一種富集液態乳中β-內醯胺類青黴素抗生素的方法
2024-04-02 03:48:05
專利名稱：一種富集液態乳中β-內醯胺類青黴素抗生素的方法
技術領域：
本發明涉及分析化學中樣品前處理領域，具體是涉及一種以苯胺功能團的超順磁納米或亞微米磁球富集液態乳中青黴素抗生素的磁分散固相萃取方法。
背景技術：
牛奶是大自然賜予人類最理想的天然食品，奶業及其由奶業衍生的乳製品行業的健康發展是衡量一個國家現代農業發展水平的重要標誌之一。目前我國乳品行業正進入前所未有的高速發展期，乳製品的質量與安全問題日益受到人們的關注，其中嚴重滯後的產品質量檢測監控手段，為乳業食品安全留下了諸多隱患，如2004年下半年發生的阜陽劣質奶粉事件，2008年9月曝光的「三聚氰胺」奶粉事件以及一直困惱液態奶健康發展的抗生素殘留問題等。青黴素類抗生素是一類含有β_內醯胺基母核結構的抗生素總稱，是當前醫藥和獸藥行業治療和預防因葡萄球菌、肺炎球菌、鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌引起的動物尿道、胃腸道和呼吸道以及乳房炎感染應用最多的一類抗生素。中國、日本、歐盟、美國、國際食品法典委員會都已經對液態乳製品中青黴素類藥物殘留規定了最大殘留限量值。由於青黴素類抗生素良好的抗菌效果，仍廣泛地應用於動物飼養，尤其是奶業養殖中。乳房炎疾病是奶業養殖中最為常見的疾病之一，而青黴素類抗生素是最為有效地治療藥物之一，如果使用者使用不當或不遵守休藥期規定，均可能造成此類抗生素在分泌的液態奶中殘留量超出國家限量標準，從而給人類健康帶來潛在的危害。建立有效、合理、快速和經濟的檢測技術是解決奶業生產、流通及消費過程中食品安全評價、預警及監控體系的有效技術支撐。目前用於青黴素類抗生素殘留檢測的常用方法包括微生物培養法、免疫學檢測方法(ELISA)以及儀器分析法等。微生物培養法是利用青黴素類抗生素能抑制微生物生長原理的基礎上建立起來的簡便測定方法，但由於液態乳中存在的抑菌物質較多，因此測定的結果往往容易存在假陽性，且檢測靈敏度偏低。免疫學檢測方法具有分析速度快，能同時篩選大量樣品的優勢，但該方法仍存在假陽性高、不能同時對多殘留組分進行分別定量檢測的缺陷。同時以上方法僅能用於青黴素類抗生素殘留的篩查分析。儀器分析法因具有檢測靈敏度高，能同時進行多組分檢測，因此仍是液態乳中青黴素類抗生素殘留確證分析的最常用手段。在青黴素類抗生素殘留儀器分析方法中，樣品前處理過程往往是最耗時，耗力的環節。在國標(農業部781號公告)_牛奶中青黴素類藥物殘留檢測方法-高效液相色譜法中規定了牛奶中樣品前處理流程。具體如下:取5 mL待測乳液，加入溴化四丁基銨乙腈溶液10 mL,搖勻。3000 rpm離心10 min,重複以上抽提步驟2次,合併上清液。加入10 mL正己烷，搖勻後靜置10 min，除正己烷層，在45-50°C旋轉蒸發至3-4 mL，過C18固相萃取柱淨化處理。最後採用3 mL乙腈洗脫，洗脫液氮氣吹乾後進行衍生化處理。葉能勝等在「固相萃取一高效液相色譜法檢測牛奶和豬肉中5種青黴素類抗生素」一文中描述採用乙腈提取牛奶中青黴素類抗生素的相對簡便方法，具體流程如下:2.5 mL牛奶試樣加入10 mL乙腈，振蕩混合I min，離心15 min (4000 rpm)。取上層清液，離心後的沉澱物再加入2 mL乙腈重複提取一次。合併上層清液，40°C下用氮氣吹至0.5 1.0 mL ,加水10mL振蕩混勻，然後過Waters Oasis HLB固相萃取柱提取純化。常規方法需要過柱、旋蒸等，有工藝複雜，過柱耗時長、易堵塞、流速太快可造成的吸附效率下降，以及裝柱時吸附劑填裝不均勻密實產生的短路等問題。
發明內容
本發明目的是提供一種更為簡便、實效的液態奶中β -內醯胺類抗生素高效富集的新方法。具體來說本發明的技術方案包含下列步驟:
(1)樣品處理:取8-10 mL液態奶，離心至明顯分層，取5 mL中間層用於吸附；離心有效地除去液態奶中過多的脂肪以及部分不溶解物。(2)吸附:加入5-20 mg苯胺功能團修飾的超順磁磁球(結構見圖1)至液態乳中，混勻吸附3-10分鐘，磁力架分離磁球，棄去乳液；吸附後的磁球進一步採用25飛0%的甲醇水溶液洗滌。25飛0%的甲醇水溶液洗滌其目的旨在進一步除去磁球表面結合的非極性物質，減少液態乳的基質效應對液相色譜的幹擾。當然，為了達到更好的效果，也可以多次洗滌。(3)洗脫收集:加200-500 μ 含氨水的乙腈溶液洗脫磁球上的青黴素抗生素，分離磁球，收集洗脫液。本發明方法具有意想不到的高吸收效率，這可能與表面修飾了苯胺功能團的磁性納米材料為吸附劑，利用磁性材料表面的氨基以及疏水苯環與待測物中青黴素抗生素中羧基以及β_內醯胺環形成親水與疏水結合方式有關；該方法與常規固相萃取方法相比，操作步驟更為簡便，柱材料(吸附劑)使用量僅為固相萃取法的1/10左右，富集係數更高。分離磁球的過程可以採用常規的磁力架分離或者通過離心分離磁球等方法。為了達到更好的離心分離效果，步驟(I)中液態奶5000 6000 rpm冷凍離心10分鐘去除乳脂肪，取中間層脫脂乳部分用於吸附。為了達到更好的富集效果，步驟(2)中超順磁磁球粒徑範圍為7(T300 nm，磁球表面富含苯胺功能團。粒徑小，利於分散，效率高。為了達到更好的洗脫效果，洗脫液中乙腈含量介於60-99%，氨水濃度為1%。洗脫時，採用氨化乙腈進行洗脫，利用洗脫溶液中高濃度乙腈的疏水性，適當的氨水濃度使溶液PH值大於磁性材料吸附劑的氨基解離PKa值。苯胺功能團修飾的超順磁磁球可按如下步驟製備:化學共沉澱法合成超順磁性Fe3O4納米顆粒，再將Fe3O4納米顆粒表面油酸化，無水乙醇洗滌後氮氣吹乾；取5 g表面油酸化的Fe3O4納米顆粒,用體積比15:1的苯乙烯-十六燒混合液5 mL懸浮Fe3O4納米顆粒，超聲5 10 min形成磁流體，將磁流體轉入500 mL,0.0lM含0.3 0.8%的十六烷基三甲基溴化銨的磷酸鹽緩衝液中(pH 7.0)，，超聲波頻率為251(取，超聲功率為200-300 W條件下繼續超聲乳化30 min，形成細乳液；在上述細乳液中加入0.1g K2S2O8於70°C反應1(T20 min後再加入0.3 g 4-氨基苯乙烯，繼續反應12h。磁架吸附磁球，即獲得內含超順磁性Fe3O4納米顆粒，表面修飾有苯胺功能團的的功能化磁球。磁球粒徑大小與溶液中十六烷基三甲基溴化銨含量以及超聲功率成反比(具體見實施例1，2)。磁架回收磁球，I mo I/L NaOH以及lmol/L HCl浸泡洗滌磁球各I h，最後以0.01 mol/L磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)洗滌磁球至中性，並將磁球重懸於0.01 mol/L磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)中於4 °C保存備用。磁球粒徑大小與溶液中十六烷基三甲基溴化銨含量以及超聲功率成反比。本發明還涉及上述富集方法在檢測液態乳中β_內醯胺類青黴素抗生素中的應用，收集洗脫液，過濾，直接上液相或液質聯用檢測。過濾可以直接採取常規液相或液質聯用進樣所需的0.45 μ m或0.22 μ m濾膜過濾，液相色譜或液相色譜_質譜聯用的條件可以直接採取隱色孔雀石綠和隱色結晶紫分析條件，此為常規實驗技術，不再贅言。本發明的有益效果:
1、本發明採用磁固相萃取方法(具體原理見圖2)，有效的富集液態乳中β-內醯胺類青黴素抗生素(包括阿莫西林、青黴素G、青黴素V、乙氧奈青黴素、苯唑西林、雙氯青黴素、氨苄西林等)，且吸附效率高，樣品提取回收率高。此外，本方法的樣品預處理非常簡單，只需要通過離心分層即可吸附，大大提高了富集的速度，縮短了分析檢測的時間。2、本方案為磁球吸附，富集速度快。本磁球的溶液單分散性好，在溶液中可均勻分布，比表面積大，提高了萃取過程中吸附劑吸附待分離物的速率，縮短了吸附時間。3、吸附容量大，所用的有機溶劑少，節約材料，減少了環境汙染。5、磁球粒徑小，比表面積遠大於固相萃取材料，吸附容量大，吸附劑用量少，可實現微量洗脫液洗脫，富集倍數高，且可省去常規前處理流程中的旋轉蒸發等濃縮步驟，對分析物破壞少，減少了檢測誤差。
圖1苯胺功能團修飾的超順磁磁球結構示意圖。圖2本發明所涉及的磁分散固相萃取技術的操作流程圖。
具體實施例方式為了使本發明更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。實施例1 70 nm苯胺功能團修飾的超順磁磁球的製備
參照文獻(Yan F，Li J, ZhangJ, LiuF, YangW.J.Nanopart.Res.，2009，11 (2): 289 296)方法，採用化學共沉澱法合成超順磁性Fe3O4納米顆粒。將250 11]1含0.015 moL的Fe3O4納米顆粒在氮氣保護條件下，加熱至70°C，然後加2.0 mL油酸反應3小時。磁分離油酸化磁球，無水乙醇洗滌油酸化磁球3-4次，氮氣吹乾。取5 g表面油酸化的Fe3O4納米顆粒，用體積比15:1的苯乙烯-十六燒混合液5 mL懸浮Fe3O4納米顆粒,超聲5 10 min形成磁流體,將磁流體轉入500 mL,0.0lM含0.8%的十六燒基三甲基溴化銨的磷酸鹽緩衝液中(pH 7.0),300 W (25KHz)功率繼續超聲乳化30 min，形成細乳液;在上述細乳液中加0.1g K2S2O8於70°C反應10 min後加入0.3 g 4-氨基苯乙烯，繼續反應12h。磁架吸附磁球，即獲得粒徑約為70 nm的內含超順磁性Fe3O4納米顆粒，表面修飾有苯胺的功能化磁球。磁架回收磁球，I mol/L NaOH以及lmol/L HCl浸泡洗滌磁球各I h， 最後以0.01 mol/L磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)洗滌磁球至中性，並將磁球重懸於0.01 mol/L磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)中於4 °C保存備用。實施例2 200 nm苯胺功能團修飾的超順磁磁球的製備取5 g表面油酸化的Fe3O4納米顆粒,用體積比15:1的苯乙烯-十六燒混合液5 mL懸浮Fe3O4納米顆粒，超聲5 10 min形成磁流體，將磁流體轉入500 mL, 0.0lM含0.5%的十六烷基三甲基溴化銨的磷酸鹽緩衝液中(pH 7.0),200 W (25KHz)功率繼續超聲乳化30min，形成細乳液；在上述細乳液中加0.1g K2S2O8於701:反應20 min後加入0.3 g 4-氨基苯乙烯，繼續反應12h。磁架吸附磁球，即獲得粒徑約為200 nm的內含超順磁性Fe3O4納米單顆粒，表面修飾有苯胺的功能化磁球。磁架回收磁球，I mol/L NaOH以及lmol/L HCl浸泡洗滌磁球各I h，最後以0.01 mol/L磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)洗滌磁球至中性，並將磁球重懸於0.01 mol/L磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)中於4 °C保存備用。其餘同實施例1。實施例3 300 nm苯胺功能團修飾的超順磁磁球的製備
取5 g表面油酸化的Fe3O4納米顆粒,用體積比15:1的苯乙烯-十六燒混合液5 mL懸浮Fe3O4納米顆粒,超聲5 10 min形成磁流體,將磁流體轉入500 mL, 0.0lM含0.3%的十六烷基三甲基溴化銨的磷酸鹽緩衝液中(pH 7.0),200 W (25KHz)功率繼續超聲乳化30min，形成細乳液；在上述細乳液中加0.1g K2S2O8於701:反應20 min後加入0.3 g 4-氨基苯乙烯,繼續反應12h。磁架吸附磁球，即獲得粒徑約為300 nm內含超順磁性Fe3O4納米單顆粒，表面修飾有苯胺的功能化磁球。磁架回收磁球，I mol/L NaOH以及lmol/L HCl浸泡洗滌磁球各I h，最後以0.01 mol/L磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)洗滌磁球至中性，並將磁球重懸於0.01 mol/L磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)中於4 °C保存備用。其餘同實施例1。實施例4以粒徑為70 nm的苯胺功能團修飾的超順磁磁球為吸附劑富集新鮮原料乳中7種β -內醯胺類抗生素(包括阿莫西林、青黴素G、青黴素V、乙氧奈青黴素、苯唑西林、雙氯青黴素、氨苄西林等)
I)添加青黴素類抗生素的新鮮原料乳樣品的製備:取4X7份10 mL用農業部781號公告-11-2006方法驗證不含青黴素類抗生素的液態奶，向每份奶樣中添加等量的阿莫西林、青黴素G、青黴素V、乙氧奈青黴素、苯唑西林、雙氯青黴素、氨苄西林，添加量分別為10、25、50 和 100 ng。2)用粒徑為70 nm的苯胺功能團修飾的超順磁磁球為吸附劑共同富集、淨化加標新鮮原料乳中上述7種青黴素類抗生素:將加標液態奶以5000 rpm冷凍離心10分鐘，取中間層乳液5 mL;將8 mg苯胺功能團修飾的超順磁磁球加入上述乳液中，混勻吸附5分鐘；將乳液磁球混合液移至磁力架上分離磁球10 min,棄去乳液；殘留磁球採用2 mL 50%甲醇水溶液洗滌兩次，磁力架分離磁球。將200 μ 含1%氨化的乙腈溶液(乙腈含量80%)浸泡磁球2 min,磁力架分離磁球，洗脫液加入600 μ 超純水稀釋，過0.22 Mm濾膜後直接上串聯四級杆液質聯用儀檢測。3)用液相色譜-質譜聯用法測定所得富集液中青黴素類抗生素的含量。液相色譜條件:色譜柱:AgilentEclipse plus C18 ( 100 mmX2.1 mm, 1.8 Mm)
；流動相:0.1%氨水溶液(A) —乙腈(B)，流速為0.5 mL /min;進行梯度洗脫，梯度條件為 0-6 min 為 95% A 和 5% B; 6-10 min 為 70% A 和 30% B; 10_15min 為 40% A 和 60%B0質譜條件:離子源為電噴霧離子源；掃描方式為正離子掃描；檢測方式為MRM多重反應檢測；氣體溫度為350°C ;氣體流速為10 mL /min;霧化器壓力為310 kPa ( 45psi) ο
4)回收率的計算:將由液相色譜-串聯質譜法測定得到的富集淨化液中青黴素類抗生素的含量，除以加標量得到加標樣品中青黴素類抗生素的回收率。5)不同添加量時本專利提取富集方法的加標回收率見表I。由表可知，本實驗方法提取回收率較高，可達到國標要求。表I加標回收實驗結果
權利要求
1.一種富集液態乳中β-內醯胺類青黴素抗生素的方法，其特徵在於包含以下步驟: (1)樣品處理:取8-10mL液態奶，離心至明顯分層，取5 mL中間層用於吸附； (2)吸附:加入5-20mg苯胺功能團修飾的超順磁磁球至液態乳中，混勻吸附3-10分鐘，磁力架分離磁球，棄去乳液；磁球採用25飛0%的甲醇水溶液洗滌； (3)洗脫收集:加200-500μ 含氨水的乙腈溶液洗脫磁球上的青黴素抗生素，分離磁球，收集洗脫液。
2.根據權利要求1所述的富集液態乳中β-內醯胺類青黴素抗生素方法，其特徵在於:步驟(I)中液態奶需5000~6000 rpm冷凍離心10分鐘去除乳脂肪，取中間層脫脂乳部分用於吸附。
3.根據權利要求1所述的富集液態乳中內醯胺類青黴素抗生素方法，其特徵在於步驟(2)中超順磁磁球粒徑範圍為70~300 nm，磁球表面富含苯胺功能團。
4.根據權利要求1所述的富集液態乳中青黴素抗生素方法，其特徵在於步驟(3)洗脫液為含1%氨水的乙腈溶液，其中 乙腈含量介於60-99%。
5.根據權利要求1所述的富集液態乳中內醯胺類青黴素抗生素方法，其特徵在於所述苯胺功能團修飾的超順磁磁球按如下步驟製備:化學共沉澱法合成超順磁性Fe3O4納米顆粒，再將Fe3O4納米顆粒表面油酸化，無水乙醇洗滌後氮氣吹乾；取5 g表面油酸化的Fe3O4納米顆粒,用體積比15:1的苯乙烯-十六燒混合液5 mL懸浮Fe3O4納米顆粒,超聲5 10 min形成磁流體，將磁流體轉入500 mL,0.0lM含0.3 0.8%的十六烷基三甲基溴化銨的pH 7.0磷酸鹽緩衝液中，超聲波頻率為25KHz，超聲功率為200-300 W條件下繼續超聲乳化30 min，形成細乳液；在上述細乳液中加入0.1g K2S2O8於70°C反應10~20 min後加入0.3 g 4-氨基苯乙烯，繼續反應12h;磁架吸附磁球，即獲得內含超順磁性Fe3O4納米單顆粒，表面修飾有苯胺的功能化磁球。
6.權利要求1所述的富集方法在檢測液態乳中內醯胺類青黴素抗生素中的應用，其特徵在於收集洗脫液，過濾，直接上液相或液質聯用檢測。
全文摘要
本發明公開了一種富集液態乳製品中β-內醯胺類青黴素抗生素的磁性分散固相萃取新方法，涉及食品安全分析領域中樣品前處理的新方法。本發明僅需將液態乳進行冷凍離心脫脂處理，然後將微量的表面修飾有苯胺功能團的超順磁納米或亞微米磁球加入脫脂液態乳中吸附數分鐘，磁力架分離磁球，磁球經25~50%的甲醇水溶液洗滌後採用微量洗脫液洗脫獲得富集有β-內醯胺類抗生素的溶液。與常規固相萃取方法相比，具有操作流程簡單、耗時少、無需旋轉蒸發等步驟的特點。
文檔編號G01N30/08GK103105446SQ20121031624
公開日2013年5月15日 申請日期2012年8月31日 優先權日2011年11月15日
發明者熊勇華, 郭亮, 吳科盛 申請人:南昌大學