一種菸草黑脛病抗性的苗期恆溫水培鑑定方法
2024-03-01 17:30:15
專利名稱：一種菸草黑脛病抗性的苗期恆溫水培鑑定方法
技術領域：
本發明屬於作物抗病性鑑定技術領域，特別是一種菸草黑脛病抗性的苗期溫水水 培鑑定方法。
背景技術：
菸草黑脛病是菸草(Nicotiana tabacum)生產上的毀滅性病害之一，是制約我國 各煙區菸葉生產的最重要因素，可以危害烤菸、晾煙、曬煙、白肋煙、香料煙等所有的栽培煙 草。美國北卡羅萊納州每年因菸草黑脛病損失的菸葉約佔總產量的 2%，1995年和 1996年兩年間因黑脛病造成的損失就達3610萬美元，佔病害總損失的35. 13%，居各病害 之首。該病在我國分布範圍很廣，除黑龍江省尚未發現之外，其餘各植煙省區(含臺灣省) 均有發生。平均發病率為5% 12%，嚴重田塊發病率高達75%，甚至造成絕收。據不完全 統計，我國菸草黑脛病平均每年發病面積高達76373hm2，產量損失2869. 26萬千克，產值損 失超過1. 23億元人民幣。生產實踐表明，防治黑脛病最經濟、有效、環保的措施就是選育抗 病品種，抗性鑑定自然成為抗源挖掘利用、抗病育種、抗性監測等工作中重要的一環。現有的菸草抗性鑑定方法主要有溫室苗期鑑定接種法和病圃活體菌株人工接種 鑑定法。苗期鑑定法通常採用遊動孢子或菌絲體懸浮液浸根接種，病圃活體菌株人工接種 鑑定是目前常用的鑑定方法，缺點是移栽緩苗後接種，時間長，工作量大。我國菸草普遍採用漂浮育苗，漂浮育苗是當前國際上先進的育苗新技術，具有壯 苗率高、操作簡便、專業化程度高、省工節時、方便管理、有利環境保護等許多優點，近年來， 在我省得到了大面積推廣應用，因此，在漂浮育苗基礎上，建立菸草黑脛病抗性的漂浮池水 培接種鑑定方法，對抗病種質資源篩選、抗性遺傳特性研究和抗病育種具有重要意義。
發明內容
本發明的目的在於針對現有技術的步驟，提供一種菸草黑脛病抗性的苗期恆溫水 培鑑定方法，用漂浮池恆溫水培接種鑑定結果代替傳統的土壤盆栽和大田鑑定結果。消除 環境溫度和溼度對鑑定結果的影響，避免其他病害對鑑定結果的幹擾，提高鑑定結果的準 確性，同時可節省場地和試驗成本、縮短鑑定時間。本發明通過以下技術方案予以實現1)池水保溫循環漂浮池建造在玻璃溫室或塑料大棚溫室內建造，池底墊一層厚約4cm的泡沫塑料板，鋪兩層 塑料膜，整個池壁四周用泡沫塑料板保溫，水深5cm 20cm。苗池一端設控溫電加熱棒(中 山超信電器廠產品)和池水循環泵(廣東海利集團有限公司產品)。控溫電加熱棒和池水 循環泵通過控溫裝置聯動。池水為深井水或自來水。根據黑脛病適宜發病溫度和黑脛病區 土溫，設置水溫為24. 0°C 32. O0C。2)煙苗移植及日常管理煙苗一次剪葉後，苗齡30d 50d，每個待鑑定材料挑選45株，移植到新的漂浮盤中。以革新三號、G28品種為抗病對照，以紅花大金元品種為感病對照。漂浮池營養液的氮 素濃度控制在100mg/kg 250mg/kg。根據池水蒸發量，經常補充池水至初始水深。採用自 動溫溼度記錄儀(杭州哈泰克公司產品)每小時記錄一次水溫。3)接種體製備及接種菸草黑脛病菌活化後，接種燕麥液體培養基，在28°C、150rpm的搖床上培養2周， 按質量比加0. 硝酸鉀到培養基溶液，混合得到遊動孢子懸浮菌液；莖基部創傷接種吸 取遊動孢子懸浮菌液注射接種於40d苗齡煙苗的莖基部，每株接種5mL菌液(1000孢子/ mL)，每個品種設3個重複，每個重複接種15株。接種後將育苗盤放入28°C恆溫池，及時噴水保持較高溼度，誘發病害產生。4)病情調查與分級接種後3d調查發病情況，以後每隔2d 3d調查一次發病情況。記錄發病率及病 情指數。以感病對照發病率達到70%左右的病情指數作為品種抗性評價標準。病害嚴重度分級標準按GB/T 23222-2008的規定。5)抗性評價抗性評價標準按GB/T 23224-2008的規定。本發明與現有技術相比具有如下的優點和有益效果1)在塑料拱棚溫室中均勻提高土壤溫度難度大，恆溫溫室造價高。本發明通過在 普通漂浮池基礎上，增加簡單的保溫材料、加熱控溫設備和水循環泵，以低成本成功解決了 溫度問題。2)採用市售的肥料和自來水配製營養液，與MS營養液和無菌水相比，成本大幅度 降低。3)漂浮池恆溫水培鑑定可在一個月之內完成，使得提高煙苗密度、減少水培面積 可行，從而大幅度減少接種菌的數量。漂浮池恆溫水培鑑定方法的實用性在於發病迅速，從接種到調查結束可在一個 月內完成；佔地面積小，在幾十平方米的面積上一次可同時鑑定上千株煙苗；結果重複性 高，能有效排除土壤溫度差異和其他病害對抗性結果的幹擾，有利於年度間和不同實驗室 間結果重現和比較；結果可靠性高，抗感品種的發病率和病情指數差異明顯，品種的抗性評 價結果與他人多年的抗性評價結果基本一致。該方法在抗病資源和育種中間材料的抗性鑑 定、抗性遺傳規律研究中應用潛力較大。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步詳細的說明，但它們不是對本發明的限定。實施例1 一種菸草黑脛病抗性的苗期恆溫水培鑑定方法，在玻璃溫室或塑料大 棚溫室內建造保溫加熱漂浮池。池底墊一層厚約4cm的泡沫塑料板，鋪2層塑料膜，整個池 壁四周用泡沫塑料板保溫。苗池一端設控溫電加熱棒(中山超信電器廠產品)和池水循環 泵(廣東海利集團有限公司產品)。控溫電加熱棒和池水循環泵通過控溫裝置聯動。池水 為深井水或自來水。水深10cm。根據黑脛病適宜發病溫度設置水溫為28°C。煙苗一次剪 葉後，苗齡40d，每個待鑑定材料挑選45株，移植到新的漂浮盤中。以革新三號、G28品種為 抗病對照，以紅花大金元品種為感病對照。漂浮池營養液的氮素濃度控制在150mg/kg。根據池水蒸發量，經常補充池水至初始水深。採用自動溫溼度記錄儀(杭州哈泰克公司產品) 每小時記錄一次水溫。將保存的黑脛菌菌株使用前在燕麥培養基活化後，接種燕麥液體培 養基28°C 150rpm搖床培養2周，加0. 硝酸鉀溶液。莖基部創傷接種，吸取遊動孢子懸 浮液注射接種40d苗齡煙苗的莖基部，每株接種5mL菌液(1000孢子/mL)，每品種設3個重 復，每重複接種15株。接種後將育苗盤放入28°C恆溫池，及時噴水保持較高溼度，誘發病害 產生。接種後3d調查發病情況，以後每隔2d 3d調查一次發病情況。記錄發病率及病情 指數。以感病對照發病率達到70%左右的病情指數作為品種抗性評價標準。病害嚴重度分 級標準應符合GB/T 23222-2008的規定。抗性評價標準應符合GB/T23224-2008的規定。實施例2 重複實施例1，有以下不同點池水溫度設置為24°C。實施例3 重複實施例1，有以下不同點池水溫度設置為32°C。實施例4 重複實施例1，有以下不同點苗齡50d。實施例5 重複實施例1，有以下不同點苗齡30d。實施例6 重複實施例1，有以下不同點非創傷接種。下面為採用本發明的黑脛病苗期恆溫水培鑑定與苗期盆栽鑑定、大田病圃接種發 病鑑定結果的相關性分析。1材料與方法1. 1供試材料供試菸草材料革新三號、G28、K326、KM10、小黃金1025和紅花大金元，為國內外報 道的抗、感黑脛病資源。以革新三號、G28為抗病對照，小黃金1025、紅花大金元為感病對 照。黑脛菌強致病力菌株162#，分離自雲南省文山州文山縣。1.2室內苗期抗性鑑定1. 2. 1漂浮池恆溫水培接種鑑定池水保溫循環漂浮池建造方法池底墊一層厚約4cm的泡沫塑料板，鋪2層池膜， 整個池壁四周用泡沫塑料板保溫。苗池一端設控溫電加熱棒(中山超信電器廠產品)和池 水循環泵(廣東海利集團有限公司產品)。電加熱棒和池水循環泵通過控溫裝置聯動。根 據黑脛病適宜發病溫度設置水溫為28°C。採用自動溫溼度記錄儀(杭州哈泰克公司產品) 每小時記錄一次水溫。煙苗一次剪葉後(苗齡40d)，每個材料挑選45株，移植到新的漂浮 盤中。將保存的黑脛菌菌株使用前在燕麥培養基活化後，接種燕麥液體培養基28°C 150rpm 搖床培養2周，加0. 1 %硝酸鉀溶液。莖基部創傷接種，吸取遊動孢子懸浮液注射接種40d 苗齡煙苗的莖基部，每株接種5mL菌液(10000孢子/mL)，每品種設3個重複，每重複接種 15株。接種後將育苗盤放入28°C恆溫池，及時噴水保持較高溼度，誘發病害產生。接種後 3d調查發病情況，以後每隔2d 3d調查一次發病情況。記錄發病率及病情指數。以感病 對照發病率達到70%左右的病情指數作為品種抗性評價標準。1. 2. 2 土壤盆栽傷根接種鑑定在塑料拱棚溫室內進行。盆栽苗齡50d煙苗，每材料30株。採用直徑12cm的一 次性黑色塑料花盆，每盆裝紅壤土約500g。移栽成活後，在煙株兩側將刀刮傷煙苗莖基部， 每株澆灌IX IO4CfuAiL菌懸液20ml。通過溫室通風簾控制室內白天溫度、傍晚關閉通風簾 保溫。接種後每周觀察一次發病情況，在感病對照發病率達到20%左右詳細調查病情，以感 病對照發病率達到75%左右的調查結果作為品種抗性評價標準。
1.3病圃接種發病鑑定在煙田黑脛病圃中進行，田間設計隨機排列，3次重複，每個小區種植15株，行株 距為1. 2mX0. 50m ；其它田間栽培管理按當地優質煙生產技術進行。1. 4病情調查與抗性評價病害嚴重度分級標準按照GB/T 23222-2008的規定。0級全株無病；1級莖部 病斑不超過莖圍得三分之一，或三分之一以下葉片萎焉；3級頸部病斑環繞莖圍三分之一 至二分之一，或三分之一至二分之一葉片輕度凋萎，或下部少數葉片出現病斑；5級莖部 病斑超過莖圍得二分之一，但未全部環繞莖圍，獲二分之一至三分之二葉片凋萎；7級莖 部病斑全部環繞莖圍，或三分之二以上葉片凋萎；9級病株基本枯死。抗性評價標準按照GB/T 23224-2008的規定。抗性評價標準高抗或免疫(I)病 情指數為0 ；抗病(R)病情指數0. 1 20衝抗(MR)病情指數20. 1 40衝感(MS)病 情指數40. 1 60 ；感病⑶病情指數60. 1 80 ；高感(HS)病情指數80. 1 100。2.結果與分析2. 1苗期恆溫水培接種黑脛病抗性鑑定方法發病情況表1不同方法和不同濃度接種對黑脛病病情的影響
權利要求
1.一種菸草黑脛病抗性的苗期恆溫水培鑑定方法，其特徵在於按以下順序步驟1)池水保溫循環漂浮池建造在玻璃溫室或塑料大棚溫室內建造漂浮池，池底墊一層厚約4cm的泡沫塑料板，鋪兩 層塑料膜，池壁四周用泡沫塑料板保溫；池內水深5cm 20cm，一端設控溫電加熱棒和池水 循環泵，控溫電加熱棒和池水循環泵通過控溫裝置聯動，池水為深井水或自來水，控制水溫 為 24. 0°C~ 32. O0C ；2)煙苗移植以革新三號、G28品種為抗病對照，以紅花大金元品種為感病對照，煙苗一次剪葉後，苗 齡30d 50d時，每個待鑑定材料挑選45株，移植到新的漂浮盤中；漂浮池營養液的氮素濃 度控制在100mg/kg 250mg/kg ；根據池水蒸發量，經常補充池水至初始水深，採用自動溫 溼度記錄儀每小時記錄一次水溫；3)接種體製備及接種菸草黑脛病菌活化後，接種燕麥液體培養基，在28°C、150rpm的搖床上培養2周，按質 量比例加0. 硝酸鉀到培養基溶液中，混合得到遊動孢子懸浮菌液；吸取遊動孢子懸浮 菌液注射接種於40d苗齡煙苗的莖基部，每株接種5mL菌液，1000孢子/mL，每個品種設3 個重複，每個重複接種15株；接種後將育苗盤放入28°C恆溫池，及時噴水保持較高溼度，誘 發病害產生；4)病情調查與分級接種後3d調查發病情況，以後每隔2d 3d調查一次發病情況，記錄發病率及病情指 數；以感病對照發病率，達到70%左右的病情指數作為品種抗性評價標準，病害嚴重度分 級標準按GB/T 23222-2008的規定；5)抗性評價抗性評價標準按GB/T 23224-2008的規定。
2.根據權利要求1所述的鑑定方法，其特徵在於步驟2)所述的營養液為市售的菸草 漂浮育苗專用肥料配製。
全文摘要
一種菸草黑脛病抗性的苗期恆溫水培鑑定方法，有以下順序步驟池水保溫循環漂浮池建造、煙苗移植、接種體製備及接種、病情調查與分級和抗性評價；本發明具有發病迅速、結果重複性好、可靠、無其他病害幹擾等特點，實現了用苗期鑑定結果代替傳統大田鑑定結果，實現了在較小面積上鑑定大量材料、一年多次鑑定，提高了結果的可靠性、縮短了鑑定周期、節省鑑定成本。
文檔編號C12R1/645GK101999287SQ201010280169
公開日2011年4月6日 申請日期2010年9月14日 優先權日2010年9月14日
發明者冷曉東, 劉勇, 盧秀萍, 李梅雲, 李永平, 李祥, 肖炳光 申請人:雲南省菸草農業科學研究院