一種檢測miRNAs‑21的方法、探針組及試劑盒與流程
2023-12-05 15:07:06 1
本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種檢測mirnas-21的方法、探針組及試劑盒。
背景技術：
micrornas(mirnas)是一類由18-24個鹼基組成的非編碼單鏈小分子rna，在轉錄後水平對基因表達發揮負調控作用，參與細胞生長、發育、凋亡等重要生物過程。最近的一些醫學研究表明，mirna的表達水平，或增大或減少，都在某種程度上與人類重大疾病如癌症等有著密不可分的聯繫。這使得mirna可以作為腫瘤標記物來早期地監控癌症的發生。
mirna-21的編碼基因定位於17q23.2，即液泡膜蛋白基因(vacuolemembraneprotein-1，vmp1)編碼區，vmp1基因的第十內含子。vmp1也被稱為跨膜蛋白49(transmembraneprotein-49,tmem-49)。mirna-21對多種癌症都有高表達，如：胰腺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌等等。因此mirna-21是一個公認的致癌性小rna，對mirna-21進行定量檢測可以有效的監控癌症的發生。
目前發展出了許多檢測mirna的方法，比如northern印跡技術、微陣列晶片(microarray)、實時反轉錄聚合酶鏈式反應、電化學方法、螢光分析、電化學發光、比色分析等等。但上述方法都具有一定的局限性，比如檢測靈敏度低、缺乏足夠的分析物、特異性不佳、需要耗費大量的時間和人力，而且經常需要昂貴和繁瑣的工具和熟練的專業人員，限制了其在臨床診斷方面的潛在應用。
螢光檢測方法，由於其靈敏度高、操作簡單，目前正在獲得越來越多的關注。然而，目前螢光傳感器具有一些特殊的局限性，包括探頭尺寸小，穩定性低，光漂白，與背景螢光光譜相重疊，低豐度和高序列相似性等等。因此開發一種能夠快速、高選擇性和高靈敏度地檢測mirna-21的方法具有重要意義。
技術實現要素：
有鑑於此，本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種檢測mirnas-21的方法、探針組及試劑盒。本發明所述檢測mirnas-21的方法能夠快速、高選擇性和高靈敏度地檢測待測樣品中的mirnas-21含量。
為實現本發明的目的，本發明採用如下技術方案：
一種檢測mirnas-21的方法，將金納米棒修飾的聚二乙炔微米管與h1探針、h2探針和待測樣品混合，檢測金納米棒修飾的聚二乙炔微米管端頭光波導螢光亮度的變化；
其中所述金納米棒和聚二乙炔微米管分別經單鏈dna修飾，且修飾金納米棒的單鏈dna與修飾聚二乙炔微米管的單鏈dna鹼基互補；h1探針與h2探針均為髮夾探針，在mirnas-21存在下可自組裝形成雙鏈結構，然後通過toehold與修飾金納米棒的單鏈dna發生鏈置換反應。
作為優選，所述修飾金納米棒的單鏈dna的序列如seqidno：1所示；所述修飾聚二乙炔微米管的單鏈dna的序列如seqidno：2所示。
作為優選，所述h1探針的序列如seqidno：3所示；所述h2探針的序列如seqidno：4所示。
作為優選，所述金納米棒修飾的聚二乙炔微米管固定在疏水片上。
作為優選，所述待測樣品為血清。
本發明還提供了一種檢測mirnas-21的探針組，包括h1探針與h2探針，h1探針與h2探針均為髮夾探針，在mirnas-21存在下可自組裝形成雙鏈結構，然後通過toehold與修飾金納米棒的單鏈dna發生鏈置換反應。
作為優選，所述h1探針的序列如seqidno：3所示；所述h2探針的序列如seqidno：4所示。
本發明還提供了一種檢測mirnas-21的試劑盒，其特徵在於，包括上述探針組。
作為優選，所述的試劑盒還包括金納米棒修飾的聚二乙炔微米管，所述金納米棒和聚二乙炔微米管分別經單鏈dna修飾，且修飾金納米棒的單鏈dna與修飾聚二乙炔微米管的單鏈dna鹼基互補。
作為優選，所述金納米棒修飾的聚二乙炔微米管固定在疏水片上。
作為優選，所述修飾金納米棒的單鏈dna的序列如seqidno：1所示；所述修飾聚二乙炔微米管的單鏈dna的序列如seqidno：2所示。
本發明還提供了所述探針組、所述試劑盒在製備癌症診斷產品中的應用。
由上述技術方案可知，本發明提供了一種檢測mirnas-21的方法、探針組及試劑盒。本發明所述檢測mirnas-21的方法，將金納米棒修飾的聚二乙炔微米管與h1探針、h2探針和待測樣品混合，檢測金納米棒修飾的聚二乙炔微米管端頭光波導螢光亮度的變化；其中所述金納米棒和聚二乙炔微米管分別經單鏈dna修飾，且修飾金納米棒的單鏈dna與修飾聚二乙炔微米管的單鏈dna鹼基互補；h1探針與h2探針均為髮夾探針，在mirnas-21存在下可自組裝形成雙鏈結構，然後通過toehold與修飾金納米棒的單鏈dna發生鏈置換反應。本發明所述檢測mirnas-21的方法中修飾金納米棒的單鏈dna與修飾聚二乙炔微米管的單鏈dna通過雜交配對形成金納米棒修飾的聚二乙炔微米管，同時使聚二乙炔微米管端頭光波導螢光淬滅，將金納米棒修飾的聚二乙炔微米管與h1探針、h2探針和待測樣品混合後，待測樣品中的目標分子mirna-21可催化髮夾探針自組裝，形成雙鏈結構，通過toehold與修飾金納米棒的單鏈dna進行單鏈取代，金納米棒與聚二乙炔微米管脫離，從而使聚二乙炔微米管端頭光波導螢光從淬滅轉而恢復，根據螢光變化強度可檢測待測樣品中的mirnas-21的含量。實驗表明本發明所述檢測方法，對mirna-21顯示了高的靈敏性和選擇性，檢測過程簡便、靈敏、快速，檢測結果準確。
附圖說明
為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
圖1示聚二乙炔微米管端頭光波導螢光恢復的具體反應原理示意圖；
圖2示實施例1單鏈dna修飾微米管的反應過程的示意圖(a)及修飾的微米管紅外光譜(b)和拉曼光譜圖(c)；其中圖(b)中i代表聚二乙炔微米管的紅外光譜圖，ii代表聚二乙炔微米管和烯丙基縮水甘油醚反應後得到雙鍵修飾的聚二乙炔微米管的紅外光譜圖，1130cm-1代表c-o-c鍵的伸縮振動，923cm-1代表c＝ch鍵的伸縮振動；圖(c)中i代表雙鍵修飾的聚二乙炔微米管的拉曼光譜圖，ii代表單鏈dna修飾的聚二乙炔微米管拉曼光譜圖，多出來的峰為dna的特徵峰；
圖3示實施例3單鏈dna修飾的金納米棒與單鏈dna修飾的聚二乙炔微米管雜交的反應過程的示意圖(a)及得到的金納米棒修飾的聚二乙炔微米管的xps光譜圖(b)和的光波導螢光變化(c)；其中圖(b)中i代表單鏈dna修飾的聚二乙炔微米管的xps光譜圖，ii代表單鏈dna修飾的金納米棒與單鏈dna修飾的聚二乙炔微米管雜交後的xps光譜圖，雜交後微米管表面有金元素，表明雜交成功；圖(c)單鏈dna修飾的金納米棒與單鏈dna修飾的聚二乙炔微米管雜交後，微米管端頭螢光光譜變化圖，隨著單鏈dna修飾的金納米棒濃度不斷提高，微米管端頭螢光強度不斷降低；
圖4示實施例4金納米棒修飾的聚二乙炔微米管在疏水片上反應的濃縮富集效應示意圖(a)，金納米棒修飾的聚二乙炔微米管檢測mirna-21的示意圖(b)及不同濃度mirna-21反應後的金納米棒修飾的聚二乙炔微米管光波導螢光變化(c)；其中圖(a)中在疏水片上進行反應，根據濃縮富集效應，反應物集中於微米管表面發生反應；圖(b)中在金納米棒-微米管體系中，由532nm光激發後，微米管端頭螢光微弱，當加入檢測的mirna-21後，微米管端頭螢光亮度增強；圖(c)在金納米棒-微米管體系中，加入不同濃度的mirna-21溶液，濃度由10fm到50pm，微米管端頭螢光逐漸恢復，並且從10fm到100fm的濃度範圍內，微米管端頭螢光變化和mirna-21的濃度成比例關係；
圖5示實施例5金納米棒修飾的聚二乙炔微米管檢測不同濃度的mirna-21光波導螢光變化圖(a)及檢測極限圖(b)；在金納米棒-微米管體系中，加入不同濃度的mirna-21溶液，濃度由10fm到50pm，微米管端頭螢光逐漸恢復，並且從10fm到100fm的濃度範圍內，微米管端頭螢光變化和mirna-21的濃度成比例關係；
圖6示實施例6金納米棒修飾的聚二乙炔微米管檢測不同濃度mirna-21、單鹼基錯配mirna-21、三鹼基錯配mirna-21、mirna-144、mirna-199a的光波導螢光變化圖；
圖7示實施例7金納米棒修飾的聚二乙炔微米管檢測健康人的血清、胰腺癌病人的血清、乳腺癌病人的血清、胃癌病人的血清的光波導螢光變化變化圖。
具體實施方式
本發明公開了一種檢測mirnas-21的方法、探針組及試劑盒。本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及產品已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
本發明所述檢測mirnas-21的方法中修飾金納米棒的單鏈dna與修飾聚二乙炔微米管的單鏈dna通過雜交配對形成金納米棒修飾的聚二乙炔微米管，同時使聚二乙炔微米管端頭光波導螢光淬滅；將金納米棒修飾的聚二乙炔微米管與h1探針、h2探針和待測樣品混合後，待測樣品中的目標分子mirna-21可催化髮夾探針自組裝，形成雙鏈結構，通過toehold與修飾金納米棒的單鏈dna進行單鏈取代，金納米棒與聚二乙炔微米管脫離，從而使聚二乙炔微米管端頭光波導螢光從淬滅轉而恢復。根據螢光變化強度可檢測待測樣品中的mirnas-21的含量。
聚二乙炔微米管端頭光波導螢光恢復的具體反應原理如圖1所示。mirna-21通過紅色toehold端把h1探針髮夾結構打開，並和h1探針雜交形成h1-mir-21。h2探針通過藍色toehold端把h1-mir-21中的mirna-21替換下來，h1和h2雜交形成h1-h2。在這一過程中，mirna-21可看做催化劑，使反應循環發生，同時mirna-21不消耗，從而提高微米管傳感器檢測target的靈敏度，降低反應極限。
本發明所述聚二乙炔微米管採用聚二乙炔化合物材料，能將檢測與顯示集為一體，是一種非常理想的傳感器材料。本發明通過組裝方法製備一維聚二乙炔微米管，構築高靈敏度、高選擇性的新型生物傳感器用於複雜生物環境中的mirna的檢測。
本發明用於製備聚二乙炔微米管的氨基雙炔單體的方法如下：二乙炔分子與1.2倍當量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)及1.2倍當量的n-羥基琥珀醯亞胺(nhs)溶解於30ml精製的二氯甲烷中，25℃條件下磁子攪拌反應6小時，得到的產物經過旋蒸、萃取，再加入1.1倍當量的乙二胺液體溶於二氯甲烷溶劑中，30℃下磁子攪拌反應1小時，最後經過萃取、旋蒸，得到氨基雙炔單體。
本發明所述聚二乙炔微米管的製備方法具體為：取0.0056g氨基雙炔與0.00075g十八胺取代的三聚氰胺溶於2ml的無水乙醇溶液中，將溶液倒入到75℃的300ml超純水中，超聲60min後置於黑暗處自然冷卻至室溫，再放入4℃的冰箱中過夜，即可得到複合囊泡。在稱量瓶分別加入10ml囊泡溶液與10μl的硝酸鉛溶液，在室溫下敞開放置於通風處，兩至三周後出現白色絲狀物質的析出，即得到聚二乙炔微米管。
在一些實施方案中，本發明所述單鏈dna修飾的聚二乙炔微米管的製備方法具體為：聚二乙炔微米管從稱量瓶中取出，置於254nm的紫外燈管下，照射10分鐘，使雙炔聚合變成藍相。藍相的雙炔置於80℃加熱10分鐘，使其變為紅相。取20μl烯丙基縮水甘油醚稀釋至10ml，加入微米管，30℃下反應過夜，得到雙鍵修飾的微米管。將單根微米管與200μl的巰基修飾的單鏈dna及2959光引發劑(n(2959):n(dna)＝1:100)混合均勻，在365nm光照下反應6小時，得到單鏈dna修飾的微米管。
進一步的，在一些實施方案中，本發明所述單鏈dna修飾的金納米棒的製備方法具體為：通過種子生長法製備出金納米棒，與巰基修飾的單鏈dna進行孵育，得到單鏈dna修飾的金納米棒。
在一些實施方案中，所述修飾金納米棒的單鏈dna的序列如seqidno：1所示；所述修飾聚二乙炔微米管的單鏈dna的序列如seqidno：2所示。
在一些實施方案中，所述h1探針的序列如seqidno：3所示；所述h2探針的序列如seqidno：4所示。
在一些實施方案中，所述金納米棒修飾的聚二乙炔微米管固定在疏水片上。疏水片具有濃縮富集效應，可使h1探針、h2探針和待測樣品混合的液滴聚集在金納米棒修飾的聚二乙炔微米管表面，提高反應靈敏度，降低反應極限。
按照本發明，本領域技術人員可以理解本發明所述待測樣品包括但不限於血清。
本發明還提供了一種檢測mirnas-21的探針組，包括h1探針與h2探針，h1探針與h2探針均為髮夾探針，在mirnas-21存在下可自組裝形成雙鏈結構，然後通過toehold與修飾金納米棒的單鏈dna發生鏈置換反應。
在一些實施方案中，所述h1探針的序列如seqidno：3所示；所述h2探針的序列如seqidno：4所示。
本發明還提供了一種檢測mirnas-21的試劑盒，包括上述探針組。
在一些實施方案中，所述的試劑盒還包括金納米棒修飾的聚二乙炔微米管，所述金納米棒和聚二乙炔微米管分別經單鏈dna修飾，且修飾金納米棒的單鏈dna與修飾聚二乙炔微米管的單鏈dna鹼基互補。
在一些實施方案中，所述修飾金納米棒的單鏈dna的序列如seqidno：1所示；所述修飾聚二乙炔微米管的單鏈dna的序列如seqidno：2所示。
在某一實施方案中，本發明分別向不同的單根聚二乙炔微米管上滴加mirna-21、單鹼基錯配mirna-21、三鹼基錯配mirna-21、mirna-144、mirna-199a，然後加入h1探針、h2探針，結果顯示只有加入mirna-21時聚二乙炔微米管端頭光波導螢光變化強烈，表明聚二乙炔微米管檢測mirna-21具有良好的選擇性。
在某一實施方案中，本發明向單根微米管上滴加h1探針、h2探針及健康人的血清、胰腺癌病人的血清、乳腺癌病人的血清或胃癌病人的血清，結果顯示，患有癌症的病人血清，其mirna-21信號表達明顯高於健康人血清。
因此本發明還提供了所述探針組、所述試劑盒在製備癌症診斷產品中的應用。
與現有技術相比，本發明至少具有如下優點和效果之一：對mirna-21的檢測顯示了高的靈敏性和選擇性，檢測過程簡便、靈敏、快速，檢測結果準確，檢測手段簡單。
為了進一步理解本發明，下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
如無特殊說明，本發明實施例中所涉及的試劑均為市售產品，均可以通過商業渠道購買獲得。
實施例1：單鏈dna修飾的微米管的製備
取20μl烯丙基縮水甘油醚稀釋至10ml，加入聚二乙炔微米管，30℃下反應過夜，得到雙鍵修飾的聚二乙炔微米管。將單根聚二乙炔微米管與200μl的5』端巰基修飾的單鏈dna(ssdna1序列如seqidno：1所示)、2959光引發劑(n(2959):n(ssdna1)＝1:100)混合均勻，在365nm光照下反應6小時，得到單鏈dna修飾的聚二乙炔微米管。其中單鏈dna修飾的聚二乙炔微米管的微米管紅外光譜見圖2b，單鏈dna修飾的聚二乙炔微米管拉曼光譜見圖2c。
實施例2：單鏈dna修飾金納米棒
通過種子生長法製備出金納米棒，純化後與5』端巰基修飾的單鏈dna(ssdna2序列如seqidno：2所示)進行孵育(金納米棒與dna的摩爾比為1:25600)，得到單鏈dna修飾的金納米棒。具體操作為：首先向7.5ml的0.1m的十六烷基三甲基溴化銨(ctab)溶液中加入250μl的0.01m的氯金酸，並攪拌均勻。然後加入600μl的0.01m的硼氫化鈉溶液(硼氫化鈉提前在-20℃下放置10分鐘)，之後在機械攪拌下(轉速400rpm)攪拌2分鐘。2分鐘後會形成淺棕色的溶液，即為金種子溶液。金種子溶液需在室溫下放置1小時後使用。生長溶液的製備:機械攪拌條件下(攪拌速度為250rpm)，將9.5ml的0.1m的十六烷基三甲基溴化銨，400μl的0.01m的氯金酸混合，攪拌均勻，加入60μl0.01m的硝酸銀，然後將64μl的0.1m的抗壞血酸加入上述溶液中，觀察到此時溶液的顏色由亮黃色變為無色透明，說明弱還原劑抗壞血酸將au3+還原成au+。最後把20μl的金種子加入上述溶液中，攪拌1分鐘後停止攪拌，靜置一夜即可得到金納米棒。整個實驗過程要求避光，溫度為25℃。。將製得的金納米棒在13000rcf下離心30分鐘，移除上清液，沉澱溶解在10mmpbs中(ph＝8.0，包含0.3％(w/v)十二烷基硫酸鈉)。將此過程重複三次，最後得到10ml純化的金納米棒，懸浮在上述緩衝溶液中。然後加入10ml聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液(10％w/v)，在40℃下攪拌18小時。反應完成之後離心，移除上清液，重新分散在含有0.3％十二烷基硫酸鈉的pbs中，。這個過程重複三次。之後測試紫外吸收光譜，根據朗伯比爾定律a＝kbc，算出金納米棒的濃度。得到金納米棒的具體濃度後，加入巰基修飾的dna。所加入的dna提前用三(2-羧乙基)膦處理2小時，使得被氧化了的巰基被還原。然後按照dna與金納米棒摩爾比為25600：1加入dna，超聲5秒後，室溫下放置16小時。反應完成後加鹽熟化以減弱金納米棒與dna之間的靜電相互作用，使更多的dna與金納米棒反應。鹽溶液為10mmpb(ph＝8.0)、300mm氯化鈉、4mm氯化鎂、0.3％十二烷基硫酸鈉的混合溶液。每隔半小時加一次，使得最終鹽濃度為150mm氯化鈉，2mm氯化鎂。。室溫下放置16小時後，在9300rcf離心3次，每次30分鐘。這個過程重複3次。最終將製備好的單鏈dna修飾金納米棒懸浮於緩衝液中，置於4℃冰箱保存。
實施例3：金納米棒修飾的聚二乙炔微米管
將單鏈dna修飾的金納米棒與單鏈dna修飾的聚二乙炔微米管雜交，得到金納米棒修飾的聚二乙炔微米管。具體操作為：用針管挑出單根的聚二乙炔微米管於小試管中，浸沒於200μl單鏈dna修飾的金納米棒溶液中，置於90℃水浴環境中5分鐘。之後將小試管移出水浴鍋緩慢降溫至室溫，降溫時間約為1h-2h。反應完成後，用針管從金納米棒溶液中挑出聚二乙炔微米管，用超純水輕輕地衝洗微米管數次，除去未吸附的金納米棒。
對得到金納米棒修飾的聚二乙炔微米管進行光波導螢光變化的檢測，結果見圖3c。xps光譜檢測結果見圖3b。結果顯示雜交後微米管表面有金元素，表明雜交成功，獲得金納米棒修飾的聚二乙炔微米管。
實施例4：檢測mirna
將實施例3得到的金納米棒修飾的聚二乙炔微米管置於疏水片上，滴加10μl包含h1(300nm，序列如seqidno：3所示)探針、h2(1000nm，序列如seqidno：4所示)探針、mirna-21(序列如seqidno：5所示)的溶液，室溫下放置2h，超純水清洗後進行光波導螢光變化的檢測，結果見圖4。結果顯示在疏水片上進行反應，根據濃縮富集效應，反應物集中於微米管表面發生反應。在金納米棒-微米管體系，由532nm光激發後，微米管端頭螢光微弱，當加入檢測的mirna-21後，微米管端頭螢光亮度增強。隨著加入的mirna-21濃度的逐漸增強，微米管端頭螢光逐漸恢復。實施例5：靈敏度檢測
將實施例3得到的金納米棒修飾的聚二乙炔微米管至於疏水片上，滴加10μl包含h1(300nm)探針、h2(1000nm)探針、mirna-21的溶液。其中mirna-21的濃度由10fm增加到50pm，觀察金納米棒修飾的聚二乙炔微米管端頭光波導螢光亮度的變化結果見圖5a。以mirna-21濃度為橫坐標，以金納米棒修飾的聚二乙炔微米管光波導螢光亮度變化為縱坐標，計算檢測極限，結果見圖5b。
結果顯示，在金納米棒-微米管體系中，加入不同濃度的mirna-21溶液，濃度由10fm到50pm，微米管端頭螢光逐漸恢復，並且從10fm到100fm的濃度範圍內，微米管端頭螢光變化和mirna-21的濃度成比例關係。
實施例6：專一性檢測
分別向不同的實施例3得到的金納米棒修飾的單根聚二乙炔微米管上滴加10μlmirna-21、單鹼基錯配mirna-21(序列如seqidno：6所示)、三鹼基錯配mirna-21(序列如seqidno：7所示)、mirna-144(序列如seqidno：8所示)、mirna-199a(序列如seqidno：9所示)，然後分別加入h1(300nm)探針、h2(1000nm)探針，室溫下放置2h，超純水清洗後進行光波導螢光變化的檢測，觀察金納米棒修飾的聚二乙炔微米管對mirna-21的專一性，結果見圖6。
結果顯示，在四個濃度下，金納米棒修飾的聚二乙炔微米管分別與單鹼基錯配的mirna-21，三鹼基錯配的mirna-21，mirna-144，mirna-199a反應後，金納米棒修飾的聚二乙炔微米管的螢光無法恢復。當加入mirna-21時，發現金納米棒修飾的聚二乙炔微米管的螢光恢復。表明本發明所述檢測方法對於mirna-21有較好的檢測專一性。
實施例7：血清檢測
分別向不同的實施例3得到的金納米棒修飾的單根聚二乙炔微米管上滴加含有健康人的血清、胰腺癌病人的血清、乳腺癌病人的血清、胃癌病人的血清，然後分別加入h1(300nm)探針、h2(1000nm)探針，室溫下放置2h，超純水清洗後進行光波導螢光變化的檢測，結果見圖7。
結果顯示，患有三種癌症的病人血清，其信號表達明顯高於健康人血清。
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中國科學技術大學
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