一種兩罐法發酵生產蘇雲金芽胞桿菌的方法
2024-04-02 18:57:05
專利名稱：一種兩罐法發酵生產蘇雲金芽胞桿菌的方法
技術領域：
本發明專利涉及一種蘇雲金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)的發
酵方法，屬於輕工發酵領域。
背景技術：
Bt的生長分為適應期、對數生長期、平衡期和衰亡階段。芽胞、晶體的脫落產生在 平衡期中後期，最後從發酵液分離芽胞和晶體產品。從細胞經濟學角度看在發酵工業生產 上，分批發酵的前期是微生物增殖階段，應該從培養條件上保證菌種微生物的正常增殖，以 便為隨後目的產物生成提供足夠的細胞，稱前發酵，然後細胞轉入目的產物的生產階段，即 芽胞、晶體形成、脫落階段，稱後發酵。根據Bt的發酵特點，已有不少研究者研究在一個攪拌通風罐中，採用分段控制發 酵工藝，即前發酵階段採用高的通風量、30°C發酵，後發酵採用低的通風量、33°C發酵，與對 照恆溫、恆通風量發酵相比，發酵周期縮短，毒力增加，而且節能。國外有研究採用兩個連續發酵罐串聯，控制稀釋率，第一個罐用於前發酵產菌體 用，第二個罐用於產芽胞和晶體用。但由於連續培養野生型菌株具有更高的比生長速率，此 外單細胞分裂，有很大一部分野生菌株突變成不產芽胞的突變菌株，最後突變菌株代替了 野生菌株，而且有報導連續培養由於長時間的培養，自發產生不產芽胞的突變Bt菌株，因 此連續發酵比分批發酵更合適於研究菌體生長和芽胞的形成，而不適合生產應用。因此，在現實的Bt的生產中，通常生產方法仍然是在一個攪拌通風發酵罐中，採 用分段控制發酵的工藝進行生產。這種方法通風攪拌佔用時間長，浪費了大量的電能，同時 對菌體和後發酵芽胞、晶體造成剪切傷害，不利於殺蟲毒素的形成。本發明的內容本發明的目的是提供一種既有利於菌體、芽胞和晶體的形成，又可以節能，提高產 量的Bt發酵生產新方法。本發明的目的是以如下方式實現的；一種兩罐法發酵生產蘇雲金芽胞桿菌的方 法，根據Bt芽胞形成來確定發酵工段，從發酵罐接種開始到發酵液形成芽胞階段為前發 酵；芽胞開始形成到芽胞開始脫落階段為後發酵1，芽胞開始脫落到芽胞脫落50%階段為 後發酵2 ；前發酵在前發酵罐B內完成，前發酵罐B是一個攪拌通風的發酵罐，後發酵1、後 發酵2在後發酵罐C內完成，後發酵罐C是一個氣升式發酵罐；前發酵罐B中採用高的通風 量，即按培養基與無菌空氣體積1 1.5v/v/min的通風量、攪拌轉速250r/min、發酵溫度控 制在-30°C，發酵至芽胞剛開始形成時，轉入後發酵罐C，後發酵1採用較低的通風量， 即按培養基體積與無菌空氣體積1 lv/v/min的通風量、發酵溫度控制在33°C發酵；發酵 至芽胞剛開始脫落時，停止通風，進入後發酵2，後發酵2維持33°C靜置發酵至芽胞50%脫 落時，出料轉入後期處理階段。上述的兩罐法發酵生產Bt的方法中，在前發酵罐B的前端設有一個培養基連續滅 菌裝置A，即可實現半連續發酵。
採用上述的發明方法的兩罐法發酵工藝能產生非常的積極的效果，主要優勢如 下1、可以分段控制菌體生長和芽胞晶體蛋白的形成；通過控制通風量和後期發酵溫 度達到縮短發酵時間、提高毒力產量的目的。2、後發酵罐C相當於中轉罐，沒有攪拌裝置，比前發酵罐結構簡單、價格便宜；當 發酵進入後發酵，開始進入後發酵罐C，則前發酵罐B可以提前1/3-1/2的時間騰空或進入 下一個前發酵流程，同時可以省去1/3-1/2的通風攪拌發酵時間，節約大量通風攪拌能耗， 而且後發酵罐C沒有攪拌裝置，溫和的通風可以較少剪切力對菌體、芽胞和晶體形成的傷 害，有利毒素的形成。3、如果培養基採用連續滅菌設備A，設備A可以是薄板、管式、塔式等連續滅菌設 備，則可以實現「半連續發酵」，即前發酵罐B出料進入後發酵罐C，下一批物料通過連續滅 菌可直接進入前發酵罐B，待後發酵罐C出料後，下一批前發酵罐B的發酵液又可以進入後 發酵罐C，如此生產多批後視環境衛生情況，根據微生物檢測情況決定對前、後兩個發酵罐 空罐滅菌。這樣可以實現半連續多批次同時生產，減少了發酵罐空罐的清洗滅菌等輔助操 作時間，大大提高設備周轉率。4、兩罐法間歇發酵可以避免連續培養易染菌、菌種退化的問題。
下面結合附圖對本發明進一步說明圖1兩罐法生產Bt的工藝設備流程2發酵工藝流程圖A、培養基連續滅菌裝置B、前發酵罐C、後發酵罐；D、進料管接口 E、無菌空氣進管F、空氣出管G、出料口
具體實施例採用圖1的工藝設備、圖2的兩罐法發酵工藝培養，以8010為發酵菌株發酵生產 Bt。培養基配方玉米澱粉1 %，豆粕1. 3%，花生餅粉10Z0，玉米漿1 %，酵母粉0. 1 %， CaCO3O. 3%, KH2PO4 0. 2%, MgSO4 0. 07%, pH 7. 0-7. 5，121°C高壓滅菌 40min。經滅菌的培養基進入前發酵罐B，前發酵罐B中採用高的通風量，即按培養基與空 氣量1 1.5V/V/min通風量、發酵溫度控制在30°C，至芽胞剛開始形成時，轉入後發酵罐 C，後發酵罐C前期採用低的通風量，即按培養基與無菌空氣量1 lv/v/min通風量，溫度 控制在33°C發酵，發酵至芽胞剛開始脫落時，停止通風，維持33°C至芽胞50%以上脫落時， 出料轉入後期處理階段，即分離、乾燥和製劑生產。發酵液芽胞計數方法取發酵液85°C加熱處理5min，迅速冷卻，採用稀釋平板活 菌技術法計數；毒力測定方法發酵液經1000倍稀釋後對2-3齡小菜蛾生物測定。結果採用本發明方法的發酵時間為65h，終產品芽胞數75億/mL，芽胞形成率 90%以上；4 小菜蛾校正死亡率100%;如採用傳統的單罐法發酵，採用恆溫(30°C)、恆通 風量(1 1.5VV/min)、恆轉速O50r/min)控制發酵，則需要發酵時間為72h，終產品的芽胞數58億/mL、芽胞形成率80%左右，4 2_3齡小菜蛾校正死亡率86%。按每度電0.73 元，每罐1. 5t計算，可節省攪拌能耗300元以上，而且產品對小菜蛾殺蟲能力提高12. 5%。
權利要求
1.一種兩罐法發酵生產蘇雲金芽胞桿菌的方法，其特徵是根據Bt芽胞形成來確定發 酵工段，從發酵罐接種開始到發酵液形成芽胞階段為前發酵；芽胞開始形成到芽胞開始脫 落階段為後發酵1，芽胞開始脫落到芽胞脫落50%階段為後發酵2 ；前發酵階段在前發酵罐 B內完成，前發酵罐B是一個攪拌通風的發酵罐，後發酵1、後發酵2在後發酵罐C內完成， 後發酵罐C是一個氣升式發酵罐；前發酵罐B中採用高的通風量，即按培養基與無菌空氣體 積1 1.5V/V/min的通風量、攪拌轉速250r/min、發酵溫度控制在觀1-301，至芽胞剛開 始形成時，轉入後發酵罐C，後發酵1採用較低的通風量，即按培養基體積與無菌空氣體積 1 lv/v/min通風量、發酵溫度控制在33°C發酵；發酵至芽胞剛開始脫落時，停止通風，進 入後發酵2，後發酵2維持33°C靜置發酵至芽胞50%脫落時，出料轉入後期處理階段。
2.根據權利要求1所述的一種兩罐法發酵生產蘇雲金芽胞桿菌的方法，其特徵是前發 酵罐B的前端設有一個培養基連續滅菌裝置A，即可實現半連續發酵。
全文摘要
一種兩罐法發酵生產蘇雲金芽胞桿菌的方法，從進料接菌至芽胞剛開始形成在前發酵罐內完成，芽胞開始脫落到芽胞脫落50％為後發酵，在後發酵罐內完成；前發酵罐是一個攪拌通風的發酵罐，後發酵罐是一個氣升式發酵罐；前發酵罐中按培養基與無菌空氣體積1∶1.5v/v/min的通風量、攪拌轉速250r/min、發酵溫度28℃-30℃；至芽胞開始形成即轉入後發酵罐C，採用培養基與無菌空氣體積1∶1v/v/min通風量、發酵溫度33℃，發酵至芽胞剛脫落即停止通風，維持33℃靜置發酵至芽胞50％脫落時，發酵完成；產品毒力高，能耗低及生產效率高。
文檔編號C12R1/07GK102146349SQ20101062374
公開日2011年8月10日 申請日期2010年12月25日 優先權日2010年12月25日
發明者關雄, 吳麗雲 申請人:福建農林大學