通過對懸浮的動物細胞進行灌流式培養來生產生物物質的方法
2023-12-09 04:22:51 3
專利名稱：通過對懸浮的動物細胞進行灌流式培養來生產生物物質的方法
技術領域：
本發明涉及一種生產生物物質的方法，所述方法通過在不含血清的細胞培養基中對懸浮的動物細胞進行灌流式培養來進行，其中，通過過濾從細胞中分離出生物物質。
本領域中已知有類似的方法，例如Tokashiki et al.1993.Cytotechnology，vol.13149-159所著的關於灌流式培養的綜述。在通過過濾從細胞中分離出生物物質的灌流式培養中，優選的過濾是這樣的1)細胞被過濾器保留，同時2)包含生物物質的液體通過過濾器。對過濾器開展這兩項任務的效果的量度標準是細胞培養物中平均的細胞總濃度和通過過濾器的總體積的乘積(過濾器性能)。過濾器性能與生物物質的產量是成比例的。
但是，通過過濾從細胞中分離出生物物質的灌流式培養的不好之處在於，該過程中會發生過濾器堵塞。過濾器堵塞限制了能通過過濾器的體積總量，因而限制了過濾器性能，也就還限制了生物物質的產量。
本發明的目的是提供一種生產生物物質的方法，所述方法通過在不含血清的細胞培養基中對懸浮的動物細胞進行灌流式培養來進行，其中，通過過濾從細胞中分離出生物物質，其中過濾器堵塞減少(即，過濾器性能提高)。
該目的是通過本發明達成的，通過在細胞培養基中存在至少為0.001w/w％的一定量的非離子表面活性劑來實現。
非離子表面活性劑在用於哺乳動物細胞的不含血清的細胞培養基的用途可從US 5,372,943中已知，但是，在US 5,372,943中，該用途用於在細胞培養基中提供以生物可利用形式存在的必要脂類。本申請人吃驚地發現，在用於哺乳動物細胞的不含血清的培養基中使用非離子表面活性劑還會減少過濾器堵塞。
原則上，用於不含血清的培養基中的非離子表面活性劑的量的上限並不是關鍵的。但是，其可以例如被非離子表面活性劑的毒性水平和/或溶解性所限制。上限進一步地可取決於方法中所用的條件，本領域的技術人員可以很容易地確定該上限。通常，細胞培養基中存在的非離子表面活性劑的量的上限是1w/w％。
在本發明的方法中，非離子表面活性劑優選是脂肪酸酯，例如脂肪酸的甘油酯或雙甘油酯，或如結構式1所示的聚氧化烯山梨聚糖脂肪酸酯(polyoxyalkylene sorbitan fatty acid ester)， 其中，R1、R2、R3和R4每個都獨立代表H或脂肪酸殘基，即脂肪酸和醇縮合後的殘留部分，前提條件是R1至R4中的至少一個是脂肪酸殘基，其中A代表乙烯或丙烯基團，n、o、p和q每個都獨立代表0至100之間的值，其中優選地，n、o、p和q的總和為50至300之間。
優選地，脂肪酸殘基含有10-20個C原子。脂肪酸的例子包括癸酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、塔羅油酸等。
結構式1的商業可獲得的化合物的例子包括TweenTM化合物，例如TweenTM-80、TweenTM-21、TweenTM-40、TweenTM-60、TweenTM-20、TweenTM-61、TweenTM-65、TweenTM-81、TweenTM-85。當然，在本發明的方法中使用不同非離子表面活性劑的組合也是可能的。
在本發明的方法中，脂肪酸酯是特別有利的，因為這些酯的少量存在對生物物質的醫藥用途不會有阻礙。
優選地，細胞培養基中非離子表面活性劑的量為至少0.005w/w％，更優選地，至少0.01w/w％，最優選地，至少0.02w/w％。
可用於本發明方法中的動物細胞是，例如哺乳動物細胞，例如CHO(Chinese Hamster Ovary，中國倉鼠卵巢)細胞、雜交瘤、BHK(BabyHamster Kidney，幼倉鼠腎)細胞、骨髓瘤細胞和人類細胞，例如HEK-293細胞和人淋巴母細胞。
原則上，所有適合保留細胞的過濾器都可以用來進行過濾。此類過濾器的例子是靜止過濾器(static filter)，例如中空纖維過濾器或切向流過濾器或旋轉式過濾器，例如旋轉過濾器。優選地，如果生物物質是生物藥物產品，則使用內部過濾器，因為使用外部過濾器需要額外的認證，以使對生物藥物產品的生產過程合乎GMP(優良生產操作)標準。合適的內部過濾器的例子是內部旋轉過濾器。
最合適的過濾器孔逕取決於要被保留下來的細胞的細胞直徑，其可被本領域的技術人員很容易地確定。優選地，孔徑被選擇為篩網上的孔的大小接近於懸浮的細胞的直徑，確保細胞的高保留率而細胞殘骸能通過過濾器。優選地，孔徑在500×3000-50×300之間。
本發明原則上可用於適合培養動物細胞的任何類型的細胞培養基。選擇細胞培養基和細胞培養條件的原則都是公知的，例如Freshney，R.I.Culture of animal cells(a manual of basic techniques)，4th edition 2000，Wiley-Liss的第8和9章以及Doyle，A.，Griffiths，J.B.，Newell，D.G.CellTissuecultureLaboratory Procedures 1993，John WileySons中所提供的。
對生物藥物產品進行生產時，不含血清的培養基相對含有血清源的培養基是優選的，因為血清源的培養基通常是被病毒汙染的，存在朊病毒感染的風險，可能對生物藥物產品的下遊加工(即，從細胞培養基中純化出生物藥物產品來)造成大的阻礙。因為來自哺乳動物源的化合物也存在感染風險，優選地，細胞培養基不僅僅不含血清，還不含哺乳動物源。更優選地，細胞培養基不僅不含哺乳動物源，而且還不含動物源。
細胞培養基的pH、溫度、溶解氧濃度和滲量(osmolarity)原則上並不是很關鍵的，其取決於所選用的細胞的種類。優選地，pH、溫度、溶解氧濃度和滲量被選為最適於細胞生長和繁殖的。本領域的技術人員知道怎麼樣找到用於灌流式培養的最佳pH、溫度、溶解氧濃度和滲量。通常，最佳pH在6.6至7.6之間，最佳溫度在30至39℃之間，最佳滲量在260至400mOsm之間，細胞培養基中的溶解氧濃度在5至95％空氣飽和度之間。
適於通過灌流式培養由動物細胞生產的生物物質原則上是所有可由動物細胞生產的生物物質，例如，治療和診斷用的蛋白質，例如單克隆抗體、生長因子和酶，DNA，例如可在基因療法中使用的，疫苗，激素等。優選地，根據本發明的方法用於生產生物藥物產品，其是具有醫藥用途的生物物質。生物藥物產品的例子是以下這些(括號內是相關生物藥物產品的示例性商標名稱)替特普酶Tenecteplase(TN KaseTM)、(重組)抗血友病因子(ReFactoTM)、淋巴母細胞幹擾素α-n1(WellferonTM)、(重組)凝血因子(NovoSevenTM)、依那西普Etanercept(EnbrelTM)、曲妥珠單抗Trastuzumab(HerceptinTM)、英利昔單抗Infliximab(RemicadeTM)、巴利昔單抗Basiliximab(SimulectTM)、達昔單抗Daclizumab(ZenapaTM)、(重組)凝血因子IX(BenefixTM)、促紅細胞生成素alpha(Epogen)、G-CSF(NeupogenFilgrastim)、幹擾素alpha-2b(Infergen)、重組胰島素(Humulin)、幹擾素beta 1a(Avonex)、因子VIII(KoGENate)、葡糖腦苷脂酶(CerezymeTM)、幹擾素beta 1b(Betaseron)、TNF alpha受體(Enbrel)、卵泡刺激素(Gonal-F)、阿昔單抗Mab abcixmab(Synagis，ReoPro)、Mab ritiximab(Rituxan)、組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(Activase，Actilyase)、人生長激素(Protropin，Norditropin，GenoTropinTM)。可能具有醫藥應用的DNA的例子是基因治療用的質粒DNA。目前正在臨床試驗中對一些基因治療用的DNA的醫藥應用進行試驗。疫苗的例子是活的、口服的、四價輪狀病毒疫苗(RotaShieldTM)、狂犬病疫苗(RanAvertTM)、肝炎B疫苗(RECOMBIVAX HB，Engerix)和滅活肝炎A疫苗(VAQTATM)。
在所謂的下遊加工中，可對通過過濾器的生物物質進行進一步的純化。下遊加工通常包含若干純化步驟，其組合方式和順序可以多種多樣。下遊加工中純化步驟的例子是分離步驟(例如，通過親和色譜和/或離子交換色譜)、生物物質的濃縮步驟(例如，通過超濾或滲濾(diafiltration))、交換緩衝液的步驟和/或去除或滅活病毒的步驟(例如，通過過濾滅病毒、改變pH或溶劑的去垢劑處理)。
下述實施例用於對本發明進行闡述，但並非加以限制。
實施例1PFU-83雜交瘤細胞是大鼠/小鼠異源雜交瘤細胞，其產生對抗促腎上腺皮質激素釋放因子的大鼠IgG(J.W.A.M.van Oers et al.1989，Endocrinology，124，pp1239-1246)。PFU-83雜交瘤細胞於37℃下被培養於最少限度的不含哺乳動物源的培養基中。所用的最少限度的不含哺乳動物源的培養基是3∶1 DMEM/Ham’s F12培養基，其中含有抗壞血酸(5mg/l)、重組人胰島素(5mg/l)、穀胱甘肽(1mg/l)、PluronicTMF68(500mg/l)、以Na2SeO3形式存在的硒(15μg/l)、碳酸氫鈉(3g/l)、乙醇胺(7μg/l)，添加有穀氨醯胺(glutamin)(終濃度為584.5mg/l)、丙酮酸鈉(終濃度為110mg/l)和轉鐵蛋白(5mg/l)，滲量為320mOsm。pH被調為7.0，溶解氧濃度被設為30％空氣飽和度。在7l的Applikon發酵罐中對培養物進行處理，工作體積設為4l，其中使用孔徑為325×2300的旋轉過濾器，存在有不同濃度的Tween-80(0、15mg/l和50mg/l；相應於大約0、0.015和0.050w/w％)。存活細胞濃度在4至5日後達到大約5×106。
所有不同的批次細胞保留率都為100％。觀察達到過濾器被完全堵塞的時間(當旋轉過濾器被注滿淹沒時的時間點)，計算旋轉過濾器性能。旋轉過濾器性能被定義為通過旋轉過濾器的總體積和發酵罐中平均的細胞總濃度的乘積。用Fuchs-Rosenthal血球計數器和用於對死細胞進行染色的臺盼藍(trypan-blue)拒染法，在光學顯微鏡下計算發酵罐運行期間取得的細胞培養物樣品中存活和死亡細胞的總數，由此確定發酵罐中的細胞濃度。本實驗的結果顯示於下表1中。從表1可見，加入Tween-80後，達到堵塞的時間，以及旋轉過濾器性能都增加了。
表權利要求
1.一種生產生物物質的方法，所述方法通過在不含血清的細胞培養基中對懸浮的動物細胞進行灌流式培養來進行，其中，通過過濾從細胞中分離所述的生物物質，所述方法的特徵在於，所述細胞培養基中存在有至少0.001w/w％的如結構式1所示的聚氧化烯山梨聚糖脂肪酸酯， 其中，R1、R2、R3和R4每個都獨立代表H或脂肪酸殘基，即脂肪酸和醇縮合後的殘留部分，前提條件是R1至R4中的至少一個是脂肪酸殘基，其中A代表乙烯或丙烯基團，n、o、p和q每個都獨立代表0至100之間的值。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，結構式1中，n、o、p和q的總和在50至300之間。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，細胞培養基中存在至少0.01w/w％的如結構式1所示的化合物。
4.如權利要求1-3中任意一項所述的方法，其特徵在於，所述動物細胞是哺乳動物細胞。
5.如權利要求1-4中任意一項所述的方法，其特徵在於，所述如結構式1所述的化合物是TweenTM化合物。
6.如權利要求1-5中任意一項所述的方法，其特徵在於，所述的過濾是用內部過濾器來進行的。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述內部過濾器是旋轉過濾器。
8.如權利要求1-7中任意一項所述的方法，其特徵在於，所述生物物質是生物藥物產品。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述不含血清的細胞培養基也是不含哺乳動物源的。
10.如權利要求1-9中任意一項所述的方法，其特徵在於，所述生物物質通過下遊加工被進一步純化。
全文摘要
本發明涉及一種生產生物物質的方法，所述方法通過在不含血清的細胞培養基中對懸浮的動物細胞進行灌流式培養來進行，其中，通過過濾從細胞中分離出生物物質，所述方法的特徵在於，細胞培養基中存在有至少0.001w/w％的非離子表面活性劑。已發現，非離子表面活性劑存在於細胞培養基中能改善過濾性能。
文檔編號C12M3/00GK1780905SQ200480011791
公開日2006年5月31日 申請日期2004年5月3日 優先權日2003年5月1日
發明者蘭納德斯·阿杜爾夫斯·保羅範德爾 申請人:帝斯曼智慧財產權資產管理有限公司