番茄潰瘍病菌單克隆抗體製備方法及其試劑盒和使用方法
2024-04-01 09:52:05
專利名稱：番茄潰瘍病菌單克隆抗體製備方法及其試劑盒和使用方法
技術領域：
本發明涉及一種高特異性、高靈敏性檢測引發番茄潰瘍病的密執安棒桿菌的單克隆抗體，屬於植物檢疫和植物保護領域，專一針對番茄潰瘍病菌(Clavikicter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm)的檢測。該抗體適用於番茄潰瘍病的田間預防和植物檢疫及植物保護中番茄潰瘍病菌的快速檢測。
背景技術：
番茄潰瘍病(Bacterial canker of toma to)是番茄生產中最為嚴重、具有毀滅性的病害之一，病原菌為密執安棒形桿菌密執安亞種(Clavikicter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm)。該病自從1909年首次在美國密執安州的溫室番茄上發現以來，現已廣泛分布於美國各番茄產區，並逐漸成為世界性病害。自1989年以來，我國相繼在北京、黑龍江、吉林等10多個省區報導發生此病，使許多地區番茄生產受到了不同程度的影響。因此，我國將該病原菌列入全國農業和進境植物檢疫性有害生物名單中。番茄潰瘍病主要危害植株維管束，苗期至成株期均可染病。苗期染病，發病初始產生於下部葉緣，並逐漸由下部葉片向上部葉片引起萎蔫，甚至在胚軸或葉柄產生潰瘍狀稍凹陷小條斑，造成病苗矮化或枯死。成株期染病，發病初始下部近地面葉片萎蔫下垂或捲縮，似缺水狀，上部葉片仍正常生長，此時內部病菌在維管束內擴散迅速，擴展後在病株莖杆上產生狹長稍凹陷的開裂狀條斑，使病部增粗，產生氣生根，並向病莖部上下擴散。發病後期病株莖杆出現狹長的褐色條斑，上下擴展，莖杆增粗，呈現出黃綠相間凹陷斑。溼度大時，可見菌膿從病莖或葉柄中溢出，呈白色汙狀物，後期莖內變褐並中空，沿凹陷處枯黃開裂。主莖上常產生大量氣生根。幼苗被害，皺縮滯育、畸形，受害果實出現白色圓形小點，後變黃褐色，病斑中央粗糙突起，四周有白色暈圈，呈「烏眼狀」。莖杆潰瘍和果實的斑點往往不在同一植株上出現。「烏眼斑」是病果的一種特異症狀，由在侵染引起，不一定與莖部系統浸染同發一株。建立番茄潰瘍病菌快速、有效的檢測方法，對密執安棒桿菌的防治非常重要。現行的檢測方法主要包括傳統的鑑別培養方法和免疫學、分子生物學等發展較快的現代方法。免疫學方法經過近幾年不斷的研究改進可針對現場大量樣品快速篩查，具有簡單、快速、高靈敏度、高特異性、可同時篩查大量樣品的優點。用於樣品中密執安棒桿菌的單克隆抗體在特異性和靈敏度等方面仍需要進一步的完善，因此選擇適宜抗原製備高特異性、高靈敏度的單克隆抗體是非常必要的。本發明以密執安棒桿菌全菌為抗原免疫BALB C小鼠製備了該菌特異性單克隆抗體，並進行了鑑定，為番茄潰瘍病菌的進一步檢測奠定了基礎。
發明內容
本發明的目的在於避免現有技術的不足提供一種番茄潰瘍病菌單克隆抗體的製備方法。發明的又一目的提供一種番茄潰瘍病菌單克隆抗體的試劑盒和番茄潰瘍病菌單克隆抗體的試劑盒的使用方法。本發明的創新點在於運用單克隆抗體的原理和技術並加以改進，製備出番茄潰瘍病菌的特異性抗體，運用到植物病原的檢測上來，將B淋巴細胞分泌抗體的能力和腫瘤細胞無限增殖的能力相結合，用番茄潰瘍病的致病菌密執安棒桿菌免疫 BALB/C小鼠，以獲得可以分泌產生這種細菌抗體的特異性的B淋巴細胞，將此B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合，通過雜交瘤細胞的篩選，克隆化培養、單克隆抗體的製備與鑑定等一系列的實驗技術，製備出番茄潰瘍病菌的單克隆抗體。建立了一種將免疫學和分子生物學有機結合起來的檢測方法，檢測的準確性和靈敏度也大幅度提高，以克服傳統現有植物病原菌檢測方法靈敏性低、特異性差、檢測措施不得力的缺陷。為實現上述目的，本發明採取的技術方案為一種番茄潰瘍病菌單克隆抗體的製備方法，其主要特點是用密執安棒桿菌免疫BALB/C小鼠，以獲得分泌產生該種細菌抗體的特異性的B淋巴細胞，將此B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合，依次通過HAT、HT培養基篩選出針對番茄潰瘍病菌陽性的雜交瘤細胞， 用有限稀釋克隆的方法進行克隆化培養，通過雜交瘤細胞體內誘導腹水產生和體外培養， 製備大量單克隆抗體；進一步分離和純化單克隆抗體，得到單克隆抗體。所述的番茄潰瘍病菌單克隆抗體的試劑盒，包括有①包被緩衝液稀釋抗番茄潰瘍病菌的單抗100-150uL ；② 待測樣品包被酶標板lOOul，以雙蒸水為陰性對照；以CMM菌液IOOul為陽性對照；③洗板， PBST洗滌4次，每次aiiin ；④酶標抗體HRP羊抗鼠IgG，每孔IOOul ；⑤洗板，PBST洗滌4次， 每次aiiin;⑥加TMB為3'，3'，5'，5'，-四甲基聯苯胺顯色液，每孔IOOul。所述的番茄潰瘍病菌單克隆抗體的試劑盒的使用方法，用包被緩衝液將抗番茄潰瘍病菌的單抗作為一抗，稀釋至l-10ug/mL，在酶標板反應孔中加0. ImL ；然後加濃度為103_8cfu/mL稀釋的待檢樣品0. ImL,同時做空白對照，以雙蒸水為陰性對照；以CMM菌液IOOul為陽性對照；再加酶標抗體HRP羊抗鼠IgG ；再加底物液顯色；最後終止反應於各反應孔中加入終止液0. ImL ； 測0D450/630值，並計算P/N值，N為標準品對照孔的OD值，P為競爭抑制物的OD值；重複3次，以測定值大於2. 1者判定為陽性。酶標板分別用CMM(密執安幫桿菌)標準菌株和 CMT(小麥花葉病菌)、CMS(馬鈴薯環腐病菌)、CMI (苜蓿細菌性萎蔫病菌)、CMN(玉米高氏細菌萎蔫病菌)菌株倍比稀釋包被酶標板。本發明的有益效果本發明用番茄潰瘍病菌多次皮下免疫BALB/C小鼠，以獲得可以分泌產生這種細菌抗體的特異性的B淋巴細胞，將此B 淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合，通過HAT、HT培養基篩選雜交瘤細胞，篩選得到大量針對不同抗原或不同抗原表位的抗體，用有限稀釋克隆的方法進行克隆化培養，通過體內雜交瘤細胞誘導腹水的產生和體外凍存的方法大量製備單克隆抗體，同時由於單克隆抗體的均質性及易於大量生產，進而解決了抗體全部依賴進口，檢測成本高等問題，使免疫學檢測在番茄潰瘍病檢測中的運用得到普及，為番茄潰瘍病菌敏感、穩定和快捷的檢測提供必要的保證。
圖1單克隆抗體製備原理圖；圖2單克隆抗體製備流程圖；圖3純化菌液直接 PCR結果；圖4細胞融合後亞克隆過程中雜交瘤細胞生長情況；圖5體內誘生腹水法製備單克隆抗體；圖6單抗純度鑑定；圖7圖6單克隆抗體特異性鑑定。
具體實施例方式以下結合附圖對本發明的原理和特徵進行描述，所舉實例只用於解釋本發明，並非用於限定本發明的範圍。實施例1 一種番茄潰瘍病菌單克隆抗體的製備方法，其特徵是番茄潰瘍病病原菌為密執安棒形桿菌密執安亞禾中(Clavibactermi chiganensissubsp. michiganensis，Cmm)， 用密執安棒桿菌免疫BALB/C小鼠，以獲得可以分泌產生該種細菌抗體的特異性的B淋巴細胞，將此B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合，依次通過HAT、HT培養基篩選出雜交瘤細胞，用有限稀釋克隆的方法進行克隆化培養，通過雜交瘤細胞誘導腹水產生和體外培養，製備大量單克隆抗體。最後，進一步分離和純化單克隆抗體，鑑定單克隆抗體亞類，測定抗體親和力，效價等。(見圖1 2)製備特異性識別番茄潰瘍病菌的單克隆抗體，步驟如下1抗原製備 取Cmm菌株於523液體培養基(包括蔗糖10g、聚蛋白腖Sg、酵母粉4g、瓊脂18g、磷酸氫二鉀2g、結晶硫酸鎂0. 3g)中25 (最適溫度^°C)，振蕩培養18h，用接種環挑取密執安棒桿菌液在523固體培養基上劃線，28°C靜置培養48h ；用接種針將培養後長出的單個菌落挑取少許接種於523液體培養基中，置於恆溫振蕩器上振蕩培養15 18h，此時菌液0D600nm值為0.25(細菌約為108cfu/mL)收集菌體，進行菌落計數。用PCR對該菌進行鑑定，將該菌液分裝於IOmL離心管中離心，6000rpm、20min，棄去上清，加入適量生理鹽水， 混勻後再離心。同上操作三次後用生理鹽水將所得沉澱垂懸，調節濃度至2X109cfu/ml，無菌檢驗合格後做免疫抗原。(見圖3)2.動物免疫(1)取純化菌液與等量福氏完全佐劑混合乳化至滴入水中呈不分散狀時，以皮下四點免疫方法分別免疫4隻6 8周的BALB/C小鼠， 免疫劑量0.5mL/只(全菌3 X IO8Cfu/只)。首免21d後加強免疫，間隔14d追加免疫，直至間接ELISA檢測血清抗體效價達1 10000以上。首免用福氏完全佐劑乳化，以後用福氏不完全佐劑。融合前3d再衝擊免疫1次。(2)實驗所需溶液ELISA檢測用溶液(1)包被液稱取 NaHCO3 2. 93g, Na2CO3 1. 59g，加蒸餾水至 lOOOmL，調節 PH 值 9. 6，4°C保存。(2) PBS 緩衝液稱取 NaC18. Og, 4ΗΡ04 · 12H20。2. 9g，KCl 0. 2g，KH2PO4O. 2g，加蒸餾水至 IOOOmL,調節 PH7. 4。(3)洗滌液1000mL PBS 緩衝液，加 0. 5mL Tween-20。(4)底物緩衝溶液(TMB3， 3，5，5，_四甲基聯苯)購置北京天耕。( 終止液蒸餾水與濃硫酸按照1778 222比例混合，製得2M H2SO4溶液。單克隆抗體製備用溶液(1)雙抗溶液100mL雙餾水中加入青黴素80萬U、鏈黴素100萬U，0. 22 μ m濾膜過濾除菌。⑵不完全培養液PRMI_1640培養液(購於美國Sigma公司)1袋按照使用說明書稱取相應的藥品加超純水定容，0. 22 μ m濾膜過濾除菌。( 完全培養液不完全培養液和標準胎牛血清按照1 4的比例進行混合。 (4)HAT培養液(購於美國Sigma公司)完全培養液與HAT(購於美國Sigma公司)按照 49 1比例混合。(5)HT培養液(購於美國Sigma公司)完全培養液與HT按照49 1比例混合。 3.細胞融合將已製備好的SP2/0骨髓瘤細胞及脾細胞以1 5混合，1000r/min 離心5min，棄上清，用手指輕彈離心管，振散細胞團塊。將離心管傾斜，緩慢加入37°C預熱的PEG1500 (在30s內勻速加完0. 6mL, 1. 5min滴完，再作用90s，並輕輕吹打幾次)，再緩慢滴入1640基礎培養基10mL，輕輕轉動離心管將細胞懸起，1000r/min離心5min，同樣的方法再洗滌2次，徹底去除PEG。最後一次離心後棄上清，加入IOml的IXHT培養液輕輕將細胞懸起，滴入已準備好飼養細胞的96孔板中，每孔100 μ L，置37°C 5%的(X)2培養箱中培養。4.間接ELISA檢測方法的建立與陽性雜交瘤細胞株的克隆、篩選用倍比稀釋的方法測定免疫小鼠的多抗血清效價，在酶標板上做方陣點樣，根據反應結果確定抗原、抗體的最佳稀釋度，最適封閉液和封閉時間，包被溫度和時間。以標準菌株CMM作抗原篩選多抗血清和陽性雜交瘤細胞株，操作步驟如下CMM菌液包被酶標板，免疫小鼠多抗血清用保溫液 100X、200X、400X、800X、1600X ,3200X ,6400X、12800X 稀釋縱向加入，正常小鼠血清 1000X倍比稀釋作為陰性對照，二抗加1 8000稀釋的HRP標記羊抗鼠。待底物顯色適中，每孔滴加100 μ L終止液，酶聯檢測儀測定雙波長0D450630值。用建立的ELISA方法測定雜交瘤細胞培養上清效價，選擇效價高的細胞進行亞克隆。4次亞克隆後陽性率為100% 的細胞株擴大培養，然後細胞凍存。(見圖4)有限稀釋克隆方法(1)製備飼養層細胞取正常小鼠腹腔巨噬細胞，製成細胞懸液，接種96孔板，每孔0. Iml，含個細胞2 X IO4個細胞。 (2)吹打雜交瘤細胞培養板中孔內的克隆，懸浮於完全培養液中。(3)取樣，用血球計數板計數，調整細胞濃度至100、50、10個/ml. (4)分別用三種濃度的雜交瘤細胞濃度接種於含飼養細胞的培養板中，每孔0. lml，理論上每孔含10、5、1個細胞。(5)置37°C 5%的0)2培養箱中培養。培養5-7天取細胞上清進行抗體檢測。(6)對陽性單克隆再克隆化培養，直到100%的克隆分泌特異性抗體為止。5.單克隆抗體的大量製備選8 10周體重20g以上雌性BALB/C小鼠，採用動物體內誘生單克隆抗體的方法製備。將0. 5mL的石蠟油注射到小鼠腹腔1周後，將細胞注入經石蠟油處理過的小鼠腹腔，IO5Cfu/只。7 IOd後，當小鼠腹部極度膨脹時用無菌18號針頭抽取腹水。將收集好的腹水置37°C 2h，隨後置4°C過夜， 第2d將腹水lOOOr/min離心lOmin，20°C冰箱保存備用。(見圖5)6.單克隆抗體鑑定6. 1 單克隆抗體效價測定將單克隆抗體倍比稀釋，用建立的ELISA方法測定純化後腹水中的抗體效價，以待測孔的OD值大於或等於陰性對照孔的2. 1倍者判為陽性，以判為陽性的最高稀釋倍數為效價判定終點效價。試驗重複3次，計算平均值。6. 2單克隆抗體的亞類鑑定及純化按亞類測定試劑盒說明書測定單抗亞型。IgG採用辛酸=飽和硫酸銨法進行純化，純化的腹水IgG進行12% SDS-PAGE電泳測定抗體分子量，具體操作參照《分子克隆實驗指南》，參考抗體的含量測定採用雙波長紫外分光光度法。(見圖6)6. 3單克隆抗體的親和力測定採用間接ELISA法。CMM菌液包被酶標板，用純化的單克隆抗體倍比稀釋進行間接 ELISA檢測，繪製反應曲線。以曲線上趨於平坦段的最大0D490值一半時的抗體濃度計算單克隆抗體的親和常數，確定抗體與抗原的結合能力。6. 4雜交瘤細胞染色體的計數採用秋水仙素阻斷法檢測雜交瘤細胞染色體的平均數目。6. 5、單克隆抗體特異性檢測酶標板分別用CMM標準菌株和CMT、CMS、CMI, CMN等菌株倍比稀釋包被酶標板，然後按間接ELISA操作程序加單克隆抗體及HRP-羊抗鼠IgG，測定0D450/630值，並計算P/N值(N為標準品對照孔的OD值，P為競爭抑制物的OD值)。重複3次，以測定值大於2. 1者判定為陽性。實施例2 番茄潰瘍病菌單克隆抗體的試劑盒，其主要特點是包括有①包被緩衝液稀釋抗番茄潰瘍病菌的單抗100-150uL ；②待測樣品包被酶標板lOOul，以雙蒸水為陰性對照；以CMM 菌液IOOul為陽性對照；③洗板，PBST洗滌4次，每次aiiin ；④酶標抗體HRP羊抗鼠IgG， 每孔IOOul ；⑤洗板，PBST洗滌4次，每次aiiin ；⑥加TMB (3，3，5，5，-四甲基聯苯)顯色液，每孔lOOul。實施例3 番茄潰瘍病菌單克隆抗體的試劑盒的使用方法，用包被緩衝液將抗番茄潰瘍病菌的單抗作為一抗，稀釋至Ι-lOug/mL，在酶標板反應孔中加0. ImL ；然後加一定濃度(IO3-8CfuAiL)稀釋的待檢樣品0. ImL,同時做空白對照，陰性對照及陽性對照； 再加酶標抗體HRP羊抗鼠IgG ；再加底物液顯色；最後終止反應於各反應孔中加入終止液 0. ImL ；測0D450/630值，並計算P/N值，N為標準品對照孔的OD值，P為競爭抑制物的OD 值；重複3次，以測定值大於2. 1者判定為陽性。實施例4 對番茄潰瘍病菌和非番茄潰瘍病菌菌株特異性性驗證試驗(見圖7)收集1株番茄潰瘍病菌(Clavikicter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm)和4株非番茄潰瘍病菌菌株驗證本試劑盒的特異性，這4株病菌分另 1J為玉米高氏細菌萎蔫病菌:Clavibacter michiganensis subsp, nebrakensis (CMN) 小麥花葉病菌 :Clavibacter michiganensissubsp，tessellarius (CMT)馬鈴暮環腐病菌 Clavibacter michiganensissubsp, sepedonicum(CMS) "猜細菌t生妻薦病菌:Clavibacter michiganensissubsp，insidisus (CMI)。將 CMM、CMN、CMS、CMT、CMI 菌液各 100 μ L(濃度為108Cfu/mL)，包被酶標板；置於96孔酶標板中，37°C孵育池後4°C過夜，然後棄去96孔酶標板內的檢測樣品，用PBST衝洗2-3次，然後用10%的BSA(小牛血清)封閉，37°C，1. 5h ； 免疫小鼠雜交瘤細胞血清用保溫液100 X、200 X、400 X、800 X、1600 X、3200 X、6400 X、 12800X稀釋縱向加入，正常小鼠血清1000X倍比稀釋作為陰性對照，37°C，lh，用PBST衝洗2-3次；二抗加1 8000稀釋的HRP標記羊抗鼠100 μ L，37°C，lh，用PBST衝洗2-3次; 然後加TMB顯色液，100 μ L，15-30min,室溫；待底物顯色適中，每孔滴加100 μ L終止液，酶聯檢測儀測定0D630值。實驗結果表明，本抗體和其它4種菌株交叉反應不明顯，說明對番茄潰瘍病菌具有較高的特異性。以上所述僅為本發明的較佳實施例，並不用以限制本發明， 凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種番茄潰瘍病菌單克隆抗體的製備方法，其特徵是用密執安棒桿菌免疫BALB/C 小鼠，以獲得分泌產生該種細菌抗體的特異性的B淋巴細胞，將此B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合，依次通過HAT、HT培養基篩選出針對番茄潰瘍病菌陽性的雜交瘤細胞，用有限稀釋克隆的方法進行克隆化培養，通過雜交瘤細胞體內誘導腹水產生和體外培養，製備大量單克隆抗體；進一步分離和純化單克隆抗體，得到單克隆抗體。
2.如權利要求1所述的番茄潰瘍病菌單克隆抗體的試劑盒，其特徵是包括有①包被緩衝液稀釋抗番茄潰瘍病菌的單抗100-150uL ；②待測樣品包被酶標板lOOul，以雙蒸水為陰性對照；以CMM菌液IOOul為陽性對照；③洗板，PBST洗滌4次，每次^iin ；④酶標抗體 HRP羊抗鼠IgG，每孔IOOul ；⑤洗板，PBST洗滌4次，每次aiiin;⑥加TMB為3'，3'，5'， 5'，-四甲基聯苯胺顯色液，每孔lOOul。
3.如權利要求2所述的番茄潰瘍病菌單克隆抗體的試劑盒的使用方法，其特徵是用包被緩衝液將抗番茄潰瘍病菌的單抗作為一抗，稀釋至Ι-lOug/mL，在酶標板反應孔中加 0. ImL ；然後加濃度為103_8cfu/mL稀釋的待檢樣品0. ImL,同時做空白對照，以雙蒸水為陰性對照；以CMM菌液IOOul為陽性對照；再加酶標抗體HRP羊抗鼠IgG ；再加底物液顯色；最後終止反應於各反應孔中加入終止液0. ImL ；測0D450/630值，並計算P/N值，N為標準品對照孔的OD值，P為競爭抑制物的OD值；重複3次，以測定值大於2. 1者判定為陽性。
全文摘要
本發明涉及一種高特異性、高靈敏性檢測引發番茄潰瘍病的密執安棒桿菌的單克隆抗體，屬於植物檢疫和植物保護領域，專一針對番茄潰瘍病菌的檢測。一種番茄潰瘍病菌單克隆抗體的製備方法，其主要特點是用番茄潰瘍病菌免疫BALB/C小鼠，以獲得分泌產生該種細菌抗體的特異性的B淋巴細胞，將此B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合，依次通過HAT、HT培養基篩選出雜交瘤細胞，用有限稀釋克隆的方法進行克隆化培養，通過雜交瘤細胞誘導腹水產生和體外培養，製備大量單克隆抗體；進一步分離和純化單克隆抗體。
文檔編號C07K16/12GK102206274SQ201110068329
公開日2011年10月5日 申請日期2011年3月22日 優先權日2011年3月22日
發明者劉箐, 孔君, 熊亮斌 申請人:上海慧耘生物科技有限公司