吉西他濱醯胺前體藥物的結晶形式、其組合物以及用途的製作方法

2023-05-21 12:01:36 5

專利名稱：：吉西他濱醯胺前體藥物的結晶形式、其組合物以及用途的製作方法吉西他濱醯胺前體藥物的結晶形式、其組合物以及用途
背景技術：
：本發明涉及吉西他濱的新的前體藥物，其能被口服給予，基本完整地穿過腸道進入到肝門血流中，與母體藥物相比，其胃腸道毒性較低且生物利用度更高，並且在較低劑量下維持了母體藥物的功效。鹽酸吉西他濱(2'，2'-二氟-2'-脫氧胞苷鹽酸鹽)是已知具有抗病毒作用的抗腫瘤藥，其目前以Gemzar⑧的形式被製造和銷售；Gemzar⑧是用於治療各種癌症的冷凍乾燥的粉末製劑。在US專利5，464，826和US專利4，808，614中對Gemzar⑧、其製備方法和使用方法進行了描述。Gemzar⑧目前被批准用於治療胰腺癌、乳癌和非小細胞肺癌(NSCLC)，並且正在對其對卵巢癌的作用進行評估。此外，Gemzar⑥還可用於治療HCV和作為免疫功能的調節劑(見US專利6，555，518)。Gemzar目前通過靜脈內輸液的方式以大約1000至1250mg/ii^的劑量歷經30分鐘施用，每周一次地施用長達7周，然後是l周不進行治療的休息期。吉西他濱的口服生物利用度差限制了其口服用途，其口服生物利用度差是由首過代謝所導致的。ShipleyLA.等人，"吉西他濱和溶瘤細胞的脫氧胞苷類似物在小鼠、大鼠和犬中的代謝和分配(Metabolismanddispositionofgemcitabine,andoncolyticdeoxycytidineanalog,inmice,rats,anddogs)".Z)r"gAfe似^/Zs附在Z)&/;owft》w.20(6):849-55，1992。此外，當淨皮口服施用時，吉西他濱會引起不利的限制劑量的腸損害，這種損害的特徵為在以167、333或500mg/kg的單一口服劑量(管飼法)使用吉西他濱的小鼠中引起整個長度的腸道內中等至顯著的黏膜上皮喪失(萎縮性腸病)。HortonND等人，"單劑量口服吉西他濱在小鼠體內的毒性(Toxicityofsingle-doseoralgemcitabineinmice)",美國癌症研究協會(AmericanAssociationforCancerResearch),宣傳單，奧蘭多，FL，2004年3月27-31日。在以前進行的小鼠研究中，通過靜脈內施用相當的劑量沒有導致死亡或胃腸毒性。製備吉西他濱前體藥物和緩釋製劑的方法在現有技術中是眾所周知的。在WO04/0412303"吉西他濱前體藥物、其藥物組合物以及用途，，(GemcitabineProdrugs,PharmaceuticalCompositionsandUsesThereof),Gall叩等人；WO98/32762"吉西他濱衍生物"(GemcitabineDerivatives),Myhren，Finn等人；WO02/09768"治療性聚酯和聚醯胺"(Therapeuticpolyestersandpolyamides)，Uhrich，KathrynE.;WO02/76476"以取代的芳族酸為基f出的抗癌藥的前體藥物"(Prodrugsofanticanceragentsbasedonsubstitutedaromaticacids),Greenwald，RichardB.等人；WO02/65988，"作為前體藥物的末端分支的高分子連接物和高分子軛合物"(Terminally-branchedpolymericlinkersandpolymericconjugatesasprodrug),Choe，YunHwang等人中可以找到該類前體藥物和緩釋製劑的實例。的中間體，參見例如Britton等人，US專利5,420,266和Grindey等人，US專利5，464，826，並且其還可用作用於施用吉西他濱的前體藥物部分，參見例如Gallop等人，WO04/041203。仍然需要允許口服傳遞、能在基本不降解的情況下完整地穿過腸道並以可接受的安全性和功效將吉西他濱傳遞到受累區的吉西他濱前體藥物。我們令人吃驚地發現了吉西他濱醯胺衍生物的新的結晶形式，其基本完整地穿過腸上皮細胞；在沒有顯著聚集脫氧二氟尿苷(dFdU，吉西他濱在肝中的主要代謝物)的情況下被水解為吉西他濱，毒性比口服吉西他濱低，並且當被口服施用時維持了適當的功效和安全性。發明簡述在一方面，本發明提供了結晶l-(2,2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧吱-2-酮單對甲糾酸鹽。本發明還提供了包含結晶l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮單對甲苯磺酸鹽以及一種或多種可藥用賦形劑的藥物組合物。5本發明還提供了結晶l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-1-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮單對甲糾酸鹽在需要該類治療的哺乳動物中治療易受影響的腫瘤中的用途。本發明還提供了結晶l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮單對甲^t酸鹽在需要該類治療的哺乳動物中治療易受影響的病毒感染中的用途。本發明還提供了結晶l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-1-氧代戊基)氨基嗜啶-2-酮單對曱苯磺酸鹽在製備用於治療易受影響的肺瘤或病毒感染的藥物中的用途。本發明還提供了結晶l-(2,2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-1-氧代戊基)氨基嘧咬-2-酮單對甲苯磺酸鹽的製備方法。在第二方面，本發明提供了結晶l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮半苯磺酸鹽半水合物。本發明還提供了包含結晶l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮半苯磺酸鹽半水合物以及一種或多種可藥用賦形劑的藥物組合物。本發明還提供了結晶l-(2，2-二氟-2-脫氧-|3-0-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-1-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮半苯磺酸鹽半水合物在需要該類治療的哺乳動物中治療易受影響的腫瘤中的用途。本發明還提供了結晶l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-1-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮半苯磺酸鹽半水合物在需要該類治療的哺乳動物中治療易受影響的病毒感染中的用途。本發明還提供了結晶l-(2，2-二氟-2-脫氧-p-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-1-氧代戊基>11基嘧咬-2-酮半苯磺酸鹽半水合物在製備用於治療易受影響的腫瘤或病毒感染的藥物中的用途。此外，本發明還提供了結晶1-(2，2-二氟-2-脫氧-|3-0-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮半苯磺酸鹽半水合物的製備方法。發明詳述本文所用的術語具有下文所示的含義。術語"哺乳動物"指特徵為在皮膚上覆蓋有毛髮並且在雌性中具有用於哺育幼體的產乳乳腺的哺乳綱的各種溫血脊稚動物中的任何一種，最優選是人。術語"可藥用賦形劑"指藥學上可接受的製劑用載體、溶液或用於增強該製劑特性的添加劑。該類賦形劑必需與所述製劑的其它成分相容並且對其領受者無害，它們是本領域技術人員眾所周知的，參見例如《雷氏藥物科學》"Je附/"gtows屍/mr附flce"riai/5Wewces"，第19版，馬克(Mack)出版/>司，1995。術語"基本上純的"指包含約卯％以上的所需結晶形式、優選約95%以上的所需結晶形式的化合物的純的結晶形式。術語"易受影響的腫瘤"指能通過口服施用式I化合物來進行治療的哺乳動物組織的異常生長。因為這種前體藥物將水解成吉西他濱，因此預期施用所述前體藥物將具有對抗許多種類的腫瘤(實體瘤和非實體瘤)的廣譜活性。易受影響的腫瘤優選包括T-細胞淋巴瘤、軟組織肉瘤、胰腺癌、乳癌、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌和膀胱癌。本發明的化合物可用於治療病毒感染，特別是HCV。術語"治療有效量"指將引起研究者、主治醫師或臨床醫師所尋求的所需的組織、系統或哺乳動物的生物學或醫學響應的化合物/組合物的量。吉西他濱包含三個可被衍生的官能團，即3，和5，羥基以及N4-氨基。l-(2，2-二氟-2-脫氧-(3-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮可以通過用適宜的保護基阻斷3，和5'羥基官能團、然後將N4-氨基醯化來進行製備。典型的保護基是眾所周知的並且可以從現有技術《有機合成中的保護基》(ProtectingGroupsinOrganicSynthesis,第3版，TheodoraGreene,PeterWuts(威利國際科學公司(Wiley-Interscience))，1999)中獲知。N4-tJ^的醯化可以通過與醯氯或酸酐進行反應或者通過與羧酸在偶聯劑如N，N-二環己基碳二亞胺(DCC)、N-乙基-N，-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)、l，l-羰基二咪唑(CDI)或有機化學領域技術人員眾所周知的其它相似試劑的存在下進行反應來完成。或者，式I化合物可以在不使用保護基的情況下來進行製備。在這種情況中，將形成單-、二-和三-加合物的混合物並且可以從該混合物中分離出所需的產物。下文的操作和實施例進一步解斧說明了本發明的結晶物質的合成。所有起始材料和試劑在現有技術中都是眾所周知的，可以容易地獲得或者用本文所述的方法製得。例如，在美國專利4,808,614中公開了製備吉西他濱(2'，2'-二氟-2'-脫氧胞苷)的方法。l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮的製備在氮氣下，在攪拌下將2',2'-二氟-2'-脫氧胞苷(10.0g，38.0mmol)溶於無水吡啶(100mL)中並冷卻至0°C。滴加三甲基氯珪烷(24.0mL，190.0mmo1)，維持其內部溫度<5。〇。於0。C繼續攪拌2小時。在另一個燒瓶中，將2-丙基戊酸(6.0g，41.8mmol)溶於無水乙腈(100mL)中。歷經30分鐘分小批加入1，l-g二咪唑(6.8g，41.8mmol)並攪拌2小時。於0。C將該乙腈溶液滴加至吡啶溶液中，偵反應物達到環境溫度。將反應物於45。C加熱過夜，然後冷卻至30-35。C，向其中加入100mL無水乙醇，於45。C加熱30分鐘。加入50mL水，於45。C加熱5小時，然後冷卻至環境溫度，在真空中濃縮。將殘餘物粗品在乙酸乙酯和7JC之間進行分配。用磷酸將其酸化至pH-2，分離出有機層。用另外的乙酸乙酯對水層進行反萃取。合併有機溶液，用飽和碳酸氫鈉溶液和飽和氯化鈉溶液洗滌，用硫酸鎂乾燥，在真空中濃縮。通過採用30%至60%乙酸乙酯的二氯甲烷溶液梯度洗脫的矽膠色語法(120g)進行純化。分離出所需的產物，為白色可壓碎的泡沫形式(11.2g，收率為77%)。MS(ES):iw/z3卯.3=[M+H]+8MS(ES):m/z388.3=M-H十'HNMR(400MHz，DMSO-d6)60.83(t，6H)，1.151.36(m，6H)，1.46-1.55(m，2H)，2.60(dddd，1H，J=14.4，9.6，5.6，5.6Hz)，(ddd，1H，J=12.6，6.2，3.6Hz)，3，77曙3.81(m，1H)，3,87(dt，1H，J=8.4，3.0Hz)，4.12-4.22(m,1H)，5.27(t，1H，J=5.6Hz)，6.15(t，1H，J=7.4Hz)，6.29(d，1H，J=6.4Hz)，7.31(d，1H，J=7.2Hz)，8.23(d，1H，J=8.0Hz)，11.03(s,1H)。pH化學穩定性試驗用半自動HPLC技術對pH化學穩定性進行評估。以100mcg/mL的濃度在代表整個胃腸道pH範圍(pHl-pH8)的五種緩衝液中製備l-(2，2-二氟-2-脫氧-0-0-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮的樣品。將這些樣品負栽到在40。C下恆溫的HPLC自動進樣器上。以1小時的間隔將樣品重複注射到具有將式I化合物與吉西他濱分離開的HPLC柱的HPLC上，持續24小時。通過UV檢測來監測l-(2，2-二氟-2-脫氧-(3-D-吹喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嗜啶-2-酮的峰面積隨時間的變化並將其與最初的峰面積進行比較以確定其穩定性。在4小時後，在1至8的pH範圍內，低於25%的l-(2，2-二氟-2-脫氧-(3-0-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮降解成吉西他濱。藥物動力學試驗小鼠藥物動力學在以所選擇的包含大約10mg/kg吉西他濱的劑量口服施用後，用雄性CD-1小鼠對吉西他濱和l-(2，2-二氟-2-脫氧-(3-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮的藥物動力學性質進行評估。在給藥後第0.08、(U5、0.5、1、2和6小時將指定的動物(11=3/時間點/化合物)處死並將全身的血樣收集到經EDTA處理的包含用於抑制吉西他濱進一步代謝的四氫尿苷(在血液中的終濃度為0.5mM)的試管中。在第0.08小時另外處死3隻動物，收集其肝門血液。通過離心對血漿進行分離並在進行分析前將其冷凍。用LC/MS/MS分析測定吉西他濱和前體藥物的血漿濃度。用WinNonlin軟體(法賽特公司(PharsightCorp.),MountainView,CA)計算藥物動力學參數。將各前體藥物的藥物動力學參數與相似研究方案中由口月l施用鹽酸吉西他濱測得的這些藥物動力學參數進行比較。當被口服施用於CD-1小鼠時，l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)^嘧啶-2-酮在體內被廣泛水解，從而釋放出吉西他濱。與直接口服施用鹽酸吉西他濱相比，當施用l-(2,2-二氟-2-脫氧曙P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基畫l-氧代戊基)氨基嘧咬-2-酮時CD-1小鼠血漿中出現的吉西他濱增加。通過其在口服給藥後第0.08小時在肝門血漿中相對較高的濃度證明了完整前體藥物的吸收。猴子藥物動力學試驗在以交叉設計口服施用和靜脈內施用後，在食蟹猴中對吉西他濱和l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮的藥物動力學性質進行評估。以所選擇的包含約10mg/kg吉西他濱的劑量將這些化合物進行施用。以指定的時間間隔將血樣收集到經EDTA處理的包含四氫尿苷(在血液中的終濃度為0.5mM)的試管中，收集48小時。在口服施用期間，將動物用雷尼替丁(靜脈內施用，5mg/kg)進行預處理。通過離心收集血漿，並在進行分析之前將其冷凍。用LC/MS/MS分析確定吉西他濱和l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮的血漿濃度。用WinNonlin軟體(法賽特乂^司，MountainView,CA)測定藥物動力學參數。當被靜脈內施用於食蟹猴時，l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)M嘧咬-2-酮在體內被廣泛水解，從而釋放出吉西他濱。與直接口月Mfe用鹽酸吉西他濱相比，當口服施用l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮時食蟹猴體內出現的吉西他濱增加大約5倍。水解試驗小腸勻漿試驗為了確定l-(2，2-二氟-2-脫氧-(3-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)10氨基嘧咬-2-酮對腸內酶水解的穩定性，用得自CD-1小鼠、比格犬、食蟹猴和人的小腸上部的切片製備小腸上皮細胞的粗勻漿。小鼠和狗的勻漿是由新收集的組織製得的，而猴子和人的勻漿是由之前冷凍的組織製得的。將細胞輕輕從小腸切片上刮下來，匯集並用Polytron(PT-10-85)將其在50mM醋酸鹽緩衝液中進行勻漿。用標準分光光度技術對蛋白質濃度進行測定。將製得的勻漿於-7(TC儲存備用。通過將式I化合物(IOOuM)和SIH(2.5-5mg/mL總蛋白)一起在pH7.5的醋酸鹽中培養6小時測定l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-1-氧代戊基)氨基嘧咬-2-酮在小腸勻漿(8111)中的水解速率。在用乙腈將該反應物淬滅後，用LC/MS分析測定通過水解釋放的吉西他濱濃度。在篩選實驗的30分鐘時，由1-(2,2-二氟-2-脫氧-卩-0-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-1-氧代戊基)氨基嘧咬-2-酮特性研究中的水解-時間曲線的線性部分的斜率計算出水解速率。l-(2，2-二氟-2-脫氧-!3-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮在小腸勻漿試驗中表現出緩慢的水解速率。其在猴子和人勻漿中水解最慢，在培養6小時時全部化合物有3。/。以下轉化為吉西他濱。肝S9水解試驗通過肝水解試驗測定肝酶對l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D曙呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧咬-2-酮的水解。製備CD-1小鼠、比格犬、食蟹猴和人肝臟的肝勻漿。用剪刀將肝組織剪成小塊，然後，用Polytron(PT-10-85)將其在50mM醋酸鹽緩衝液中勻化1分鐘。通過在9,000xg下在4。C超速離心10分鐘，由各勻漿製得線粒體後的(Post-mitochondrial)(S9)部分。小鼠、狗和猴子的肝臟S9部分是由新收集的組織製得的，而人肝臟S9是由之前冷凍的組織製得的。在離心後，收集上清液並用標準分光光度技術測定蛋白質濃度。將製得的S9級分於-70。C儲存備用。通過將化合物(10uM)和S9(2mg/mL總蛋白)一起在磷酸鹽緩衝鹽水(pH8.0)中一起培養6小時來測定l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧咬-2-酮在肝S9中的水解速率。在用乙腈將該反應物淬滅後，用LC/MS分析測定通過水解釋放出來的吉西他濱濃度。在篩選實驗的30分鐘時，由1-(2，2-二氟-2-脫氧-^0-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧咬-2-酮特性研究中的水解-時間曲線的線性部分的斜率計算出水解速率。l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮在所述所有種屬的肝S9中都被水解。其在猴子和人勻漿中的水解最快，在培養6小時時全部化合物有大約35%轉化為吉西他濱。毒理學試驗4-天小鼠篩選為了對每天給雌性CD-a小鼠口服施用l-(2，2-二氟-2-脫氧-(3-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氮基嘧咬-2-酮達4天所產生的毒性進行評估，將1-(2，2-二氟-2-脫氧-^0-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-1-氧代戊基)氨基嘧咬-2-酮的胃腸毒性與在4-天小鼠研究中將吉西他濱以8mg/kg的劑量口服施用時曾獲得的胃腸毒性結果進行比較。通過口服管飼法給5-8周齡的雌性CD-l小鼠施用l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧咬-2-酮。所選擇的劑量水平接近8-mg/kg吉西他濱的摩爾當量。所用的給藥體積為10mL/kg，每天施用一次，連續施用4天。在第4次施用後約5-8小時進行屍體剖檢。對臨床跡象、臨床化學、大體病理學和有限的組織病理學(迴腸、空腸和肝)進行評估。與吉西他濱HC1相比，在用等劑量l-(2,2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧咬-2-酮對小鼠進行給藥後，觀察到萎縮性腸變化或腸病的嚴重程度顯著降低。14天小鼠研究進行14-天小鼠研究來評估口服管飼給藥14天後l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮是否會產生不利作用和測定在第l或第14次給藥後l-(2，2-二氟-2-脫氧-(3-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氛基嘧咬-2-酮以及其代謝物吉西他濱HC1和脫氧二氟尿苷的血漿濃度。通過口服管飼法給用9-12周齡的雄性和雌性CD-1小鼠施用l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮。對劑量範圍進行選擇以確定最大耐受劑量和劑量限制性毒性。所用的給藥體積為10mL/kg,每天施用一次。對臨床跡象、體重、食物消耗、血液學、臨床化學、l-(2，2-二氟-2-脫氧-^0-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮以及代謝物吉西他濱HC1和脫氧二氟尿苷的血漿濃度和病理學(包括大體病理學、器官重量和病理組織學)進行了評估。以摩爾當量為J^，l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氛基嘧啶-2-酮所伴有的腸病低于吉西他濱HC1，而藥物的系統濃度大約是吉西他濱HC1的2倍。7-天狗研究為了對給比格犬施用l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-1-氧代戊基)氨基嘧咬-2-酮達7天所產生的毒性進行評估以及為了確定給予1或7個劑量後l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧咬-2-酮以及代謝物吉西他濱HC1和脫氧二氟尿苷的血漿濃度，進行了一項7天狗研究。給6-48月齡的雄性和雌性比格犬經膠嚢口服施用l-(2，2-二氟-2-脫氧-(3-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧咬-2-酮。對劑量範圍進行選擇以確定最大耐受劑量和劑量限制性毒性。所用的給藥體積為lmL/kg，每天施用一次。對臨床跡象、體重、食物消耗、體溫、血液學(包括凝血)、臨床化學、尿分析、l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮以及其代謝物吉西他濱HC1和脫氧二氟尿苷的血漿濃度和病理學(包括大體病理學、器官重量和病理組織學)進行了評估。血液毒性以及其它毒性(包括GI毒性)與之前所述的胃腸道外施用吉西他濱的毒性相一致。因此，這些毒性都不是所述口服給藥途徑所特有的。體內試驗使HCT-116結腸腫瘤細胞在標準組織培養條件下進行體外生長，收穫，洗滌，將5xio6個細胞(在基質膠(Matrigel)中的1:1混懸液，CollaborativeBiomedicalProducts,Inc)皮下注射到雌性棵鼠(CharlesRiver,CD1nu/nu，24-27g，在移植的24小時內用450Rads進行輻射)的背側脅腹中。使腫瘤生長至約lOOmm3，然後開始進行治療。在各實驗中，在所示的時間用口服管伺法將基質對照、各劑量水平的l-(2，2-二氟-2-脫氧-!3-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧咬-2-酮或吉西他濱-HCl施用於小鼠(10mL/kg體積)。將化合物每天施用一次共計14天、每隔一天施用一次共計7次劑量或者每三天施用一次共計4次劑量。對於每天施用的給藥方案而言，將l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮在100mM磷酸鈉緩衝液(pH6.0)中進行配製，對於每隔一天和每三天施用的給藥方案而言，在1%羧甲基纖維素鈉、0.5%月桂硫酸鈉、0.05%消泡劑150和0.085%聚維酮中進行配製。吉西他濱-HCl在生理鹽水進行配製用於口服施用。通過卡鉗測量來測定腫瘤大小，腫瘤體積(mm、由公式/x^x0,536來估算，其中/是垂直直徑中的較長者，w是垂直直徑中的較短者。從開始治療開始，所有數據(腫瘤測量和動物體重)每周採集兩次，採用基於計算機的腫瘤測量系統對其進行分析。用l-(2，2-二氟-2-脫氧-卩-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮觀察到的抗腫瘤效力與等劑量吉西他濱-HCl獲得的結果相當。但是，與接受等量吉西他濱-HCl的動物相比，用l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-吹喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮進行治療所產生的總體毒性較低。實施例1結晶l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧咬曙2-酮單對曱^t酸鹽於室溫將l-(2,2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧澱-2-酮(400mg，1.03mmol)溶於乙酸異丙酯(5mL)中。向溶液中加入對曱笨!黃酸一水合物(195mg，1.03mmo1)。完全溶解後，立即出現白色固體沉澱。將漿狀液攪拌10分鐘。通過真空過濾將固體產物濾出，用甲醇(lmL)洗滌，空氣乾燥，得到標題化合物(392mg，68。/。)。X-射線粉末衍射採用裝配有CuKa源(^=1.54056A)於40kV和50mA操作的D4Endeaver衍射計進行X-射線粉末衍射分析。在3°至40°的20範圍掃描樣品，20的步長為0.009。，掃描速率為^3秒/步。樣品位移誤差可以採用NIST標準SRM675(在加為8.ss。的標準峰)校正。結晶形式的確定可以根據特徵峰(29的單位為。)、通常是更顯著的峰的任意獨特的組合進行。結晶l-(2，2-二氟-2-脫氧-(3-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-1-氧代戊基)氨基嘧咬-2-酮單對甲笨璜酸鹽以具有20值為4.86。的特徵峰或者通過26為4.86、9.76和16.86°的峰的X-射線粉末衍射模式表徵。所有衍射角以0.1度的容許量(tolerance)表示。表l:結晶l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮單對甲笨璜酸鹽的X-射線粉末衍射(CuKa放射源，1=1.54056A)峰tableseeoriginaldocumentpage15固態13CNMR光i普法採用70kHz雙脈衝調相制質子去耦、62kHz傾斜振幅(ramped-amplitude)交叉極化和10.0kHz幻角自旋(MAS)，用於100.578MHz碳頻(carbonfr叫uency)操作的VarianUnityInova400MHz光i普儀進行固態"CNMR光鐠法(SSNMR)分析。取數參數如下90質子r.f.脈衝寬度4.0s，接觸時間5.0ms，脈衝重複時間20s，語寬50kHz,取數時間50ms。以ppm表述的化學位移通過樣品置換參考六甲基苯的甲基(=17.3ppm)。幻角(magicangle)通過如Frye和Maciel(FryeJ.S.和MacielG.E.，/Mflgrt./^^".，1982，48，125)所述將KBr的"Br信號的邊帶最優化來調整。結晶l-(2,2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)M嘧咬-2-酮單對甲苯磺酸鹽可以通過13CSSNMR光譜法通過在如下化學位移存在各向同性"C峰來鑑別15.7、20.9、22.3、35.3、38.1、48.9、57.4、67.5、82.5、85.8、98.7、121.0、140.6、143.5、146.4、152.5、159.6和182.2ppm。因此，結晶l-(2，2-二氟-2-脫氧-(3-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)絲嘧啶-2-酮單對甲苯磺酸鹽以具有如下特徵化學位移的SSNMR光鐠來表徵152.5、159.6和182.2ppm。所有化學位移以士O.lppm的精確度表示。結晶l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)M嘧咬-2-酮單對甲苯磺酸可以經口服利用並且通常經口服施用，因而口服施用是優選的。實施例2結晶l-(2，2-二氟-2-脫氧-(3-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮半苯磺酸鹽半7K合物於室溫向l-(2，2-二氟-2-脫氧-(3-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)^jL嘧咬畫2-酮(109mg，0.28mmol)和^^酸(22mg，0.14mmol)在甲醇(lmL)中的溶液中加入己烷(6mL)。將溶液蒸發至幹。然後將殘餘物混懸於己烷(2mL)中並攪拌。通過真空過濾分離出固體產物，空氣乾燥。產率-91mg(68%)。X-射線粉末衍射採用裝配有CuKa源(1=1.54056A)於40kV和50mA操作的D4Endeaver衍射計進行X-射線粉末衍射分析。在3°至40°的20範圍掃描樣品，20的步長為0.009。，掃描速率為^3秒/步。樣品位移誤差可以採用NIST標準SRM675(在26為8.85。的標準峰)校正。結晶l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮半笨璜酸鹽半7jC合物可以通過如表2所述的採用CuKa放射的X-射線衍射模式來鑑別。結晶l-(2，2-二氟-2-脫氧-(3-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氣基嘧梵-2-酮半苯磺酸鹽半水合物以具有29值為5.22。的特徵峰或者通過20為5，22和7.33°的峰的X-射線粉末衍射模式表徵。所有衍射角以0.1度的容許量表示。表2:結晶l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嗜啶-2-酮半苯磺酸鹽半水合物的X-射線粉末衍射(CuKa放射源，^=1.54056A)峰2-e角(±0.01。)d-間if巨(埃)5.21816.927.32612.0612.0127.3613.0856.7613.3616.6213.8796.3816.5265.3617.2355.1417.4145.0917.6845.0117.8984.9518.4444.8121.3944.15固態13CNMR光i普法採用70kHz雙脈沖調相制質子去耦、62kHz傾斜振幅交叉極化和10.0kHz幻角自旋(MAS)，用於100.578MHz碳頻操作的VarianUnityInova400MHz光鐠儀進行固態13CNMR光譜法(SSNMR)分析。取數參數17如下卯質子r.f.脈衝寬度4.0s，接觸時間5.0ms，脈衝重複時間20s，語寬50kHz,取數時間50ms。以ppm表述的化學位移通過樣品置換參考六甲基苯的甲基(-17,3ppm)。幻角通過如Frye和Maciel(FryeJ.S.和MacidG.E.，/Mflgw.及mow,，1982，48，125)所述將KBr的79Br信號的邊帶最優化來調整。結晶l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧咬-2-酮半笨璜酸鹽半7JC合物可以通過在如下化學位移存在各向同性13CSSNMR峰來鑑別:14.4、15.4、21.8、34.9、36.3、47.1、49.1、58.0、68.3、82.7、97.6、99.9、121.1、126.1、127.9、130.5、144.3、147.5、149.7、156.9、163.3、176.9和177.8ppm。因此，結晶l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮半苯磺酸鹽半水合物以具有如下特徵化學位移的SSNMR光語來表徵156.9、163.3、176.9和177.8ppm。所有化學位移以士O.lppm的精確度表示。結晶l-(2,2-二氟-2-脫氧-(3-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)^J^嘧啶-2-酮半苯磺酸鹽半7K合物可以經口服利用並且通常經口月l施用，因而口服施用是優選的。製劑和施用藥物組合物以製藥領域中眾所周知的方式進行製備。載體或賦形劑可以是可作為活性成分的載體或溶媒的固體、半固體或液體物質。適宜的載體或賦形劑是本領域公知的。藥物組合物可適用於口服、吸入、胃腸道外或局部應用，可以以片劑、膠嚢劑、氣霧劑、吸入劑、栓劑、溶液劑、混懸劑等形式被施用於患者。本發明的化合物可以被口月良施用，例如可以用口服治療施用的目的而言，可以將化合物與賦形劑混合併且可以以片劑、錠劑、膠嚢劑、酏劑、混懸液、糖漿劑、糯米紙嚢劑、咀嚼膠等形式進行用途。這些製劑優選含有至少1%本發明的化合物、即活性成分，但是所述活性成分的量可以根據特定形式而不同，可以方便地為單元的重量的1%至約90%。化合物在組合物中的存在量為可以獲得適宜劑量的量。可片劑、丸劑、膠嚢劑、錠劑等還可包含一種或多種下文的助劑粘合劑如聚維酮、羥丙基纖維素、微晶纖維素或明膠；賦形劑或稀釋劑，如澱粉、乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣；崩解劑，如交聯羧曱基纖維素、交聯聚維酮、澱粉羥乙酸鈉、玉米澱粉等；潤滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸、滑石粉或氫化植物油；助流劑如膠態二氧化矽；潤溼劑，如月桂硫酸鈉和聚山梨醇酯80;並且可以加入甜味劑，如蔗糖、阿斯帕坦或糖精或矯味劑，如薄荷、水楊酸甲酯或橙香精。當劑量單位形式為膠嚢劑時，除上述類型的物質外，其還可以包含液體載體如聚乙二醇或脂肪油。其它劑量單位形式可以包含其它可以改變該劑量單位的物理形式的各種物質，例如包衣。優選的劑量形式是腸溶包衣的。因此，可以用糖、羥丙基甲基纖維素、聚甲基丙烯酸酯或其它包衣劑來對片劑或丸劑進行包衣。除本發明的化合物外，糖漿劑還可以包含蔗糖作為鄰，朱劑並且可以包含某些防腐劑、染料和著色劑以及矯味劑。在製備這些各種組合物時所用的物質應當是藥學純的並且在所用的量下無毒。結晶l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)M嘧啶-2-酮單對甲苯磺酸鹽和結晶l-(2，2-二氟-2-脫氧-(3-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮半苯磺酸鹽半水合物通常在寬的劑量範圍內有效。例如，日劑量(單次劑量或分開的劑量)通常落入約15mg/天至約200mg/天的範圍內，更優選為約85mg/天。在一些情況中，低於上述範圍下限的劑量水平可能就已經足夠了，而在其它情況中可能需要使用不會造成任何有害副作用的更高的劑量，因此，上述劑量範圍不意欲以任何方式限制本發明的範圍。應當理解，化合物所實際施用的量將由主治醫師根據相關的情況來確定，所述情況包括所治療的病症、所選擇的施用途徑、所施用的實際化合物、個體患者的年齡、體重和響應以及患者症狀的嚴重程度。權利要求1.化合物，為結晶1-(2，2-二氟-2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-1-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮單對甲苯磺酸鹽或者結晶1-(2，2-二氟-2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-1-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮半苯磺酸鹽半水合物。2.權利要求1的化合物，其為結晶l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮單對甲苯磺酸鹽。3.基本上純的形式的權利要求2的化合物。4.權利要求2或3的化合物，其特徵在於下者中的至少一種a.在X-射線譜中在26衍射角為4.86。±0.1的峰；或b.在固態"CNMR中在化學位移為152.5±0.1、159.6±0.1和182.2±0.1ppm的峰。5.權利要求2、3或4的化合物，通過如下方法製備將對甲笨晴酸一水合物加入l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧啶-2-酮在乙酸異丙酯中的溶液中。6.藥物組合物，包含權利要求2-5任一項的化合物和可藥用賦形劑。7.權利要求6的藥物組合物，其中組合物是腸溶包衣的。8.治療哺乳動物易受影響的腫瘤的方法，該方法包括給需要其的哺乳動物施用治療有效量的權利要求2-5任一項的化合物。9.權利要求8的方法，其中所述的易受影響的腫瘤選自T-細胞淋巴瘤、軟組織肉瘤、胰腺癌、乳癌、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌和膀胱癌。10.權利要求2-5任一項的化合物在製備用於治療易受影響的腫瘤的藥物中的用途。11.用作藥物的權利要求2-5任一項的化合物。12.權利要求2-5任一項的化合物在製備用於治療T-細胞淋巴瘤、軟組織肉瘤、胰腺癌、乳癌、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌或膀胱癌的藥物中的用途。13.權利要求1的化合物，其為結晶l-(2，2-二氟-2-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-l-氧代戊基)氨基嘧咬-2-酮半糾酸鹽半7jC合物。14.基本上純的形式的權利要求13的化合物。15.權利要求13或14的化合物，其特徵在於下者中的至少一種a.在X-射線語中在20衍射角為5.22。±0.1和7.33。±0.1的峰；或b.在固態"CNMR光i普中在156.9±0.1、163.3±0.1、176.9±0.1和177.8±0.1ppm的峰。16.權利要求13、14或15的化合物，通過如下方法製備將己烷加入1-(2，2-二氟-2-脫氧-^0-呋喃核糖基)-4-(2-丙基-1-氧代戊基)氨基嘧咬-2-酮和苯磺酸在甲醇中的溶液中。17.藥物組合物，包含權利要求13-16任一項的化合物和可藥用賦形劑。18.權利要求17的藥物組合物，其中組合物是腸溶包衣的。19.治療哺乳動物易受影響的腫瘤的方法，該方法包括給需要其的哺乳動物施用治療有效量的權利要求13-16任一項所述的結晶形式。20.權利要求19的方法，其中所述的易受影響的胂瘤選自T-細胞淋巴瘤、軟組織肉瘤、胰腺癌、乳癌、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌和膀胱癌。21.權利要求13-16任一項的化合物在製備用於治療易受影響的肺瘤的藥物中的用途。22.用作藥物的權利要求13-16任一項的化合物。23.權利要求13-16任一項的化合物在製備用於治療T-細胞淋巴瘤、軟組織肉瘤、胰腺癌、乳癌、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌或膀胱癌的藥物中的用途。全文摘要本發明涉及吉西他濱醯胺前體藥物的新的結晶形式、其組合物以及使用方法。文檔編號A61K31/513GK101448504SQ200780018229公開日2009年6月3日申請日期2007年6月20日優先權日2006年6月21日發明者A·Y·奧布列佐夫申請人:伊萊利利公司