在卵巢癌中作為預後和治療靶標而被調控的基因的製作方法

2023-09-14 18:16:15 2

專利名稱：在卵巢癌中作為預後和治療靶標而被調控的基因的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫學領域並涉及基因組分析以評估和治療卵巢癌的用途。具體地，本發明涉及通過測量基因表達模式確定病人組織中卵巢癌的存在。
背景技術：
卵巢癌是影響美國婦女的最常見癌症類型之一，有大約1/70的終生危險。見Whittemore，Gynecol.Oncol.，卷55，No.3，第2部分，S15-S19頁(1994)。它是通常很晚才檢測到的快速致死疾病，仍然沒有好的預防方法。卵巢癌最大的危險因素是該疾病的家族史，這提示了遺傳學的強烈影響。見Schildkraut和Thompson，Am.J.Epidemiol.，卷128，No.3，456-466頁(1988)。其他因素如人口統計學因素、生活方式因素和生殖因素也顯示促進卵巢癌的危險。
已經進行了若干卵巢活檢組織和細胞系微陣列表達分析，以鑑定在卵巢癌中特異過表達的基因。見Schummer等，Gene，第238卷，No.2，375-385頁(1999)。其他研究嘗試將基因表達水平與特定的腫瘤類型聯繫起來。見Bayani等，Cancer Res.，卷62，No.12，3466-3476頁(2002)；Welsh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，卷98，No.3，1176-1181頁(2001)；和Ono等，Cancer Res.，卷60，No.18，5007-5011頁(2000)。
這種針對促進我們理解腫瘤發生分子機制和一些情況下更佳腫瘤分類的研究，提供了在分析中很少重疊的一系列基因。一些技術差異可部分地解釋研究之間明顯缺乏一致性或低重複性，這些差異如樣品質量、信使核糖核酸(mRNA)的擴增和不同的微陣列平臺。然而，有可能腫瘤的異質性是促成研究之間觀察到的差異的關鍵因素，特別在那些很少被分析腫瘤的研究中。此外，基於微陣列實驗的基因表達水平比較傳統上使用信號強度比例(倍數變化)來進行，使用有限的統計學方法並缺乏額外樣品的驗證。
然而，明顯高水平表達的或表達量變化最大的基因可能不總是最相關的；可以想像即使是低表達水平時，基因的非常嚴謹調節的細微破壞也可能產生可觀的後果。
因此需要鑑定在卵巢癌中表達程度持續且可靠地變化的基因。這樣的列表可以對卵巢腫瘤發育和增長提供新的洞察力，並提出可能的新藥物靶標以及診斷、監控和治療該疾病的生物學標記物。

發明內容
在本發明中，統計學檢驗和最近描述的留一法(leave-one-out)(見van’t Veer等，Nature，第415卷，No.6871，530-536頁(2002))的組合應用允許分析腫瘤和正常卵巢組織的表達譜，還能夠在多種體液(包括但不限於血和血清)中的基因表達產物中鑑定這些模式。見上文van′t Veer等。
兩個獨立樣品組(測試組和驗證組)的研究證實了若干已知基因與卵巢腫瘤發生的相關性，並鑑定了新基因。這些發現對卵巢腫瘤發生和發展提供新的洞察力，並提示了可能的新藥物靶標以及診斷、監控和治療該疾病的生物學標記物。
在一個實施方案中，本發明提供確定病人是否遭受卵巢癌的方法，包括a)獲得來自所述病人的樣品；b)在來自病人的樣品中測定兩個或更多表9所列基因的表達水平；c)將在(b)中測定的兩個或更多基因的表達水平與表1中所列相同基因的表達水平比較；d)測定(c)中測定的兩個或更多基因的表達水平之間的相似度(DOS)；和e)根據兩個或更多基因的基因表達水平間的DOS確定樣品顯示病人具有卵巢癌的證據的可能性。
在優選的實施方案中，本發明提供了方法，其中測定了表9所列基因的子集(包括表9中1-28號基因)的基因表達水平。
在另一實施方案中，本發明使用包含病人細胞的樣品。可為來自所述病人實體瘤的細胞，或在優選的實施方案中，樣品包含取自所述病人的血細胞和血清。在最優選的實施方案中，樣品包含取自病人的體液。
在優選的實施方案中，本發明使用測定基因表達水平的方法，其包括測量來自病人的樣品中的蛋白質表達產物。可通過多種途徑實施，包括(但不限於)使用特異結合蛋白質的試劑檢測蛋白質表達產物的存在和水平，其中該試劑可選自抗體、抗體衍生物和抗體片段。
在另一實施方案中，本發明提供了通過測量兩個或更多表9中基因轉錄的多核苷酸在樣品中的水平來評估樣品中的表達水平的方法。這些轉錄的多核苷酸可是mRNA或者互補的DNA(cDNA)。
在優選的實施方案中，該方法還將包括擴增轉錄的多核苷酸的步驟。
在另一實施方案中，本發明包括治療遭受卵巢癌的受試者的方法，該方法包括向受試者細胞提供與表8中所列在卵巢癌中表達上調的一個或多個基因互補的反義寡核苷酸。
另外，本發明提供在有發生卵巢癌風險的病人中抑制卵巢癌的方法，該方法包括抑制表8所示在卵巢癌中將上調的一個或多個基因的表達。
本發明還提供用於確定針對具有可疑卵巢癌病人的治療策略的試劑盒，其包含a)能夠識別並結合兩個或更多表9中基因多肽表達產物的大量(例如兩種或更多)抗體；b)適於盛放所述抗體和來自所述個體的體液樣品的容器，其中如果兩個或更多表9所示基因表達多肽產物存在，則抗體可與之接觸；c)檢測所述抗體與兩個或更多表9所示基因表達的多肽的結合的方法；d)使用說明書和試劑盒結果解釋。
在另一個實施方案中，本發明提供用於檢測病人中存在或不存在卵巢癌的試劑盒，其包含a)能夠識別並結合兩個或更多表9中基因mRNA表達產物的大量(例如兩個或更多)多核苷酸；b)適於盛放所述多核苷酸和來自所述個體體液樣品的容器，其中如果存在mRNA，則所述多核苷酸可與之接觸；c)檢測所述多核苷酸與來自兩個或更多表9所示基因的mRNA結合水平的方法；和d)使用說明書和試劑盒結果解釋。
圖表簡述

圖1(A)使用數量更多的探針組重新分類樣品。
圖1(B)錯誤曲線，它是用於確定分類基因最佳數的探針組數量的函數。通過提高來自前6到前55(A)或到全部900(B)的單個探針組的數量來計算數值。箭頭指出最小化分組錯誤的最小數量的探針組(N＝28)。
圖2用於卵巢狀態分類的CC值閾值的確定。
圖3測試和驗證活組織檢查譜與平均正常譜不同大小探針組的相關性。N或T分別表示正常或腫瘤狀態。「r」為相應活檢組織樣品與平均正常譜(第1組)的探針組譜PCC值。樣品由最高CC排列至最低。
圖4、不同大小探針組活組織檢查譜與所有正常譜平均值的相關性。N或T分別表示正常或腫瘤狀態。「r」為相應活檢組織樣品與所有正常樣品譜均值的探針組譜PCC值。樣品由最高CC排列至最低。
實施本發明的模式本發明提供確定來自病人的樣品是否含有存在卵巢癌的證據的方法，樣品包括(但不限於)來自病人的活檢組織或血液、血清或其他體液。
本發明部分根據大約900個與正常組織相比在卵巢癌組織中有差異表達的基因的發現。本發明的該方法包含測量大約900或更少與正常組織相比在卵巢癌組織中有差異表達的基因活性。
在優選的實施方案中，這900個基因只有一小部分被測量。這些測量在多種實施方案中可在來自活體等的組織自身內，或在優選的實施方案中可以更間接的基因表達測量實施，包括(但不限於)在包括血液或其他體液在內的多種組織中測量cRNA或多肽表達產物。
在未知組織狀態的個體中對這900個基因中兩個或更多的表達率的直接或間接的測量可以和相同的兩個或更多基因在卵巢癌組織或正常組織中測量的表達值相比較。
然後，確定未知的兩個或更多基因的表達值與癌症組織和正常組織的「相似度」(DOS)。
DOS可以通過任一方法確定，該方法產生結果的值是兩組數值(即兩個或更多基因在卵巢癌狀況未知或待確定的個體組織中測量的基因表達值，和相同的兩個或更多基因在已知組織中患有卵巢癌的個體和已知組織中未患有卵巢癌的個體中測定的基因表達值)之間DOS的已知函數。
文中使用術語「DOS」旨在表示基因表達值模式相似或數字上相似的程度，如通過比較直接或間接方法測定的基因表達值來衡量。
在優選的實施方案中，DOS通過產生相關係數(CC)的數學計算來確定。在特別優選的實施方案中將確定皮爾遜(Pearson)相關係數(PCC)，但可使用任一其他所產生結果的值為兩組數值之間DOS的已知函數的數學方法。
所計算的DOS(PCC)值可與組織樣品是來自患有或未患有卵巢癌的病人的可能性直接相關。也就是說，與未患有卵巢癌的病人中基因表達值相比病人的DOS(CC或PCC)越高，或與患有卵巢癌的病人中基因表達值相比DOS(CC或PCC)越高，則病人分別未患有或患有卵巢癌的可能性就越大。
因此，在給定的案例中，可使用DOS值確定卵巢癌存在的可能性。本領域技術人員會理解每個病人的臨床表現會指導使用DOS(PCC)值作為捷徑或對關於特定病人的臨床決策起幫助。例如，在一個實施方案中，期望以最佳準確度確定一組患有卵巢癌的病人的數量。這意味著既最小化假陽性(無卵巢癌被錯誤歸類為卵巢癌)又同時最小化假陰性(卵巢癌被錯誤歸類為無卵巢癌)。
在本發明一個優選的實施方案中，如圖3所示使用28個預測的探針組(如下所述)是可行的。如果基因表達譜與平均正常(無卵巢癌)譜以CC≤0.920相關，組織樣品含有卵巢癌的可能是如果CC＞0.920的63倍以上[優勢比(OR)＝63，95％置信區間(CI)3.3-1194.7]。
在本發明的一個實施方案中使用該閾值，基因表達譜與平均未患卵巢癌表達譜相比到達PCC＞0.920的病人將被歸入未患卵巢癌組並被假定為未患有卵巢癌，而表達譜PCC≤0.920的病人將被歸入卵巢癌組並被認為很可能患有卵巢癌。
在另一優選的實施方案中，可以設定PCC以產生任選的靈敏度。即產生最小可能數量的假陰性(卵巢癌被錯誤歸類為無卵巢癌)。在卵巢癌必須以可獲得的最高確定性被排除的情況下，將標明這樣的最佳靈敏度設定。在該實施方案中，該閾值通過設定PCC＞0.955來確定。在這種情況下，在給定的實例中，使用表9所示的28個預測探針(表9所示探針組1-28)，與無卵巢癌組相比CC＞0.955的病人100％不患有卵巢癌，與無卵巢癌組相比CC＜0.870的病人100％患有卵巢癌。
如實施例中所示，本領域技術人員可以選擇或者最大化靈敏度或者最大化特異性或產生任一所需比例的假陽性或假陰性的PCC。本領域技術人員可根據臨床表現容易地調整他們對PCC的選擇來為病人提供最大的益處和安全。
本發明的另一方面為治療卵巢癌的方法。這些方法由抑制發現在卵巢癌中上調的基因的過量基因表達的多種嘗試組成。這些基因在表8中列出。降低這些基因過量表達的方法包括(但不限於)使用反義DNA、siRNA和絡合併失活這些過表達基因的蛋白質表達產物。
測量方法在本發明的一些實施方案中，如下所述通過測量來自組織樣品的mRNA水平來確定900個基因中所選基因的基因表達譜。
在一些實施方案中，基因表達譜可通過測量組織(包括但不限於腫瘤和血液組織)中多肽基因表達產物來更間接地測量。
在一些實施方案中，基因表達通過鑑定表9中所列基因之一編碼的一個或更多蛋白質的存在或數量來測量。
本發明還提供檢測兩個或更多目的標記物(例如來自表2的兩個或更多標記物)的系統。例如，當確定了具體標記物的有限集提供相關信息時，即提供檢測標記物有限集的檢測系統。例如，期望通過通用微陣列檢測所有在組織中表達的基因時，使用定義的微陣列或其他技術檢測多數(如28、42等)定義生物學狀態(如卵巢癌的存在或不存在等)的標記物。
本發明不局限於檢測或測量基因表達生物學標記物的方法。在一些實施方案中，在例如活檢組織樣品的組織樣品中檢測mRNA、cDNA或蛋白質。在另外的實施方案中，在例如血清、血漿、尿液或唾液的體液中檢測mRNA、cDNA或蛋白質。本發明優選的實施方案提供本發明方法的離體實施。本發明還提供用於檢測這些相關的基因表達生物學標記物的試劑盒。
在一些優選的實施方案中，檢測蛋白質或多肽表達產物。蛋白質表達可通過任一適當的方法檢測。在一些實施方案中，通過結合對該蛋白質特異的抗體結合檢測蛋白質。例如在一些實施方案中，使用適當的技術檢測抗體結合，包括(但不限於)放射免疫測定法、酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、「夾層」免疫測定法、免疫放射測定法、凝膠擴散沉澱反應法、免疫擴散測定法、原位免疫測定法(例如使用膠體金、酶或放射性同位素標籤)，例如Western印跡、沉澱反應、凝集測定法(例如凝膠凝集測定法、血凝集測定法等)，補體結合測定法、免疫螢光測定法、A蛋白測定法、免疫電泳測定法和蛋白質組測定法，例如使用與質譜分析耦聯的凝膠電泳來鑑定一個樣品中的多種蛋白質。
在一個實施方案中，通過檢測一抗上的標記物檢測抗體結合。在另一實施方案中，通過檢測二抗或試劑與一抗的結合來檢測一抗。在另外的實施方案中，標記二抗。本領域已知許多在免疫測定中檢測結合的方法，這些方法屬於本發明的範圍。
在一些實施方案中，利用自動檢測測定法。用於自動免疫測定的方法包括(但不限於)U.S.專利NO.5,885,530、4,981,785、6,159,750和5,358,691中所述的那些，此處引用上述各專利作為參考。在一些實施方案中，結果的分析和說明也是自動化的。例如，在一些實施方案中，使用基於一系列對應於標記的蛋白質的存在或不存在產生診斷和/或預測的軟體。
在其他實施方案中，使用U.S.專利NO.5,599,677和5,672,480所述的免疫測定法，此處引用兩專利作為參考。在其他實施方案中，通過免疫組織化學檢測蛋白質。還在其他實施方案中，在cDNA或RNA水平檢測標記物。
文中使用術語「基因表達生物學標記物」是指任一可指出特定基因的基因表達率或度的生物學標記物，包括(但不限於)mRNA、cDNA或特定基因的多肽表達產物。
在本發明的一些實施方案中，使用基於PCR的測定法檢測基因表達生物學標記物。而在其他實施方案中，使用反轉錄酶PCR(RT-PCR)檢測RNA的表達。在RT-PCR中，使用反轉錄酶將RNA酶轉化為cDNA。然後使用cDNA作為PCR反應的模板。PCR產物可使用任一適當的方法檢測，包括(但不限於)凝膠電泳和用DNA特異染料染色或與標記的探針雜交。
在一些實施方案中，使用U.S.專利NO.5,639,606、5,643,765和5,876,978(此處引用上述各專利作為參考)描述的使用競爭模板的標準混合物的定量RT-PCR的方法。
在本發明優選的實施方案中，使用雜交測定法檢測基因表達生物學標記物。在雜交測定法，標記物的存在或不存在根據來自樣品的核酸與互補核酸分子(例如寡聚核苷酸探針)的雜交能力來確定。可利用多種雜交測定法。
在一些實施方案中，探針與目的序列的雜交直接通過顯影結聯合的探針(例如Northern或Southern測定法)來測定，見例如Ausabel等編《Current Protocols in Molecular Biology》，John Wiley Sons，NY(1991)。在這些測定法中，分離DNA(Southern)或RNA(Northern)。然後用一系列限制性酶酶切該DNA或RNA，所述內切酶在基因組中切點稀少並且不接近測定的任一標記物。然後將DNA或RNA通過例如瓊脂糖凝膠分離並轉移至膜上。通過例如摻入放射性的核苷酸來標記的探針被允許在低、中或高嚴謹度條件下與膜接觸。除去未結合的探針，然後通過顯影標記的探針來檢測結合的存在。
在一些實施方案中，DNA晶片測定法為GeneChip(Affymetrix，SantaClara，CA)，見例如U.S.專利NO.6,045,996；5,925,525和5,858,659，此處引用上述各專利作為參考。GeneChip技術使用附著在「晶片」上的小型化、高密度寡核苷酸探針陣列。探針陣列通過Affymetrix光導引的化學合成方法製造，該方法組合固相化學合成與半導體工業中使用的光刻法加工技術。使用一系列的光刻法掩蔽物(mask)定義晶片日暴光位點，隨後是特定的化學合成步驟，該方法構建了寡核苷酸的高密度陣列，其中各探針位於陣列中預定義的位置。多探針陣列在巨大的玻璃薄片上同時合成。然後將薄片切為小片，獨立的探針陣列包裝在注射器型的塑料藥筒內，藥筒使它們與環境隔離並作為雜交的容器使用。
待分析的核酸被分離，使用PCR擴增並用螢光報導子基團標記物。然後使用射流裝置(fluidic station)將標記的DNA與陣列孵育。然後將陣列插入掃描儀，以檢測雜交模式。雜交數據作為光被收集，光由已經整合入結合在探針陣列上的靶標上的螢光報導子基團發射。與靶標完全匹配的探針與錯配的相比通常產生更強的信號。由於各個探針的序列和位置是已知的，通過互補，應用於探針陣列的靶核酸身份可被確定。
在其他實施方案中，使用含有電子捕獲探針(Nanogen，San Diego，CA)的DNA微陣列，見例如U.S.專利NO.6,017,696、6,068,818和6,051,380，此處引用上述各專利作為參考。通過使用微電子學，Nanogen的技術使得帶電荷分子能夠主動運動併集中至其半導體微陣列上的指定測試點以及從那裡主動運動和集中。對給定的基因表達生物學標記物特異的DNA捕獲探針被電子地置於或「尋址」至微陣列上的特定位點。由於核酸分子帶有強負電荷，它們可以被電子地移至正電荷區域。
在另外的實施方案中，使用根據通過表面張力的差異在扁平表面(晶片)上分離流體的陣列技術(ProtoGene，Palo Alto，CA)。見例如U.S.專利NO.6,001,311、5,985,551和5,474,796，此處引用上述各專利作為參考。Protogene的技術基於流體可通過化學塗料傳遞的表面張力差異在扁平表面分離。一旦這樣分離，寡核苷酸探針可在晶片上通過試劑的噴墨印刷直接合成。
在其他的實施方案中，還使用「小珠陣列(bead array)」用於檢測基因表達生物學標記物(Illumina，San Diego，CA)。見例如PCTPublications WO 99/67641和WO 00/39587，此處引用上述各專利作為參考。Illumina使用將光纖束與自發集合為陣列的小珠結合的BEAD ARRAY技術。每個光纖束根據束的直徑包含數千到數百萬的獨立纖維。小珠包被有特異檢測給定標記的寡核苷酸。成批的小珠結合在一起形成對陣列特異的庫。BEAD ARRAY與製備好的樣品接觸以進行測定。使用任一適當的方法檢測雜交。
在本發明的一些優選的實施方案中，通過對特異結構的酶切來檢測雜交，例如INVADERTM實驗、Third Wave技術。見例如U.S.專利NO.5,846,717、6,090、543；6,001,567、5,985,557和5,994,069，此處引用上述各專利作為參考。在一些實施方案中，使用TaqMan測定法(PE Biosystems，Foster City，CA)檢測聯合探針的雜交。見例如U.S.專利NO.5,962,233和5,538,848，此處引用上述各專利作為參考。該測定法在PCR反應中實施。TaqMan測定利用例如AMPLITAQ DNA聚合酶的DNA聚合酶5』-3』核酸外切酶活性。PCR反應中包括特異於給定標記的探針。探針由具有5』-報導染料(如螢光染料)和3』-猝滅染料的寡核苷酸組成。在PCR中，如果探針與其靶標結合，AMPLITAQ聚合酶的5』-3』溶核活性在報導和猝滅染料之間切割探針。報導和猝滅染料的分離導致螢光的增強。螢光隨著每個PCR循環累積並可使用螢光光度計監測。
使用本發明體系和方法產生和使用的其他檢測測定法包括(但不限於)酶錯配切割方法，例如Variagenics(見U.S.專利NO.6,110,684、5,958,692和5,851,770，此處引用其整體作為參考)；分支雜交方法，例如Chiron(見U.S.專利NO.5,849,481、5,710,264、5,124,246和5,624,802，此處引用其整體作為參考)；滾環複製(見例如U.S.專利NO.6,210,884和6,183,960，此處引用其整體作為參考)；NASBA(見例如U.S.專利NO.5,409,818，此處引用其整體作為參考)；分子信標技術(見例如U.S.專利NO.6,150,097，此處引用其整體作為參考)；E-傳感器技術(見Motorola，U.S.專利NO.6,248,229；6,221,583；6,013,170和6,063,573，此處引用其整體作為參考)；循環探針技術(見例如U.S.專利NO.5,403,711；5,011,769和5,660,988，此處引用其整體作為參考)；連接酶鏈式反應[見Barnay，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，卷88,189-93頁(1991)]和夾層雜交方法(見例如U.S.專利NO.5,288,609，此處引用其整體作為參考)。
在一些實施方案中，使用質譜法檢測基因表達生物學標記物。例如在一些實施方案中，使用MASSARRAYTM系統(Sequenom，San Diego，CA)檢測基因表達生物學標記物。見例如U.S.專利NO.6,043,031、5,777,324和5,605,798，此處引用上述各專利作為參考。
在一些實施方案中，本發明提供了用於基因表達生物學標記物的鑑定、定性和定量的試劑盒。在一些實施方案中，試劑盒除檢測試劑和緩衝液外還包含特異於基因表達生物標記的抗體。在其他實施方案中，試劑盒包含特異用於檢測核酸的試劑，例如寡核苷酸探針或引物。在優選的實施方案中，試劑盒包含進行檢測測定必須的所有成分，包括所有的對照、實施測定的說明和所有用於分析和說明結果的必須軟體。在一些實施方案中，試劑盒含有包括環境保護署(Environmental Protection Agency)或美國食品和藥品管理局(FDA)要求的用於標註體外診斷測定法和/或藥物或食品產品的使用說明的說明書。
將生物的基因表達模式與表9中表示的結果相比較，可以指出是否該生物具有可以指出該生物患有或不患有卵巢癌的基因表達譜。
在另一實施方案中，本發明為篩選測試化合物的方法，所述化合物能夠抑制、延緩、逆轉或模擬具有卵巢癌特徵的基因表達變化。在該實施方案的典型實施例中，首先用測試化合物處理已知患有卵巢癌的測試哺乳動物，然後分析該哺乳動物典型組織中會響應卵巢癌而發生表達變化的基因或序列表達水平。優選地，該組織為來自腫瘤或在優選的實施方案中來自容易取材的組織(如血液或血清)的活組織檢查材料。
然後與已知患有卵巢癌但沒有被給予測試化合物的對照哺乳動物比較組織分析，因此鑑定出能夠修飾基因表達生物學標記物序列在哺乳動物樣品中的表達並使得表達朝向未患卵巢癌的模式變化的複合物。
在本發明的另一實施方案中，使用表2公開的基因序列用於模擬未患卵巢癌狀態的療法。通常，設法擴大在卵巢癌中被鑑定為表達不足的基因的基因表達，並減少在卵巢癌中被鑑定為過表達的基因的表達。例如，應設法降低表2中鑑定為提高表達的基因或序列的表達，或提高在卵巢癌中發現減少表達的基因的表達。
提高和降低表達的方法是本領域技術人員已知的。補充表達的實例包括給生物補充額外的基因拷貝。降低表達的優選實例包括RNA反義技術或藥物幹涉。表2公開的基因將是適當的藥物研製靶標。可使用本申請的信息用於藥物研製，通過使用現有的或研發的能夠模擬或抑制表2所列基因或其編碼的蛋白質的活性的藥物複合物。因此，基因表達生物學標記物或文中公開的基因代表了以在分子水平抑制卵巢癌特有的變化為目的的藥物開發和基因治療或RNA反義治療的靶標。這些基因表達的變化還可對理解作為卵巢癌基礎的多種機制起作用。另外，這些基因代表了可用於診斷目的的卵巢癌生物學標記物。
本發明不受表達譜形式的限制。在一些實施方案中，表達譜在計算機軟體中獲得。在一些實施方案中，表達譜為書寫的材料。本發明不受表達譜中提供或顯示的標記物數量限制。例如表達譜可包含兩個或更多見於表2的指示樣品生物學狀態的標記物。
本發明還提供了包含表達信息(例如來自一個或多個樣品的包含一個或多個表2標記的表達譜)的資料庫。在一些實施方案中，發現資料庫用於數據分析，包括(但不限於)將標記物與一個或多個公開的或私人的信息資料庫(例如OMIM、GenBank、BLAST、Molecular ModelingDatabases、Medline、基因組資料庫等)比較。在一些這樣的實施方案中，實施自動方法以自動將來自使用本發明方法得到的數據信息與一個或多個公開的或私人的資料庫中的信息聯繫起來。聯繫的用途在於例如建立表達與表型(如疾病)之間的相互關係。
可以理解本發明將擴展到表9所列小鼠基因的哺乳動物同系物。本領域技術人員通過鑑定與表9所列基因具有足夠高同源性的特定基因可容易的研究其他哺乳動物種中的同系物。「高同源性」是指在核苷酸或胺基酸水平同源性為至少總(在完整基因或蛋白質中)的50％。
縮寫列表

實施例1優選方法為了鑑定在卵巢腫瘤發生和發展中相關的基因，我們比較了一系列正常和腫瘤卵巢活檢組織基因表達譜。每個樣品中產生多於12000個基因的基因表達數據。在我們觀察到的在正常和癌症卵巢活檢組織中最差異表達的900個探針組中，98％在腫瘤活檢組織中下調。使用8個正常和10個腫瘤樣品，我們鑑定了可用於將活檢組織分類為正常或腫瘤的最小數量的探針組(28個)。該發現在之前經另一實驗室分析的第二個活檢組織集(4個正常和14個腫瘤)中被驗證。建立了可作為參考用於比較其他卵巢活檢組織的平均正常卵巢譜。正常和腫瘤卵巢活檢組織的最差異表達基因的鑑定可為卵巢腫瘤產生和發展的分子機制提供新的視角。在該項研究中鑑定的一些基因已知與卵巢癌相關，但大部分代表了用於診斷或監控疾病和治療的藥物靶標和分子生物學標記物的新候選者。
材料與方法樣品新鮮冷凍的卵巢活檢組織取自Asterand(Detroit，MI)，並由10個腫瘤樣品和10個臨近的正常組織組成。還從Ambion(Austin，TX)和Stratagene(La Jolla，CA)購買了4個額外樣品的總RNA。在驗證步驟中使用的樣品基因表達譜由GNF之前產生並報導。見Welsh等(2001)，如上。
大部分分析的腫瘤為惡性表面上皮漿液腫瘤，例如乳頭狀腺癌(cystcarcinoma)、乳頭狀囊腺癌或乳頭狀腺癌；其他的包括粘液囊腫癌、子宮內膜樣腺癌和成熟型畸胎瘤。
樣品信息概述如下文表1所示。
表1.用於基因表達分析的卵巢樣品





注意取自相同病人的成對樣品(正常和腫瘤臨近組織)裝在一起。卵巢癌階段使用FIGO分期系統標明。
RNA表達譜分型從每個活檢組織中提取總RNA並如前文所述處理。本領域技術人員熟知RNA提取技術。所有樣品都使用Affymetrix GENECHIPTM系統按照Affymetrix(GeneChip Expression Analysis Technical Manual，rev.1，2001七月)推薦的進行表達分型。使用Beckman-Coulter DU 650分光光度計在1∶50稀釋樣品後於260nM和280nM波長測量樣品來評估RNA和cDNA的濃度和總量(見表2)。本研究使用的陣列類型為Human Genome U95Av2(http//www.affymetrix.com/products/arrays/specific/hgu95.affx)。
分析策略表達譜的分析以下文所述的幾個步驟進行。
最高質量的微陣列數據選擇我們只使用換算係數低於6的微陣列用於我們的分析，其中超過30％的探針組被Affymetrix MAS 4.0算法稱為「存在」。
選擇探針組的子集表達數據直接從資料庫中輸入GENE SPRING_程序(SiliconGenetics，Redwood City，CA)。排除只在少數樣品中表達的基因；在微陣列上12627個探針組中，只使用10％或更多的樣品中AvgDiff至少為100的探針組用於進一步的分析。進行聚類實驗(clustering experiment)以顯現正常和腫瘤活檢組織中差異的基因表達譜。
進一步的過濾通過排除兩組樣品(第一組正常活檢組織；第二組腫瘤活檢組織)中低質量或強度信號非常低的探針組來完成。在兩組之一的至少75％的樣品不被稱為「存在」(P)的探針組用於進一步分析。另外，低於20的AvgDiff值全部轉換為20的值。
集中最差異表達的基因在兩步中完成兩組樣品中差異表達基因的選擇1.使用SAS 8.2通過非參數的的單因素ANOVA測試，在兩組樣品中比較每個探針組的AvgDiff。
2.p＜0.05的每個探針組AvgDiff與樣品(正常或腫瘤)相關。然後探針組從最高絕對PCC排列至最低(用Microsoft Excel計算)。
樣品的重新分類我們使用先前被描述過的「留-法」分析策略確定區分正常卵巢組織和卵巢癌的最佳探針組數量。見van′t Veer等(2002)，如上文。
為了每個樣品的清除(left-out)，我們測定了每組樣品(組1和組2)中每個探針組的平均AvgDiff。對分-探針組計算清除樣品的表達譜與每組的平均譜之間的PCC。通過根據兩個CC中校高的重新將每個樣品歸類為正常或腫瘤來評估每個探針組區分腫瘤和正常卵巢組織的有效性。
我們測定了使用逐漸增大的基因集(從5開始)時錯誤分類樣品的數量。文中使用「假陰性」定義為腫瘤被錯誤歸類為正常卵巢組織，相反的，「假陽性」定義為正常組織被錯誤歸類為腫瘤。
然後測試了最有效區分腫瘤和正常卵巢組織的探針組對來自GNF(見表1)的不同卵巢組織集(正常和腫瘤)的基因表達譜進行分類的能力。
OR的統計學測定使用期望的閾值相關值構建了指出被正確和錯誤鑑定為正常或腫瘤的活檢組織數量的2×2表格。使用SAS 8.2版計算具有95％置信區間的OR。使用Fisher’s精確測試測定統計學顯著性，以p值0.05截止。
基因探針組名稱和GenBank登錄號之間的連結由Affymetrix提供，並帶有簡短的基因描述。我們通過NCBI資料庫搜索補充並升級了該描述，主要LocusLink為(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/index.html)，OMIM(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.html)和PubMed(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi).
結果RNA表達譜分型20個活檢組織中18個產生了多於對樣品進一步處理必須的5mg純化的總RNA(見表2)。樣品p6175是最小的樣品(38mg)，從中得到了少於1mg純化的總RNA。通過1％瓊脂糖凝膠電泳評估RNA的質量。樣品p6169和p6180缺失28S和18S核糖體RNA條帶，指示一些RNA發生了降解。如果可能，微陣列雜交使用最多15mg cRNA，但不能少於12mg。21個樣品能夠得到足夠的cRNA(見表2)。
質量評估檢查來自PG(本研究)中21個微陣列雜交和來自先前GNF的18個雜交的數據質量(見表3)。見Welsh等(2001)，如上文。除三個(p6169，p6180和p6185)之外的所有都通過了我們換算係數低於6的標準，其中多於30％的探針組被稱為「P」(見表3)。剩餘36個表達譜被分為兩個集合由8個正常和10個腫瘤活檢組織的數據組成的在PG產生的18個表達譜測試集，以及先前在GNF產生的來自4個正常和14個腫瘤活檢組織的18個表達譜驗證集。見Welsh等(2001)，如上文。
分析聚類分析將測試集中18個樣品的表達數據輸入GENESPRING_軟體。在Affymetrix U95A微陣列的12627個探針組中，有2174個在18個樣品中的兩個或更多中有至少100的AvgDiff，將它們用於聚類分析。圖1顯示了產生的樣品和探針組的聚類樹。有趣的是，實驗的樹狀圖包含兩個對應於兩組樣品(正常(頂部)和腫瘤(底部)活檢組)的主要分支。絕大部分(＞90％)檢量的基因在正常卵巢組織中具有整體較高的表達。探針組的樹狀圖只表現出一小簇在腫瘤組織中具有更高表達的基因(左側部分)。
選擇最差異表達的基因在2174個探針組中，217個被排除在進一步的分析之外，因為它們產生許多「A」或者「邊緣」信號(call)(各組中均＞75％)。
將剩餘1957個探針組的數據輸入SAS 8.2版中進行正常和腫瘤組之間的非參數的單因素ANOVA測試。總共900個探針組在兩組之間有顯著的AvgDiff值差異(p＜0.05)。這些基因在表9中列出。
然後將這900個探針組的AvgDiff與兩組樣品相關聯(第一組正常；第二組腫瘤)。絕對PCC(R)值在0.042-0.877間變化，其中694個探針組(77％)具有高於0.5的R值。在附錄1中可得到900個探針組由最高絕對PCC排列至最低的AvgDiff數據。
留一法和樣品的重新分類之前描述的「留一法」分析策略應用於用來表達900個選定的探針組的18個卵巢樣品。見上文van’t Veer等(2002)。
使用最初5個探針組時錯誤歸類的樣品數量為6(2假陽性和4假陰性)。使用逐步增大的基因集。錯誤歸類的數量在2和7之間變化，在使用最初28個探針組時達到最小值(圖1)。這最初的28個探針組只產生一個假陽性和一個假陰性。有趣的是，使用最初32個探針組時達到正常活檢組織的完美分類(0假陽性)(仍然檢測到2假陰性)，而腫瘤活檢組織的完美歸類(0假陰性)則未觀察到。
最佳分類組和相關閾值我們測定了平均正常(無腫瘤)活檢組織譜以歸類探針組，旨在作為分析未知或可疑狀態活檢組織的參考使用；我們預期腫瘤不均一性可能不允許測定參考腫瘤譜。我們通過將最初28個探針組在18個樣品中每一個的表達與使用所有8個正常活檢組織譜計算的平均正常譜比較，檢查了它們的分類值。然後將樣品按照相關值從最高至最低排列，且錯誤率作為產生閾值相關值的函數被測定。圖2顯示其結果。錯誤指定樣品的最小數量為2[1假陽性(p6177)和1假陰性(p6168)]。相應的CC值在0.920和0.921之間。OR和Fisher精確測試基於被正確或錯誤預測為正常或腫瘤的樣品數量實施。觀察的和期望的活檢組織狀態之間的差異是顯著的OR＝63；95％CI3.3-1194.7，p＝0.0029。OR指出如果測試集的表達譜中28個預測探針組與平均正常譜以CC≤0.920相關(見表4)，則該卵巢活檢組織大約63倍更可能來自於卵巢腫瘤。在我們的測試集中，100％的CC＞0.955的譜對應於正常活檢組織且100％的CC＜0.870的譜對應於腫瘤活檢組織(見圖3)。
平均正常譜的驗證通過留一法選出的28個探針組允許我們在我們的18個卵巢樣品中區分正常和腫瘤卵巢活檢組織。然後我們檢測是否獨立的卵巢活檢組織可以通過將它們的表達譜與28個分類探針組的相同平均正常譜比較而被正確地分類。
圖3概括了根據與28個探針組的相關性對所有卵巢活檢組織的分類。值得注意的是，驗證集的正常和腫瘤樣品譜彼此之間清楚分開(見圖3)。如在該測試集中，100％的CC＜0.870的譜對應腫瘤活檢組織。有趣的是，正常譜比測試集有更低的CC，且在驗證集中分離正常和腫瘤活檢組織的最佳閾值相關值位於0.762和0.876之間。
我們在測試集平均正常譜與驗證集平均正常譜之間進行了非參數的t檢驗。類似地，我們比較了兩個集合的平均腫瘤譜。由於未觀察到統計學差異(分別有p＝0.373和p＝0.110)，我們將兩個集合組合以提高28個探針組的分類值。我們將所有樣品的表達與使用所有12個正常活檢組織譜(8個來自測試組4個來自驗證測試)計算的平均正常譜比較。結果證實相關值提供了正常活檢組織與腫瘤活檢組織譜間的非常顯著的分離(見圖4和表5)。如前所見，腫瘤樣品譜(p6168)與平均正常譜高度相關。
單個基因表達與活檢組織狀態間的相關性用於卵巢活檢組織分類的探針組的選擇最初基於18個測試樣品譜完成。使用相同探針組的全部36個正常和腫瘤樣品(見圖4)的良好分離提示用我們方法選擇的基因在許多其他的卵巢腫瘤中差異表達。然而，由於腫瘤的不均一性，單個基因表達的差異可能隨分析的樣品而變化。我們評估了在什麼範圍內900個探針組在18個測試樣品中差異表達，在36個活檢組織被分析時也差異表達。
探針組從最高絕對PCC排列至最低，首先使用來自測試集的18個樣品，然後是來自測試集和驗證集的全部36個樣品。在選定的900個探針組中，694個和473個分別在18和36個樣品中具有高於0.5的絕對CC；412個探針組在兩種情況均有高於0.5的係數。有趣的是，在最初選擇用於活檢組織分類的28個探針組中，19個位於最高的100個中；另外9個探針組相關值在0.359-0.703之間變化。
正常和腫瘤卵巢活檢組織之間差異表達的基因卵巢腫瘤中上調的基因在正常和腫瘤卵巢活檢組織間差異表達的基因中，我們檢測到少量已知在卵巢腫瘤中會上調的基因，例如編碼密蛋白4，拓撲異構酶IIα，激肽釋放酶8，骨橋蛋白以及可能的卵巢癌新標記物(見表6)。
密蛋白4(緊密連接的組件)已經顯示在卵巢腫瘤中與該跨膜受體家族的另一成員密蛋白3一起被上調。見Hough等，Cancer Res.，卷60，No.22，6281-6287頁(2000)。Costa和同事們已經報導拓撲異構酶IIα水平與卵巢表面上皮瘤的預後不良相關。激肽釋放酶8通過免疫組織化學可在癌中檢測到而正常卵巢組織中沒有，並被認為是卵巢癌的預測標記物。見Underwood等，CancerRes.，卷59，No.17，4435-4439頁(1999)；和Magklara等，Clin.Cancer Res.，卷7，No.4，806-811頁(2001)。骨橋蛋白先前也被建議用作卵巢癌的診斷生物學標記物。見Kim等，JAMA，卷287，No.13，1671-1679頁(2002)。另一個基因C20 ORF1顯示在肺癌細胞系中表達，但不在正常肺組織中表達。見Manda等，Genomics，卷61，No.1，5-14頁(1999)。其他可能僅在一些活檢組織中根據腫瘤類型、疾病階段或其他腫瘤特性過表達的基因，通過我們的分析方法未檢測出。
在卵巢腫瘤中下調的基因我們還檢查了大量在卵巢腫瘤活檢組織譜中下調的基因。為了分析的目的，我們根據28個探針組和最高的100個下調基因產物的已知或預測功能將其分為8類(見表7和8)。有趣的是，這100個基因中接近30％的功能仍然未知。大部分其他基因在轉錄調控中(16個基因)、在細胞周期調控、生長分化、細胞死亡或腫瘤抑制中(12個基因)和信號轉導中(6個基因)起作用或被預測為與之相關。該列表包括若干可能的腫瘤抑制子編碼轉化生長因子β受體III(TGF-βR3)的基因、血小板來源的生長因子受體樣基因(PDGFRL)、致腫瘤性抑制(ST13)基因、編碼含有kazal基序的回覆誘導富含半胱氨酸蛋白質(RECK)的基因以及父本表達3(PEG3)基因。
該觀察指出功能仍未鑑定的基因可能與細胞周期調控、生長分化、信號轉導或轉錄調控相關。它們中的一些可能作為腫瘤抑制子起作用。這些基因中只有一個被報導在卵巢腫瘤或細胞系中下調，即在我們的研究中用2個分離的探針組檢測到的IGFBP5(見表8)。見Welsh等(2001)，如上文。
只有6個編碼細胞外基質蛋白質的基因被注意到包含層粘連蛋白2(LAMα2)。Yang和同事們已經報導惡化前上皮基底膜瞬間缺失LAMα2和隨後的Dab2失活是與卵巢表面上皮致腫瘤性相關的普遍早期事件。見Yang等，Cancer，卷94，No.9，2380-2392頁(2002)。有趣的是，Dab2(探針組479_at)的下調在我們的研究中也以CC值0.49被觀察到。
總而言之，這些結果指出大部分在卵巢活檢組織中統計學顯著降低表達的基因的確與腫瘤發生和發展相關，而不是由於細胞群體或組織結構變化(例如結締組織和脂肪細胞丟失)而檢測到的。
討論我們使用的過濾和分析方法提供了一系列在正常和腫瘤卵巢樣品中差異表達的基因。我們顯示了小子集(28-42探針組)足夠根據其表達譜精確地將卵巢活檢組織區分為正常或腫瘤。該表達標籤的驗證通過在獨立實驗室中不同活檢組織譜中完成，並證實正常和腫瘤樣品間觀察到的表達差異反映了生物過程而不是實驗室或分析誤差。
若干文中沒有驗證的可能影響差異表達基因檢測的因素包括測試集中樣品數量和所研究樣品的不均一性。的確，預計活檢組織尤其是腫瘤活檢組織具有高水平的不均一性腫瘤類型、等級、腫瘤細胞百分比、結締組織和脂肪組織的存在等。我們研究了多種等級的不同類型卵巢腫瘤(見表1)，以尋找與腫瘤發生和發展普遍途徑相關的基因，而不是象先前報導的在確定類型腫瘤中更特異相關的基因。見Ono等(2000)，如上文和Welsh等(2001)，如上文。
我們對活檢組織表達譜的聚類分析揭示大部分在正常和腫瘤樣品中差異的基因在腫瘤中都被下調。的確，當900個最差異表達的探針根據它們在所有36個活檢組織和正常及腫瘤狀態間的CC排列時，最高的220個探針(R從0.865-0.644)在腫瘤中下調。我們更緊密地，檢驗了最高的100個基因的功能，最高的10個基因在腫瘤中過表達(R從0.865-0.644)。在最差異表達的基因中，我們檢測了若個已知在卵巢腫瘤中上調的基因，以及可能的卵巢癌新標記物。然而，大部分基因被下調，極可能是因為我們研究了多種類型不同來源、不同等級和不同腫瘤細胞含量的晚期腫瘤。許多這種基因與轉錄調控、細胞周期調控、生長分化、信號轉導、細胞死亡或腫瘤抑制的相關性低於進一步評估它們在卵巢癌中作用的需要。其他功能仍然未知的基因列表指出在腫瘤發生和發展中新的潛在參與者。
修飾RNA豐度和活性的方法修飾RNA豐度和活性的方法目前有三種類型核酶、反義種類和RNA適體。見Good等Gene Ther.，第4卷，No.1，45-54頁(1997)。細胞可操控地應用或暴露於這些實體允許可操控地幹擾RNA豐度。
核酶核酶是能夠催化RNA切割反應的RNA。見Cech，Science，卷236，1532-1539頁(1987)；PCT International Publication WO 90/11364(1990)；Sarver等，Science，卷247，1222-1225頁(1990)。可設計「發卡」和「錘頭」RNA核酶以特異性切割特定靶mRNA。已經建立了設計具有核酶活性的短RNA分子的原則，具有核酶活性的短RNA分子能夠以高度序列特異性的方式切割其他RNA分子並事實上可以所有種類的RNA為靶標。見Haseloff等，Nature，卷334，585-591頁(1988)；Koizumi等，FEBS Lett.，卷228，228-230頁(1988)；和Koizumi等，FEBS Lett.，卷239，285-288頁(1988)。核酶方法涉及將細胞暴露於這樣的小RNA核酶分子；誘導其在細胞中的表達等。見Grassi和Marini，Annals of Med.，卷28，No.6，499-510頁(1996)；以及Gibson，Cancer Meta.Rev.，卷15，287-299頁(1996)。
核酶可在體內常規表達足夠的數量以有效催化切割mRNA，從而修飾細胞中mRNA豐度。見Cotton等EMBO J.，卷8，3861-3866頁(1989)。特別地，根據先前的規則設計並根據例如標準亞磷醯胺化學合成的編碼核酶的DNA序列可被連接於編碼tRNA基因的反密碼子莖和環的限制性酶切位點上，然後該tRNA可通過本領域常規方法轉化進目的細胞並在其中表達。優選地，誘導啟動子(如糖皮質激素或四環素應答元件)也被引入該構建體內使得核酶表達可被選擇性地控制。可使用高度組成性活性啟動子用於飽和使用。tDNA基因即編碼tRNA的基因由於其小尺寸、高效率轉錄和在不同種類組織中的普遍表達而在該申請中有用。因此，可例行設計核酶以切割事實上任何mRNA序列，且細胞可被例行地用編碼這樣核酶序列的DNA轉化從而表達可控制的和催化性的有效數量的核酶。因此，可以修飾或幹擾細胞中事實上任何種類RNA的豐度。
反義分子在另一實施方案中，可通過可控制地應用反義核酸來可控制地抑制靶RNA(優選mRNA)種類的活性，特別是翻譯率。高水平的應用引起飽和抑制。文中使用的「反義」核酸是指由於與編碼或非編碼區序列互補而能夠與特定序列(例如非多聚A、靶RNA局部(如其翻譯起始區)雜交的核酸。本發明的反義核酸可以是雙鏈或單鏈、RNA或DNA的寡核苷酸或其變體或其衍生物，它們能夠直接以可控制的方式施用於細胞或通過外源的轉錄以足夠幹擾靶RNA翻譯的可控制的量導入的外源序列，從而在細胞內產生。
優選地，反義核酸為至少六個核苷酸並優選為寡核苷酸，介於6個寡核苷酸至大約200個寡核苷酸的範圍。在具體的方面，寡核苷酸為至少10個核苷酸、至少15個核苷酸、至少100個核苷酸或至少200個核苷酸。寡核苷酸可為DNA或RNA或嵌合體混合物或它們的衍生物或修飾形式、單鏈或雙鏈。寡核苷酸可在鹼基部分、糖部分或磷酸骨架上被修飾。寡核苷酸可包括其他附加部分，例如肽或促跨膜轉運試劑[見例如Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，卷86，6553-6556頁(1989)；Lemaitre等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，卷84，648-652頁(1987)；和PCT Publication No.WO88/09810(1988)]雜交引發的切割劑[見例如Krol等，BioTechniques，卷6，958-976頁(1988)]或嵌入劑[見例如Zon，Pharm.Res.，卷5，No.9，539-549頁(1988)]。
在本發明優選的方面，反義寡核苷酸優選以單鏈DNA的形式提供。可以本領域普遍已知的組分在寡核苷酸結構上任一位置對其進行修飾。
反義寡核苷酸可包含至少一個修飾的鹼基部分，其選自(但不限於)5-氟尿嘧啶、5-嗅尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯胞嘧啶、5-(羧羥甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶，二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖queosine、肌苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-甲基肌苷、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine，5』-甲氧羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-巰基胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧丙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧丙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。
在另一個實施方案中，寡核苷酸包含至少一個修飾的糖部分，這些糖部分包括(但不限於)阿拉伯糖、2-螢光阿拉伯糖、木酮糖和己糖。
還在另一實施方案中，寡核苷酸包含至少一個修飾的磷酸骨架，修飾選自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酸氨基(phosphoramidothioate)、亞磷醯胺、亞磷醯二胺、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯和formacetal或其類似物。
還在另一實施方案中，寡核苷酸為2-α-異頭寡核苷酸。α-異頭核苷酸與互補的並與通常B-單元相反的RNA形成特異的雙鏈雜交物，雙鏈彼此平行排列。見Gautier等，Nucl.Acids Res.，卷15，6625-6641頁(1987)。
寡核苷酸可綴合另一分子(如多肽、雜交引發的交聯劑、運載劑、雜交引發的切割試劑等)。
本發明反義核酸包含至少與靶RNA種類部分互補的序列。然而，絕對的互補雖然優選但不要求。本文「至少與RNA部分互補的」序列是指有能夠與RNA雜交形成穩定二聚體的足夠互補性的序列；雙鏈反義核酸情況下，可因此測試二聚體DNA的單鏈或測定三聚體形成。雜交能力依賴互補程度和反義核酸的長度。通常，雜交核酸越長，其可能包含與靶RNA間的鹼基錯配就越多並且仍然形成穩定二聚體(或三聚體，根據情況)。本領域技術人員可通過標準方法測定雜交複合物的解鏈溫度來測定錯配耐受度。在抑制靶RNA翻譯中有效的反義核酸的數量可通過標準實驗技術確定。
本發明的寡核苷酸可通過本領域已知標準方法例如使用如來自Biosearch、Applied Biosystems的市售自動DNA合成儀合成。例如，硫代磷酸寡核苷酸可通過Stein等，Nucl.Acids Res.，卷16，3209頁(1988)的方法合成、甲基膦酸酯寡核苷酸可使用可控有孔玻璃聚合物支柱等製備。見Sarin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，卷85，7448-7451頁(1988)。在另一實施方案中，寡核苷酸為2』-0-甲基核糖核苷[見Inoue等，Nucl.Acids Res.，卷15，6131-6148頁(1987)]或嵌合RNA-DNA類似物[見Inoue等，FEBSLett.，卷215，327-330頁(1987)]。
合成的反義寡核苷酸可以受控的或飽和的方式施用給細胞。例如，反義寡核苷酸可以受控的水平被置於細胞的生長環境中，在那裡它們可被細胞吸收。可使用本領域熟知的方法協助寡核苷酸的吸收。
細胞內表達的反義分子在可選的實施方案中，本發明的反義核苷酸通過外源序列的轉錄在細胞內可控制地表達。如果將表達控制在高水平，結果為飽和幹擾或修飾。例如，載體可導入體內使得其被細胞吸收，在該細胞中載體或其部分得到轉錄，產生本發明的反義核酸(RNA)。這樣的載體將包含編碼反義核酸的序列。這樣的載體可是游離的或整合進染色體的，只要它可以轉錄產生期望的反義RNA。可通過本領域標準重組DNA技術構建這樣的載體。載體可是質粒、病毒的或本領域已知的其他用於在哺乳動物細胞中複製並表達的載體。可通過本領域已知任何在目的細胞中發揮作用的啟動子來表達編碼反義RNA的序列。這樣的啟動子可是誘導型的或組成型的。最優選可通過施用受外源成分制或誘導的啟動子，以實現反義寡核苷酸的受控表達。這樣的可控啟動子包括Tet啟動子。其他可用於哺乳動物細胞的啟動子包括(但不限於)SV40早期啟動子區[見Bernoist和Chambon，Nature，卷290，304-310頁(1981)]、勞斯肉瘤病毒3』長末端重複包含的啟動子[見Yamamoto等，Cell，卷22，787-797頁(1980)]、皰疹胸苷激酶啟動子[見Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，卷78，1441-1445頁(1981)]、金屬硫蛋白基因調節序列等[見Brinster等，Nature，卷296，39-42頁(1982)]。
因此，可例行地將反義核酸設計為事實上以任何mRNA為靶標，且可例行地用編碼該反義序列的核酸轉化細胞或將細胞暴露於其中，從而表達有效且可控的或飽和數量的反義核酸。因此，事實上任何RNA在細胞中的翻譯可被修飾或幹擾。
RNA適體最後，在另一實施方案中，可向細胞中導入或在細胞中表達RNA適體。RNA適體為針對蛋白質的特異RNA配體，例如針對Tat和Rev RNA[見Good等(1997)，如上文]，其可以特異抑制蛋白質翻譯。
修飾蛋白質豐度的方法修飾蛋白質豐度的方法包括(特別是)改變蛋白質降解效率和使用與影響天然靶蛋白質種類活性豐度的蛋白質結合的抗體的那些方法。提高(或降低)蛋白質種類的降解效率減少(或增加)該種類的豐度。本發明可使用本領域所熟知的應答於提高的溫度和/或暴露於特定藥物而提高靶蛋白質降解效率的方法。例如，一種這樣的方法使用熱誘導或藥物誘導N-末端降解決定子，它是在較高溫度(例如37℃)下暴露啟動快速蛋白質降解的降解信號，而在較低溫度(如23℃下)隱藏以阻止快速降解的N-末端蛋白質片段。見Dohmen等，Science，卷263，1273-1276頁(1994)。這樣的標準降解決定子為Arg-DHFRts，N-端Val被Arg取代，66位Pro被Leu取代的鼠二氫葉酸還原酶變體。根據該方法，通過本領域已知標準基因打靶方法[見Lodish等，《Molecular Biology of the Cell》，W.H.Freeman和Co.，NY，特別是第8章(1995)]用編碼融合蛋白質Ub-Arg-DHFRts-P(「Ub」代表泛素)的基因取代例如靶蛋白質P的基因。N-末端泛素在暴露N-末端降解決定子的翻譯後被迅速切割。在較低的溫度下，Arg-DHFRts的內部賴氨酸未被暴露，蛋白質泛素化未發生，降解緩慢且活性靶蛋白質水平高。在較高的溫度(無氨甲喋呤)下，Arg-DHFRts的內部賴氨酸被暴露，蛋白質泛素化發生，降解迅速且活性靶蛋白質水平低。由於降解的熱激活可被暴露氨甲喋呤可控地阻滯，該技術還允許可控地改變降解效率。該方法適用於其他應答其他誘導因子(例如藥物和溫度變化)的N-末端降解決定子。
用抗體修飾蛋白質活性靶蛋白質活性也可通過(中和)抗體降低。通過供給受控的或飽和的暴露於這種抗體接觸，蛋白質豐度/活性可被以可控的或飽和的方式修飾或幹擾。例如，針對蛋白質表面合適表位的抗體可減少豐度，從而通過聚集靶蛋白質野生型的活性形式成為與未聚集的野生型形式相比有較少或最小活性的複合物，間接地減少活性。可選地，抗體可通過例如直接與活性位點接觸或阻滯底物接觸活性位點而直接減少蛋白質活性。相反的，在特定的情況下，(激活)抗體也可與蛋白質及其活性位點接觸而增加產生的活性。在任一情況下，可根據特異的蛋白質種類(通過將描述的方法)製備(將要描述的多種類型的)抗體並篩選其效果。抗體的效果可被測定，並選擇能夠提高或降低靶蛋白質種類濃度和/或活性的合適抗體。這樣的測定涉及將抗體導入細胞(見下文)並通過本領域已知標準方法(如免疫測定法)測定野生型濃度、靶蛋白質數量或活性。野生型形式的淨活性可通過對靶蛋白質已知活性適合的測定手段測定。
可通過多種方式將抗體導入細胞，包括例如將抗體顯微注射進細胞[見Morgan等，Immunol.Today，卷9，84-86頁(1988)]或將編碼所需抗體的雜交瘤mRNA轉化入細胞[見Burke等，Cell，卷36，847-858頁(1984)]。在另一技術中，可在多種非淋巴細胞類型中改造和異位地表達重組抗體，以結合靶蛋白質並封閉靶蛋白質活性。見Biocca等，Trends Cell Biol.，卷5，248-252頁(1995)。優選抗體在可控啟動子或組成型活性啟動子(用於產生飽和幹擾)的控制下表達(例如Tet啟動子)。第一步選擇對靶蛋白質有適當特異性的特定單克隆抗體(見下文)。然後編碼所選抗體可變區的序列可被克隆進多種改造的抗體形式中，包括完全抗體、Fab片段、Fv片段、單鏈Fv(ScFv)片段(VH和VL通過肽接頭聯合)、雙抗體(兩個相互結合的具有不同特異性的ScFv)等等。見Hayden等，Curr.Opin.Immunol.，卷9，210-212頁(1997)。通過與多種已知細胞內前導序列融合物表達，可將多種形式的細胞內表達抗體靶向細胞區室，例如細胞質、核、線粒體等。見Bradbury等，《Antibody Engineering》Borrebaeck編，卷2，295-361頁，IRL Press(1995)。特別地，ScFv形式似乎特別適合於細胞質靶向。
抗體類型包括(但不限於)多克隆的、單克隆的、嵌合體的、單鏈的、Fab片段和Fab表達文庫。可使用本領域已知的多種方法製備靶蛋白質的多克隆抗體。抗體製備時，可通過注射靶蛋白質來免疫多種宿主動物，這樣的宿主動物包括(但不限於)兔、小鼠、大鼠等。依賴於宿主種類，可使用多種佐劑來增強免疫應答，包括(但不限於)付氏(完全和不完全)、礦物凝膠(例如氫氧化鋁)、表面活性物質(例如溶血卵磷脂、多聚醇、多聚陰離子、肽、油乳化劑、二硝基苯酚)和可能有用的人佐劑，如卡介苗(BCG)和短小棒桿菌(corynebacterium parvum)。
製備針對靶蛋白質的單克隆抗體時，可使用任何通過培養的連續細胞系產生抗體分子的技術。這樣的技術包括(但不限於)最初由Kohler和Milstein，Nature，卷256，495-497頁(1975)發展的雜交瘤技術、三源雜交瘤技術、人類B-細胞雜交瘤技術[見Kozbor等，Immunol.Today，卷4，72頁(1983)]和產生人類單克隆抗體的EBV雜交瘤技術[見Cole等，《Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy》，Alan R.Liss，Inc.，77-96頁(1985)]。在本發明的附加實施方案中，單克隆抗體可利用新近的技術在無菌動物中製造單克隆抗體。見PCT/US90/02545。根據本發明，可使用人抗體並可通過使用人雜交瘤獲得人抗體[見Cote等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，卷80，2026-2030頁(1983)]，或通過用EBV病毒體外轉化人類B細胞而獲得[見Cole等(1985)，如上文]。事實上，根據本發明，可使用發展來產生「嵌合體抗體」的技術[見Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，卷81，6851-6855頁(1984)；Neuberger等，Nature，卷312，604-608頁(1984)；Takeda等，Nature，卷314，452-454頁(1985)]，所述技術將來自對靶蛋白質特異的小鼠抗體分子的基因與具有適當生物活性的來自人抗體分子的基因拼接而製備「嵌合體抗體」；這樣的抗體包含在本發明範圍內。
另外，當單克隆抗體有利時，也可使用噬菌體展示技術從大的抗體文庫中選擇單克隆抗體。見Marks等，J.Biol.Chem.，卷267，16007-16010頁(1992)。使用該技術在fd絲狀噬菌體表面表達大於1012個不同的抗體，產生能夠選擇單克隆抗體的體外「single pot」抗體免疫系統。見Griffiths等，EMBO J.，卷13，3245-3260頁(1994)。從這樣的文庫中選擇抗體可通過本領域已知技術完成，包括將噬菌體與固定的靶蛋白質接觸、選擇並克隆結合在靶上的噬菌體和將編碼抗體可變區的序列亞克隆進表達所需抗體形式的適當載體。
根據本發明，描述的用於製備單鏈抗體的技術(見U.S.專利NO.4,946,778)可適合於製備靶蛋白質特異的單鏈抗體。本發明附加實施方案利用描述用於構建Fab表達文庫的技術[見Huse等，Science，卷246，1275-1281頁(1989)]以允許快速並容易地鑑定具有所需靶蛋白質特異性的單克隆Fab片段。
可通過本領域已知技術產生含有靶蛋白質獨特型的抗體片段。例如這樣的片段包括(但不限於)可通過胃蛋白酶消化抗體分子產生的F(ab』)2片段；可通過還原F(ab』)2片段二硫鍵產生的Fab』片段；可通過用番木瓜酶和還原劑以及Fv片段處理抗體分子產生的Fab片段。
在製備抗體時，可通過本領域已知技術(例如ELISA)完成目的抗體的篩選。為了篩選靶蛋白質特異的抗體，應針對結合靶蛋白質的抗體測定產生的雜交瘤或噬菌體展示抗體文庫。
修飾蛋白質活性的方法直接修飾蛋白質活性的方法包括(尤其是)顯性失活突變、特異藥物或化學部分以及如前所述的抗體的使用。
顯性負相突變是內源基因的突變或在細胞中的表達會破壞靶蛋白質種類活性的外源基因的突變。根據靶蛋白質的結構和活性，存在指導選擇用於構建破壞該靶標活性的顯性負相突變的合適策略的普遍規律。見Hershkowitz，Nature，卷329，219-222頁(1987)。活性單體形式的情況下，非活性形式的過表達可引起對天然底物或配體的競爭，足以引起靶蛋白質淨活性的顯著降低。這樣的過表達可通過例如將提高活性的啟動子(優選可控或可誘導啟動子，也可以是組成型表達啟動子)與突變基因聯合而完成。可選地，可製造活性位點殘基的變化，使得發生與靶配體事實上不可逆的結合。這可使用一定的酪氨酸激酶小心地取代活性位點的絲氨酸殘基來完成。見Perlmutter等，Curr.Opin.Immunol.，卷8，285-290頁(1996)。
關於活性多聚體形式，若干策略可指導顯性負相突變的選擇。可以受控的或飽和的方式，通過表達編碼結合多聚體聯合結構域並阻止多聚體形成的外源蛋白質片段的基因來降低多聚體活性。可選地，特定類型的非活性蛋白質單位的可控或飽和過表達可束縛非活性多聚體中野生型活性單位，並因此降低多聚體活性。見Nocka等，EMBO J.，卷9，1805-1813頁(1990)。例如，關於二聚體DNA結合蛋白質，DNA結合結構域可從DNA結合單位上被刪除，或將激活結構域從激活單位上刪除。在這種情況下，DNA結合結構域單位還可在沒有引起與激活單位聯合的結構域的情況下表達。因此，DNA結合位點由於沒有任何可能的表達激活而被束縛。在激活時通常經受構象變化的特定類型單位中，剛性單位的表達可使產生的複合物失活。在另一實例中，涉及細胞機制如細胞活力、有絲分裂過程、細胞結構等的蛋白質通常由許多少量類型的亞基聯合組成。這種結構通常對包含有結構缺陷的單體單元引起的破壞高度敏感。這樣的突變單體破壞相關蛋白質活性並可在細胞中以可控的或飽和的方式表達。
除顯性負相突變外，對溫度(或其他外源因子)敏感的突變靶蛋白質可通過本領域熟知的誘變和篩選方法找到。
本領域技術人員還將理解，可使用結合併抑制靶蛋白質的抗體表達作為另一各顯性負相策略。
使用小分子藥物修飾蛋白質最後，可通過暴露於外源藥物或配體，以可控的或飽和的形式修飾或幹擾某些靶蛋白質的活性。由於本發明的方法常用於測試或證實多種癌症治療藥物的有效性，藥物暴露是一個修飾/幹擾細胞組分(mRNAs和表達的蛋白質)的重要方法。在優選的實施方案中，通過藥物暴露或基因操作(例如基因刪除或敲除)幹擾輸入細胞的組分；並且通過基因表達技術(例如與基因轉錄物陣列雜交)來測量系統應答(如下文所述)。
在優選的情況下，已知藥物只與細胞中一個靶蛋白質相互作用並只改變該靶蛋白質活性(增加或減少活性)。將細胞分級暴露於不同數量該種藥物從而引起具有該靶蛋白質作為輸入(input)的網狀模型的分級幹擾。飽和暴露引起飽和修飾/幹擾。例如，環孢素A是非常特異的神經鈣蛋白調節子，通過帶有親環蛋白的複合物作用。因此滴定系列的環孢素A可用於產生任何所需數量的神經鈣蛋白抑制。可選地，飽和暴露於環孢素A將最大化抑制神經鈣蛋白。
測量方法本發明的實驗方法依賴細胞組分的測量。測量的細胞組分可來自於細胞生物狀態的任何方面。它們可來自測量RNA豐度的轉錄狀態、測量蛋白質豐度的翻譯狀態、測量蛋白質活性的活性狀態。細胞特性也可來自混合的方面，例如其中一個或多個蛋白質的活性和其他細胞組分的RNA豐度(基因表達)一起被測量。本部分描述了用於測量藥物或途徑應答中細胞組分的代表性方法。本發明適用該測量的其他方法。
在本發明中優選測量其他細胞組分的轉錄狀況。可通過下面描述的與核酸陣列或核酸模擬探針雜交的技術或通過後面描述的其他基因表達技術來測量轉錄狀況。無論如何測量，結果為包含反映DNA表達比值的代表mRNA豐度的數值和/或比值(不存在RNA降解率差異時)的數據。
在多種本發明可選的實施方案中，可測量轉錄狀態之外的其它方面的生物學狀態，如翻譯狀態、活性狀態或綜合方面。
在所有的實施方案中，應通過相對獨立於進行測量的時間的方式測量細胞組分。
測量轉錄狀態優選地，通過與下部分描述的轉錄物陣列雜交測量轉錄狀態。其他的一些轉錄狀態測量方法在該部分稍後描述。
通常的轉錄物陣列在本發明優選的實施方案中使用「轉錄物陣列」，此處也稱為「微陣列」。可使用轉錄物陣列分析細胞中的轉錄狀態，尤其是測量癌細胞的轉錄狀態。
在一個實施方案中，通過雜交代表細胞中存在的mRNA轉錄物的可檢測標記物的多核苷酸產生轉錄物陣列。例如將從總細胞mRNA合成的螢光標記的cDNA與微陣列雜交。微陣列是帶有細胞或生物基因組中許多基因，優選大部分或幾乎全部基因產物結合(例如雜交)位點的有序陣列的表面。可通過許多途徑製造微陣列，其中一些下文有所描述。無論如何製造，微陣列具有一些共有的特性。陣列是可重現的，這使得可以生產並容易地互相比較給定陣列的多個拷貝。優選小的微陣列，通常小於5cm2且它們由在結合(例如核酸雜交)條件下穩定的材料製成。微陣列上的給定結合位點或結合位點的獨特集合會特異結合細胞中單個基因的產物。儘管每個特異的mRNA可能有多於一個物理結合位點(下文稱「位點」)，為了清晰起見，下文的討論會假定有單個位點。在特定的實施方案中，使用在每個位置包含附著的已知序列核酸的可設定位置的陣列。
要理解當與細胞RNA互補的cDNA被產生並與微陣列在適當的雜交條件下雜交時，與陣列上對應任何特定基因的位點的雜交水平會反映細胞中轉錄自該基因的mRNA的優勢。例如，當被(例如螢光)可檢測標記後，與總細胞mRNA互補的cDNA與微陣列雜交，陣列上在細胞中未轉錄的基因對應的位點(即能夠特異結合基因產物)會有很少或沒有例如螢光的信號，編碼優勢mRNA的基因對應的位點會有較強的信號。
微陣列的製備本領域已知微陣列由序列對應基因產物例如cDNA、mRNA、cRNAs和多肽及其片段的探針可以在已知位置特異雜交或結合的表面組成。在一個實施方案中，微陣列是其中每個位置代表由基因編碼的產物例如蛋白質或RNA的不連續的結合位點且其中存在大部分或幾乎全部生物基因組中基因的結合位點的陣列(即矩陣)。在優選的實施方案中，「結合位點」(下文中的「位點」)是指特定的同源cDNA可與之特異雜交的核酸或核酸類似物。結合位點的核酸或類似物可為例如合成的低聚物、全長cDNA、小於全長的cDNA或基因片段。
儘管在優選的實施方案中，微陣列包含所有或幾乎所有靶生物基因組基因產物的結合位點，這樣的全面不是必須要求的。通常，微陣列會有對應於基因組至少大約50％基因的結合位點，經常至少大約75％、更經常至少大約85％、更經常多於大約90％且最經常至少大約99％。優選地，微陣列具有與檢測和確定目的生物學網絡模型相關基因的結合位點。「基因」被定義為優選至少50、75或99個胺基酸的開放讀碼框(ORF)，生物(例如單細胞)或多細胞生物中一些細胞中的mRNA從之轉錄而來。基因組中基因數可根據生物表達的mRNA數量或通過基因組熟知其特性的部分外推來估計。目的生物基因組被測序後，可確定ORF的數量並通過分析DNA序列鑑定mRNA編碼區。例如，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因組已被完整測序且報導它具有大約6,275個長於99個胺基酸的ORF。這些ORF的分析指出存在5,885個可能指定蛋白質產物的ORF。見Goffeau等，Science，卷274，546-567頁(1996)，此處引用其整體作為參考。相比而言，人類基因組估計含有大約105個基因。
製備用於微陣列的核酸如上文所註解的，與特定同源cDNA特異雜交的「結合位點」通常為附著在該結合位點的核酸或核酸類似物。在一個實施方案中，微陣列的結合位點為對應生物基因組每個基因至少一部分的DNA多核苷酸。這些DNA可通過例如從基因組DNA、cDNA的基因片段中通過如RT-PCR而PCR擴增得到，或為克隆序列。在基因或cDNA已知序列基礎上選擇造成唯一片段(即與微陣列上任何其他片段共享不超過10個鹼基的連續相同序列)的擴增的PCR引物。電腦程式對設計具有要求特異性和最佳擴增性質的引物是有用的。見例如Oligo pl 5.0版，National Biosciences。在對應超長基因的結合位點情況下，有時期望擴增基因近3』末端片段，使得當寡聚dT預處理的cDNA探針與微陣列雜交時，小於全長的探針可有效結合。一般微陣列上每個基因片段長度會在大約50bp到大約2000bp之間，更通常在大約100bp到大約1000bp之間，且常常在300bp到800bp之間。PCR方法是熟知的並在例如Innis等編《PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications》，Academic Press Inc.，San Diego，CA(1990)中描述，此處為全部目的引用其整體作為參考。顯然計算機控制的機器人系統在分離並擴增核酸時是有用的。
產生用於微陣列核酸的其他方法是例如使用N-磷酸酯或亞磷醯胺化學合成多核苷酸或寡核苷酸。見Froehler等，Nucleic Acid Res.，卷14，5399-5407頁(1986)和McBride等，Tetrahedron Lett.，卷24，245-248頁(1983)。合成的序列長度在大約15個鹼基和大約500個鹼基之間，更通常在大約20個鹼基和大約50個鹼基之間。在一些實施方案中，合成的核酸包含非天然鹼基(例如肌苷)。如上文所註解的，核酸類似物可作為雜交結合位點使用。合適的核酸類似物實例為肽核酸。見例如Egholm等，Nature，卷365，566-568頁(1993)；以及U.S.專利NO.5,539,083。
在另一實施方案中，結合(雜交)位點由基因、cDNA(例如表達的序列標籤)的質粒或噬菌體克隆或其中的插入物產生。見Nguyen等，Genomics，卷29，207-209頁(1995)。在另一實施方案中，結合位點的多核苷酸是RNA。
將核酸附著在固體表面將核酸或類似物附著在可由玻璃、塑料(例如聚丙烯和尼龍、聚丙烯醯胺、硝基纖維)或其他材料製成的固體載體上。將核酸附著在表面的優選方法為印在玻璃板上，如Schena等，Science，卷270，467-470頁(1995)中普遍描述的那樣。該方法在製備cDNA微陣列時尤其有用。見DeRisi等，Nat.Genet.，卷14，457-460頁(1996)；Shalon等，Genome Res.，卷6，639-645頁(1996)；和Schena等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，卷93，10539-11286頁(1995)。為了所有目的此處引用前述每篇文章整體作為參考。
另一個優選的製造微陣列的方法是通過製造高密度寡核苷酸陣列。使用用於原位合成的光刻法技術產生[見Fodor等，Science，卷251，767-773頁(1991)；Pease等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，卷91，No.11，5022-5026頁(1994)；Lockhart等，Nat.Biotechnol.，卷14，1675頁(1996)；和U.S.專利NO.5,578,832；5,556,752和5,510,270，為了所有目的此處引用其中每個整體作為參考]或其他確定寡核苷酸的快速合成及沉積[見Blanchard等，Biosens.Bioelectron.，卷11，687-690頁(1996)]，在表面上確定的位置包含數千與確定序列互補的寡核苷酸陣列的技術是已知的。使用這些方法時，已知序列的寡核苷酸(例如20mer)直接在表面(如衍生的載玻片)上合成。通常，產生的陣列對每個RNA多餘若干個寡核苷酸分子。可選擇寡核苷酸探針以另外檢測剪接的mRNA。
也可使用其他製造微陣列的方法，例如通過掩蔽(masking)。見Maskos和Southern，Nucleic Acids Res.，卷20，1679-1684頁(1992)。通常，雖然本領域技術人員會公認由於雜交體積會較小而優選超小的陣列，可使用任意類型的陣列，例如尼龍雜交膜上的斑點印跡[見Sambrook等，《MolecularCloning-A Laboratory Manual》，第二版，卷1-3，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)，為了所有的目的此處引用其整體作為參考]。
製備標記的探針製備總RNA和多聚(A)+RNA的方法是眾所周知的，並一般性描述於Sambrook等(1989)，如上文。在一個實施方案中，RNA從多種類型本發明目的細胞中使用硫氰酸胍裂解和隨後的氯化銫離心法提取。Chirgwin等，Biochemistry，卷18，5294-5299頁(1979)。多聚(A)+RNA通過使用寡聚dT纖維素選擇法來選擇。見Sambrook等(1989)，如上文。目的細胞包括野生型細胞、暴露於藥物中的野生型細胞、具有修飾/幹擾的細胞組分的細胞和暴露於藥物中具有修飾/幹擾的細胞組分的細胞。
標記的cDNA通過寡聚dT引物或隨機引物從mRNA反轉錄製備，兩種方法都是本領域熟知的。見例如Klug和Berger，Methods Enzymol.，卷152，316-325頁(1987)。反轉錄可在與可檢測標籤結合的dNTP，最優選螢光標記的dNTP存在時進行。另外，分離的mRNA可轉化為標記的反義RNA，其通過在標記dNTP存在時的雙鏈cDNA體外轉錄合成。見Lockhart等(1996)，如上文，此處為了所有的目的引用其整體作為參考。在另選的實施方案中，cDNA或RNA探針可在無可檢測標記物存在時合成並可隨後被標記，例如通過摻入生物素化的dNTP或rNTP，或一些類似的手段，例如將生物素的補骨脂素衍生物與RNA光交聯，然後加入標記的鏈黴抗生物素，例如藻紅蛋白綴合的鏈黴抗生物素或等價物。
使用螢光標記探針時，已知許多合適的螢光基團，包括螢光素、麗絲胺、藻紅蛋白、羅丹明(Perkin Elmer Cetus)、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、FluorX(Amersham)見例如Kricka，《Nonisotopic DNA ProbeTechniques》，Academic Press，San Diego，CA(1992)。會理解選擇具有不同發射光譜的成對螢光團以容易地區分它們。
在另一實施方案中，使用除螢光標記外的標記。例如可使用放射性標記物或一對具有不同發射光譜的放射性標記物。見Zhao等，Gene，卷156，207頁(1995)；和Pietu等，Genome Res.，卷6，492頁(1996)。然而，由於放射性粒子的散射以及因此對大空間結合位點的要求，使放射性同位素的使用成為次優選的實施方案。
在一個實施方案中，標記的cDNA通過將包含0.5mM dGTP，dATP和dCTP加上0.1mM dTTP加上螢光脫氧核糖核酸(例如0.1mM羅丹明110UTP(Perken Elmer Cetus)或0.1mM Cy3 dUTP(Amersham))和反轉錄酶(例如SuperScript.TM.II，LTI Inc.)的混合物在42℃孵育60分鐘合成。
與微陣列雜交選擇核酸雜交和洗滌條件使得探針與特異的陣列位點「特異結合」或「特異雜交」，即探針與有互補的核酸序列的序列陣列位點雜交、形成二聚體或結合，但是不與具非互補核酸序列的位點雜交。如在文中使用的，當較短的多核苷酸≤25鹼基，使用標準鹼基配對規則沒有錯誤配對時，或較短的多核苷酸長於25鹼基，錯誤配對不超過5％時，認為一個多核苷酸序列與另一個互補。優選多核苷酸完全互補(沒有錯配)。很容易證明，通過實施包含負對照的測定，特異的雜交條件引起特異雜交。見例如上文Shalon等(1996)和上文Chee等。
最佳雜交條件依賴於標記探針和固定的多核苷酸或寡核苷酸的長度(例如寡聚物和＞200鹼基的多核苷酸)和類型例如RNA、DNA和PNA。通常用於核酸特異(即嚴緊)雜交條件的參數描述於Sambrook等(1996)，如上文，和Ausubel等，《Current Protocols in Molecular Biology》，GreenePublishing and Wiley-Interscience，NY(1987)，此處引用其整體作為參考。使用Schena等的cDNA微陣列時，通常的雜交條件為在有0.2％SDS的5×SSC中於65℃雜交4小時，然後在低嚴緊度洗滌緩衝液(1×SSC加0.2％SDS)中於25℃洗滌，然後在高嚴緊度洗滌緩衝液(0.1×SSC加0.2％SDS)中在25℃10分鐘。見Shena等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，卷93，10614頁(1996)。還提供了有用的雜交條件。見例如Tijessen，《HybridizationWith Nucleic Acid Probes》，Elsevier Science Publishers B.V.(1993)和Kricka(1992)，如上文。
信號檢測和數據分析使用螢光標記探針時，轉錄物陣列上每個位點的螢光發射可優選的通過共聚焦雷射顯微鏡掃描檢測。在一個實施方案中，使用適當的激發光線可對兩個螢光團中的每一個進行單獨掃描。另外，可使用允許樣品同時受到兩個螢光團特異波長的光照的雷射，並且可同時分析來自兩個螢光團的發射。見Shalon等(1996)，如上文，此處為所有目的引用其整體作為參考。在優選的實施方案中，使用具有計算機控制X-Y級別和顯微鏡物鏡的雷射螢光掃描儀掃描陣列。隨後的兩個螢光團激發使用多譜線(multi-lme)、混合氣體雷射實現，並且根據波長分離發射光並使用兩個光電倍增管檢測。螢光雷射掃描設備描述於上文的Schena等(1996)和文中引用的其他參考。另外，可使用Ferguson等，Nat.Biotechnol.，卷14，1681-1684頁(1996)所描述的光導纖維束同時監測許多位點的mRNAs豐度水平。
記錄信號，在優選的實施方案中，通過計算機分析，例如使用12位元組模擬-數字轉換板(analog to digita board)。在一個實施方案中，使用製圖程序(例如Hijaak Graphics Suite)將掃描的圖像去斑點，然後使用創建每個位點每個波長平均雜交的表格程序的圖像網格程序分析。如果必要，可進行兩個螢光團通道之間的相互幹擾(或重疊)的由實驗確定的校正。對於轉錄物陣列上任何具體的雜交位點，優選計算出兩個螢光基團的發射比例。該比例不依賴於同源基因的絕對表達水平，但是對於表達受藥物給予、基因刪除或其他測試事件顯著調控的基因則是有用的。
優選地，除鑑定幹擾是正或負之外，確定幹擾強度是有利的。這可通過本領域技術人員會容易明白的方法進行。
其他測量轉錄狀態的方法細胞的轉錄狀態可使用其他本領域已知的基因表達技術測量。一些這樣的技術產生有限複雜性的限制片段庫用於電泳分析，例如將雙限制性內切酶消化產物與phasing引物結合的方法[見例如EP 0 534858 A1 (1992)，Zabeau等]，或選擇其位點與確定的mRNA末端最接近的限制片段的方法[見例如Prashar等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，卷93，659-663頁(1996)]。其他的方法從cDNA庫中統計地取樣，例如通過測序多個cDNA中每個cDNA足夠多的鹼基(如20-50個鹼基)以鑑定每個cDNA，或通過測序在已知與確定mRNA末端途徑類型相關的位置產生的短標籤(如9-10個鹼基)，見例如Velculescu，Science，卷270，484-487頁(1995)。
其他方面的測量在本發明的多個實施方案中，為了得到藥物和途徑應答，可測量除轉錄狀態之外的其它方面的生物學狀態方面，例如翻譯狀態、活性狀態或綜合的方面。這些實施方案的細節描述於本部分。
翻譯狀態測量可根據若干方法實施翻譯狀態的測量。例如，監測蛋白質的全基因組，即「蛋白質組」[見上文Goffeau等(1996)]，可通過構建微陣列來實現，其中結合位點包括固定的，優選單克隆的對細胞基因組編碼的多種蛋白質種類特異的抗體。優選地，抗體基於編碼的蛋白質主要級分而存在，或至少基於與測試和證實目的網絡模型相關的那些蛋白質。生產單克隆抗體的方法是眾所周知的。見例如Harlow和Lane，《AntibodiesA LaboratoryManual》，Cold Spring Harbor，NY(1988)，此處為了所有的目的引用其整體作為參考。在優選的實施方案中，單克隆抗體針對根據細胞基因組序列設計合成的肽片段製造。使用這樣的抗體陣列，來自細胞的蛋白質與陣列接觸，並使用本領域已知的測定法測定它們的結合。
另外，可通過雙向凝膠電泳系統分離蛋白質。雙向凝膠電泳為本領域所熟知並通常涉及沿著第一個方向的等電聚焦和隨後沿著第二個方向的SDS-PAGE電泳。見例如Hames等，Gel Electrophoresis of ProteinsAPractical Approach，IRL Press，NY(1990)；Shevchenko等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，卷93，1440-1445頁(1996)；Sagliocco等，Yeast，卷12，1519-1533頁(1996)；Lander，Science，卷274，536-539頁(1996)。可通過許多技術分析產生的電泳圖譜，這些技術包括質譜技術、Western印跡和使用多克隆和單克隆抗體的免疫印跡，以及內部和N端微量測序。使用這些技術可能鑑定在給定生理條件下產生全部蛋白質的主要級分，包括在細胞(例如暴露於藥物的酵母中)或例如刪除或過表達特異基因而修飾的細胞中表達的蛋白質。
根據生物學狀態其他方面的實施方案儘管監測除mRNA豐度外的細胞組分目前存在在檢測mRNA時未遇到的某些技術性困難，對本領域技術人員顯而易見的是使用本發明的方法可測量與細胞功能特徵相關的蛋白質的活性，本發明的實施方案可基於這些測量。可通過任何適於待表徵的具體活性的功能、生化或物理途徑實施活性測量。當活性涉及化學轉化時，可將細胞內蛋白質與天然底物接觸並測量轉化率。當活性涉及多聚單元結合，例如激活的DNA結合複合物與DNA結合時，可測量例如轉錄的mRNA數量。另外，當只知道功能活性(例如控制細胞周期)時，可觀察該功能的表現。不管是如何了解和測量的，蛋白質活性的變化構成了本發明上述方法分析的應答數據。
在另選的非限制性實施方案中，應答數據可由細胞生物學狀態的多個方面形成。應答數據可由例如一定的mRNA豐度變化、一定的蛋白質豐度變化和一定的蛋白質活性變化組成。
計算機運行在優選的實施方案中，為了提供用於形成並檢驗生物體系模型的有力的和方便的設備，在計算機系統或一個或多個聯網的計算機系統上實施先前方法的計算步驟。計算機系統可是包括內部元件並連接在外部元件上的單個硬體平臺。該計算機系統的內部元件包括與主存儲器互聯的處理元件。例如計算機系統可是基於Intel Pentium的200Mhz或更大時鐘頻率的處理器加上32Mb或更多主內存。
外部元件包括大量數據存儲器。該大容量存儲器可是通常與處理器和內存成套的一個或多個硬碟。通常，這樣的硬碟提供至少1GB存儲空間。其他的外部元件包括可為顯示器和鍵盤的用戶界面設備以及可為「滑鼠」或其他圖形輸入設備的指示設備。通常計算機系統還連接在其他本地計算機系統、遠程計算機系統或廣域通信網絡(例如網際網路)上。這樣的網絡連接允許計算機系統與其他計算機系統分享數據和處理任務。
該系統運行時，一些本領域標準且本發明特異的軟體元件被下載至內存。這些軟體元件共同引起計算機系統根據本發明的方法運行。這些軟體元件通常存儲於大容量存儲器。另外，軟體元件可存儲於可移動媒體例如軟盤或CD-ROM(無圖片)。該軟體元件代表了負責管理計算機系統及其網絡互聯的作業系統。該作業系統可以是例如Microsoft Windows家族，例如Windows 95、Windows 98或Windows NT或Unix作業系統，例如Sun Solaris。軟體包括方便存在於該系統的常用語言和功能以幫助編制完成本發明特異方法的程序。可用於編制本發明分析方法程序的語言包括C、C++或次優選的JAVA。最優選本發明的方法使用數學軟體包編程，其允許等式的符號輸入和高水平處理規格(包括使用的算法)從而將使用者從程序上的為單個等式或算法編程中解放出來。這樣的軟體包包括例如來自Mathworks的Matlab(Natick，Mass.)、來自Wolfram Researc的Mathematica(Champaign，IL)和來自Mathsoft的MathCAD(Cambridge，MA)。
在優選的實施方案中，分析軟體組間事實上包含互相作用的獨立軟體組件。分析軟體代表包含所有系統運行必需數據的資料庫。這樣的數據通常包括(但不必須限制於)先前實驗的結果、基因組數據、實驗過程和費用以及本領域技術人員顯而易見的其他信息。分析軟體包括含有一個或多個執行本發明分析方法程序的數據歸納和計算組件。
分析軟體還包括用戶界面，其給計算機系統用戶提供測試網絡模型的控制和輸入，以及任選的實驗數據。用戶界面可包括詳細說明系統假設的拖曳界面(drag-and-drop interface)。用戶界面可還包括從大容量存儲器組件(例如硬碟驅動器)、從可移動媒體(例如軟盤或CD-ROM)，或從在網絡(如本地網絡或廣域交流網絡，如網際網路)上用即時系統交流的不同計算機系統上下載實驗數據的方法。
實現本發明分析方法的其他系統和方法將為本領域技術人員顯而易見，並旨在包含於附帶的權利要求書中。具體而言，附帶的權利要求書旨在包含另外的用於實現本發明方法並為本領域技術人員容易明白的備選程序結構。
Table 2.純化的總RNA和RNA的定量

Table 3.實驗QC概述

Table 4.使用28個探針組表達譜的18個卵巢測驗樣品的預測與觀察到的狀態比較

注意顯示每組樣品的觀測數量與隨機聯合時的期望值(括號內)。
″r″＝活檢組織樣品28個探針組譜與平均正常譜的PCC值。OR＝63(95％Cl3.3-1194.7)，p＝0.0029表5.比較36個卵巢樣品使用28個、32個或42個探針組預測的和觀察到的狀態。

表6.在卵巢癌中上調的基因列表顯示只在18個測試樣品中(R1)或在全部36個樣品中(R2)分析的表達水平絕對CC值。

表7.卵巢癌中最差異表達基因的功能分類

*對於5個基因(GPRK5、IGFBP5、IRS1、ITPR1和RBPMS)使用兩個不同探針組得到類似的結果。
表8.在卵巢癌中下調的基因功能種類列表






注意粗體基因符號表示基因用兩個獨立探針組探測。顯示在全部36個樣品中(R1)和只在18個測試樣品中(R2)分析的表達水平絕對CC值。在每個功能類型中，探針組按照降低的R1值排列。
*表示來自28個分類組的基因未排在100個最高R1值中。
Table 9.在卵巢癌中差異影響的900個基因全集。






















表10.前100探針組基於PCC值的排序。










注意顯示在全部36個樣品中(R1)和只在18個測試樣品中(R2)分析的表達水平絕對CC值。
CCs≥0.5用斜體和下劃線標記。
引用的參考文獻所有在此引用的參考文獻以其整體引入作為參考，並且為了所有的目的以相同的程度引入作為參考，就如同每一出版物、專利或專利申請為了所有目的被明確和單獨地以其整體引入作為參考一樣。本文對參考文獻的討論旨在僅概括其作者的主張，並不認為任何參考文獻構成現有技術。申請人保留置疑所引用的參考文獻的精確性和適當性的權利。
另外，文中引用所有的GenBank登錄號、Unigene Cluster號和蛋白質登錄號以其整體引入文中作為參考，並且為了所有的目的以相同的程度引入作為參考，就如同每一號碼為了所有目的被明確和單獨地以其整體引入作為參考一樣。
本發明不局限於本申請描述的具體實施方案的術語，具體實施方案被認為是本發明個別方面的單一解釋。本領域技術人員會明白，可產生本發明的許多修飾和變更而不脫離其主旨和範圍。根據先前的描述和附圖，本領域技術人員會明白本發明範圍內的功能上等價的方法和設備，以及文中列舉的那些。這樣的修飾和變更旨在包含於附加的權利要求書範圍內。本發明僅受附加的權利要求書術語與該權利要求書授權的全部範圍等價物的限制。
權利要求
1.測定病人是否經受卵巢癌的方法，包括a)獲得來自所述病人的樣品；b)測定兩個或更多表9中所列基因在來自病人樣品中的基因表達水平；c)比較b)中測定的兩個或更多基因的基因表達水平與表1中所列相同基因的水平；d)測定c)中測定的兩個或更多基因的基因表達水平之間的相似度(DOS)；以及e)從兩個或更多基因的基因表達水平之間的DOS測定樣品顯示病人中存在卵巢癌的證據的可能性。
2.權利要求1的方法，其中基因表達水平由包含表9中1-28號基因的表中所列基因的子集測定。
3.權利要求1或2的方法，其中樣品包含取自病人的細胞。
4.權利要求1到3中任一項的方法，其中樣品包含從所述病人的實體瘤中取出的細胞。
5.權利要求1到4中任一項的方法，其中樣品包含取自所述病人的血細胞和血清。
6.權利要求1到5中任一項的方法，其中樣品包含取自病人的體液。
7.權利要求1到6中任一項的方法，其中測定基因表達水平的方法包括測量來自病人的樣品中蛋白質表達產物的水平。
8.權利要求7的方法，其中使用與蛋白質特異結合的試劑檢測蛋白質表達產物的存在和水平。
9.權利要求7或8的方法，其中試劑選自抗體、抗體衍生物和抗體片段。
10.權利要求1到6中任一項的方法，其中通過測量表9中兩個或更多基因轉錄的多核苷酸在樣品中的水平評估樣品中的表達水平。
11.權利要求10的方法，其中轉錄的多核苷酸為mRNA。
12.權利要求10或11的方法，其中轉錄的多核苷酸為cDNA。
13.權利要求10到12中任一項的方法，其中檢測步驟還包括擴增轉錄的多核苷酸。
14.權利要求1到13中任一項的方法，其中該方法離體實施。
15.治療經受卵巢癌被試者的方法，該方法包括向被試者細胞提供與一個或多個表6所示在卵巢癌中表達被上調的基因互補的反義寡核苷酸。
16.在有發生卵巢癌危險的被試者中抑制卵巢癌的方法，該方法包括抑制一個或多個表6所示在卵巢癌中被上調的基因的表達。
17.用於決定針對懷疑具有卵巢癌的病人的治療策略的試劑盒，包含a)能夠識別並結合兩個或更多表9所列基因多肽表達產物的兩個或更多抗體；b)適合盛放所述抗體和來自所述個體體液樣品的容器，其中如果存在兩個或更多表9所示基因表達的多肽，抗體可與之接觸；c)檢測所述抗體與兩個或更多表9所示基因表達的多肽結合的手段；以及d)使用和試劑盒結果解釋的說明書。
18.用於確定病人中存在或不存在卵巢癌的試劑盒，包括a)能夠識別並結合兩個或更多表9所示基因的mRNA表達產物的兩個或更多多肽；b)適合盛放所述多核苷酸和來自所述個體體液樣品的容器，其中如果有mRNA，所述多核苷酸可與之接觸；c)探測所述多核苷酸與來自兩個或更多表9所示基因的mRNA結合水平的手段；以及d)使用和試劑盒結果解釋的說明書。
全文摘要
本發明涉及對組織或血液樣品進行基因組分析以檢測卵巢癌在患者中的存在的用途，還涉及實施該測定的試劑盒。此外，本發明涉及治療卵巢癌患者的方法。
文檔編號C12Q1/68GK1845999SQ200480025033
公開日2006年10月11日 申請日期2004年7月1日 優先權日2003年7月2日
發明者C·N·拉韋丹 申請人:諾瓦提斯公司