基於微粒子的化學發光檢測試劑盒的製作方法
2023-12-06 08:08:41 1
專利名稱：基於微粒子的化學發光檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及化學發光檢測試劑盒，尤其是基於微粒子的化學發光檢測試劑 盒，屬於生物醫學檢測領域。
背景技術：
化學發光檢測試劑盒是利用兩種檢測物(抗體、抗原或其它對特定待測物 有親和作用的分子)來測定樣本中的某種物質。其中一種檢測物包被在固體表 面(以下簡稱固相)，另一種檢測物標記酶或化學發光物質(以下簡稱標記物)。 反應過程中，待測物與標記物結合到固相上。洗滌去除過量的游離標記物，加 入發光液，通過反應將化學能轉化成光能而發光。測定發光強度，就可以計算 出待測物濃度。
目前市場上主流的化學發光檢測試劑盒普遍為化學發光酶免疫檢測試劑
盒，包括抗體或抗原或Protein A包被的載體，標記抗體，待測物的標準品、 由緩衝體系和表面活性劑組成的洗滌液、發光液，其特徵是採用96孔聚苯乙烯 酶標板作為固相載體、辣根過氧化物酶作為標記物。發光液中，含有發光劑及 氧化劑。發光劑為魯米諾或魯米諾衍生物，氧化劑通常為過氧化氫、過氧化氫 脲等無機氧化劑。反應過程中，待測物與酶標檢測物結合到酶標板上，酶標板 上結合的酶數量與待測物含量成比例。洗滌去除過量的游離酶標記物，加入發 光液。殘留的酶催化發光液中的魯米諾與過氧化氫發生氧化還原反應，反應產 生的化學能轉化為光能，殘留的酶越多，發光強度就越大。通過檢測光強度就 可以計算出樣品中待測物的含量。這種方法的缺點是1)以酶標板作為固相載 體時，由於載體表面的檢測物與樣品中的待測物無法充分接觸，導致反應效率 較低，反應時間較長，通常在60分鐘以上，有些甚至達到3小時以上。2)由於 酶的生物活性會隨著環境條件(溫度、pH等)發生變化，導致同樣數量的酶在 不同條件下產生的光量有明顯的區別，無法得到穩定的結果。3)辣根過氧化物 酶的分子量為40000，鹼性磷酸酶為68000，標記後可能會影響檢測物的活性並 產生空間位阻。
發明內容
針對現有技術存在的缺陷，本發明的目的是提供一種高效率、高穩定性的 基於微粒子的化學發光檢測試劑盒。
本發明的基於微粒子的化學發光檢測試劑盒，包括抗體或抗原或Protein A包被的載體，標記抗體，待測物的標準品、由緩衝體系和表面活性劑組成的洗
滌液以及發光液，其特徵在於所說的抗體或抗原或Protein A包被的載體是含有 -COOH、 -NH2、 -OH或-CHO等基團的微粒子，抗體或抗原或Protein A以化學 交聯的方式包被在微粒子表面。所說的標記抗體是以化學交聯的方式在吖啶酯 或吖啶酯衍生物上連接的抗體。發光液包括A液和B液兩種其中A液為過氧 化氫和硝酸水溶液，A液中過氧化氫的質量濃度在0.1% 3%之間，硝酸的摩 爾濃度在0.01 0.5M之間；B液為氫氧化鈉與Triton X-100水溶液，B液中氫 氧化鈉的摩爾濃度在0.05 1.5M之間，TritonX-100的體積濃度在0.1% 2%之 間。
優選A液中過氧化氫的質量濃度為0.5%，硝酸的摩爾濃度為0.1M; 優選B液中氫氧化鈉的摩爾濃度為0.35M, Triton X-100的體積百分比濃度 為0.5%。
上述的微粒子是直徑在0.01um 100um的磁珠或乳膠。優選微粒子直徑在 0.1um 10um之間。過小的微粒不容易在反應或洗滌後從液體中分離，而過大 的微粒在反應過程中容易沉降。在反應及洗滌過程中，通過振蕩等機械作用或 變化的磁場等方式使微粒保持懸浮狀態。而在固液分離時則利用磁場吸附或離 心等方式使微粒沉降。
上述的化學交聯的交聯劑是戊二醛、氯甲酸乙酯、乙基丁烯二酸酐或環已 基碳二亞胺。
所說的吖啶酯或吖啶酯衍生物的分子結構式如式1，formula see original document page 4式中R為吖啶酯衍生物的不同基團。
吖啶酯是一個三環的有機物，當它在鹼性介質中氧化時，化學鍵發生斷裂，經過一個二氧酮的中間體，產生一個電激發的10-甲基吖啶酮，當它由激發態回 復到基態時在430nm處釋放出光子，化學發光反應過程如下
以吖啶酯或吖咬酯衍生物作為標記物，具有許多優點1.發光強度穩定。 發光時無需酶的催化，發光強度完全取決於吖啶酯的數量，不受外接環境的影 響。2.反應速度快(見附圖)，加入發光液後1 2秒鐘發光強度即達到峰值， 並在5 10秒鐘內完成發光計數。3.吖啶酯屬於小分子化合物，分離量僅為480， 體或抗原或Protein A在標記吖啶酯後不會對待測物的結合產生影響。
本發明的試劑盒用於檢測待測物質的反應過程中，微粒子始終懸浮於反應 溶液中，溶液中的待測物可以與微粒子表面的抗體或抗原或Protein A (蛋白A) 充分接觸，大大提高了待測物被抗體或抗原或Protein A捕獲的機會，從而提高 了檢測反應的速度，縮短反應時間。
本發明涉及的可以用於檢測的樣本包括各種生物組織及提取物、體液或分 泌物，如肌肉、血清、全血、尿液、乳汁等；待測物包括各種生物大分子，如 蛋白、核酸、多糖、多肽等，或各種小分子物質，如抗生素、胺基酸、藥物及 其代謝產物等。
本發明涉及的發光液由兩個獨立的溶液(A液和B液)組成，發光時首先 加入發光液A，其中過氧化氫是氧化吖啶酯的氧化劑；硝酸提供一個酸性的環 境，利於過氧化氫的穩定保存。發光液B中含有氫氧化鈉，提供鹼性的環境促 使吖啶酯氧化發光反應的充分進行。
本發明涉及的洗滌液主要由緩衝體系和表面活性劑組成。其中的緩衝體系 可以選擇PBS、 Tris-HCl等，表面活性劑通常使用Tween-20， Tween-80、 TritonX-100等，有助於清除磁珠表面附著的游離標記物，降低讀數本底，提高 信噪比。
本發明的有益效果在於
l)採用微粒子作為固相載體，增加抗體或抗原或Protein A與待測物的接觸 機會，縮短反應時間。2)採用吖啶酯或吖啶酯衍生物作為標記物，可迅速完成發光並得到穩定的光 信號。發光強度不受外界環境影響。
圖1是吖啶酯瞬時發光示意圖。
具體實施例方式
以下實施例進一步說明本發明。
實施例1.基於微粒子的癌胚抗原(CEA)化學發光檢測試劑盒
基於微粒子的癌胚抗原(CEA)化學發光檢測試劑盒包括抗CEA單克隆 抗體的磁珠，吖啶酯標記的抗CEA抗體，CEA的標準品、洗滌液、發光液。其 中發光液包括A液和B液，A液為過氧化氫和硝酸水溶液，過氧化氫的質量濃 度為0.5%，硝酸的摩爾濃度為0.1M; B液為氫氧化鈉與TritonX-100水溶液， 氫氧化鈉的摩爾濃度為0.35M, TritonX-100的體積百分比為0.5%。
其中，抗CEA單克隆抗體的磁珠是將抗CEA單克隆抗體用環已基碳二亞 胺交聯劑連接到含有-COOH基團、粒徑為2.3um的磁珠構成。
吖啶酯標記的抗CEA抗體是用環己基碳二亞胺交聯劑在吖啶酯上連接的抗 CEA抗體。
洗滌液為含有質量濃度0.36% Tris,質量濃度0.1 % NaCl，質量濃度0.6% Tween-20的水溶液。
使用時，取聚丙烯反應管，分別加入50ul已知濃度的CEA標準品以及待測 病人血清樣本，然後加入150ul包被有抗CEA單克隆抗體的磁珠，以及100ul 吖啶酯標記的抗CEA單克隆抗體溶液混合。37'C反應15分鐘。將反應管置於 磁分離架上，待磁珠充分吸附後棄去上清。加入400ul洗滌液，讓磁珠懸浮與洗 滌液充分接觸。將反應管置於磁分離架上，待磁珠充分吸附後棄去上清。再重 復洗滌2次，棄上清。加入150ul發光液A及150ul發光液B並立即讀取發光 信號。利用標準品的濃度及發光信號即可計算出樣本中CEA的含量。
實施例2.基於微粒子的三碘甲狀腺原氨酸(T3)化學發光檢測試劑盒
基於微粒子的三碘甲狀腺原氨酸(T3)化學發光檢測試劑盒包括抗T3單 克隆抗體的磁珠，吖啶酯標記的T3抗原，T3標準品、洗滌液、發光液。其中 發光液包括A液和B液，A液為過氧化氫和硝酸水溶液，過氧化氫的質量濃度 為0.5%，硝酸的摩爾濃度為0.1M; B液為氫氧化鈉與TritonX-100水溶液，氫 氧化鈉的摩爾濃度為0.35M, TritonX-100的體積百分比為0.5%。其中，抗T3單克隆抗體的磁珠是將抗T3單克隆抗體用環已基碳二亞胺交 聯劑連接到含有-COOH基團、粒徑為2.3um的磁珠構成。
吖啶酯標記的T3抗原是用環已基碳二亞胺交聯劑將T3抗原分子連接到吖 啶酯上的T3抗原。
洗滌液為含有質量濃度0.36。％ Tris，質量濃度0.1。％ NaCl，質量濃度0.6 % Tween-20的水溶液。
使用時，取聚丙烯反應管，分別加入50ul已知濃度的T3標準品以及待測病 人血清樣本，然後加入100ul包被有抗T3單克隆抗體的磁珠，以及100ul吖啶 酯標記的T3溶液，混合。37-C反應15分鐘。將反應管置於磁分離架上，待磁 珠充分吸附後棄去上清。加入400ul洗滌液，讓磁珠懸浮與洗滌液充分接觸。將 反應管置於磁分離架上，待磁珠充分吸附後棄去上清。再重複洗滌2次，棄上 清。加入150ul發光液A及150ul發光液B並立即讀取發光信號。利用T3標準 品的濃度及發光信號即可計算出樣本中T3的含量。
權利要求
1. 基於微粒子的化學發光檢測試劑盒，包括抗體或抗原或Protein A包被的載體，標記抗體，待測物的標準品、由緩衝體系和表面活性劑組成的洗滌液以及發光液，其特徵在於所說的抗體或抗原或Protein A包被的載體是含有-COOH、-NH2、-OH或-CHO基團的微粒子，抗體或抗原或Protein A以化學交聯的方式包被在微粒子表面。所說的標記抗體是以化學交聯的方式在吖啶酯或吖啶酯衍生物上連接的抗體。發光液包括A液和B液兩種其中A液為過氧化氫和硝酸水溶液，A液中過氧化氫的質量濃度在0.1％～3％之間，硝酸的摩爾濃度在0.01～0.5M之間；B液為氫氧化鈉與Triton X-100水溶液，B液中氫氧化鈉的摩爾濃度在0.05～1.5M之間，Triton X-100的體積濃度在0.1％～2％之間。
2. 根據權利要求1所述的基於微粒子的化學發光檢測試劑盒，其特徵在於所 說的微粒子是直徑在0.01um 100um的磁珠或乳膠。
3. 根據權利要求1所述的基於微粒子的化學發光檢測試劑盒，其特徵在於所 說的化學交聯的交聯劑是戊二醛、氯甲酸乙酯、乙基丁烯二酸酐或環己基碳二 亞胺。
4. 根據權利要求1所述的基於微粒子的化學發光檢測試劑盒，其特徵在於發 光液的A液中過氧化氫的質量濃度為0.5%，硝酸的摩爾濃度為0.1M; B液中 氫氧化鈉的摩爾濃度為0.35M， TritonX-lOO的體積百分比濃度為0.5%。
全文摘要
本發明的基於微粒子的化學發光檢測試劑盒，包括抗體或抗原或Protein A包被的載體，標記抗體，待測物的標準品、洗滌液、發光液，其中抗體或抗原或Protein A包被的載體是含有-COOH、-NH2、-OH或-CHO基團的微粒子，抗體或抗原或Protein A以化學交聯的方式包被在微粒子表面。標記抗體是以化學交聯的方式在吖啶酯或吖啶酯衍生物上連接的抗體。發光液包括過氧化氫和硝酸水溶液以及氫氧化鈉與Triton X-100水溶液兩種。由於微粒子可以懸浮於樣本溶液中，有利於增加微粒子表面抗體或抗原或Protein A與待測物充分接觸，縮短反應時間。以吖啶酯或吖啶酯衍生物作為標記物，可以得到穩定、高強度的信號。
文檔編號G01N33/544GK101419234SQ20081012176
公開日2009年4月29日 申請日期2008年10月17日 優先權日2008年10月17日
發明者厲永綱, 強 王 申請人:杭州博日科技有限公司