部分是不同的。
18. 如權利要求12 17的任一項中所述的方法，其中，所述離心力為 100Xg以上。
全文摘要
本發明提供一種向由具有多個孔的基板構成的多孔板的孔內注入溶液的方法。上述孔具有如下的尺寸、形狀和表面狀態，即當孔的開口處於向上的狀態，靜置多孔板時，即使上述孔的開口被上述溶液覆蓋，也不能將溶液注入到孔內，在多孔板的具有孔的主表面上放置溶液，從孔的開口朝向底部方向施加離心力將上述溶液注入到上述孔內。本發明還提供一種從多孔板的孔向別的多孔板的孔轉移溶液的方法。即使對於超過1000的容器(孔)，且即使容器(孔)的尺寸、形狀和表面狀態不允許溶液向容器(孔)內的流入，也可以簡單地填充反應液等溶液。
文檔編號G01N35/10GK101375168SQ200680005428
公開日2009年2月25日 申請日期2006年2月17日 優先權日2005年2月18日
發明者內田秀和, 木下保則, 田山貴宏, 西垣功一 申請人:國立大學法人琦玉大學