通過無血清培養擴增活化淋巴細胞的方法

2023-11-05 03:45:57 2

通過無血清培養擴增活化淋巴細胞的方法
【專利摘要】本發明涉及免疫治療領域，具體涉及通過無血清培養擴增活化淋巴細胞的方法，所述方法包括：a)淋巴細胞活化步驟，其中將含有淋巴細胞的生物學樣品與包被於培養容器上的淋巴細胞活化劑相接觸並在無血清培養基中培養3-6天；b)第一擴增步驟，其中向步驟(a)中獲得的培養物加入其體積0.8-1.2倍的無血清培養基，進一步培養1-3天；c)第二擴增步驟，其中向步驟(b)中獲得的培養物加入其體積1-1.5倍的無血清培養基，進一步培養1-3天；d)第三擴增步驟，其中向步驟c)中獲得的培養物添加其體積2-4倍的無血清培養基，進一步培養4-6天；e)第四擴增步驟，其中向步驟d)中獲得的培養物添加其體積0.5-1.5倍的無血清培養基，進一步培養4-6天；和f)收穫步驟(e)中獲得的擴增的活化淋巴細胞。
【專利說明】通過無血清培養擴增活化淋巴細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及免疫治療領域，具體涉及通過無血清培養擴增活化淋巴細胞的方法。【背景技術】
[0002]過繼性細胞免疫治療是經體外刺激培養淋巴細胞後回輸給腫瘤病人，進行腫瘤治療的方法。自20世紀80年代，細胞因子IL-2對腫瘤的治療作用被發現，細胞免疫治療在臨床上的應用迅速擴展，人們先後培養出淋巴因子激活的殺傷性細胞(LAK)，腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，細胞因子激活的殺傷性細胞(CIK)。2000年，Yamazaki T等人在柳葉刀雜誌(TheLancet)報導了體外擴增活化自體淋巴細胞預防肝癌術後腫瘤復發的隨機對照臨床實驗研究。結果表明這種非特異性免疫治療極大延長了肝癌患者術後無復發生存時間，而且回輸細胞量和殺傷性能與療效有一定相關性，是一種很有前景的腫瘤治療方法。
[0003]在淋巴細胞體外擴增培養中，不同的擴增步驟、不同的培養基以及是否添加血清對於擴增效果具有不同影響，而是否添加血清對提高淋巴細胞的擴增能力和排除臨床使用的潛在安全風險至關重要。
[0004]本領域需要一種安全、高效、產品穩定性好、適宜於大規模生產的通過無血清培養來擴增活化淋巴細胞的方法。

【發明內容】

[0005]本發明提供一種通過無血清培養擴增活化淋巴細胞的方法，所述方法包括:
[0006](a)淋巴細胞活化步驟，其中將含有淋巴細胞的生物學樣品與包被於培養容器上的淋巴細胞活化劑相接觸並在無血清培養基中培養3-6天；
[0007](b)第一擴增步驟，其中向步驟(a)中獲得的培養物加入其體積0.8-1.2倍的無血
清培養基，進一步培養1-3天；
[0008](c)第二擴增步驟，其中向步驟(b)中獲得的培養物加入其體積1-1.5倍的無血清培養基，進一步培養1-3天；
[0009](d)第三擴增步驟，其中向步驟c)中獲得的培養物添加其體積2-4倍的無血清培養基，進一步培養4-6天；
[0010](e)第四擴增步驟，其中向步驟d)中獲得的培養物添加其體積0.5-1.5倍的無血清培養基，進一步培養4-6天；和
[0011](f)收穫步驟(e)中獲得的擴增的活化淋巴細胞。
[0012]在一些實施方案中，本發明的方法中使用的淋巴細胞活化劑是抗CD3抗體。
[0013]在一些實施方案中，本發明的方法中步驟(a)-(e)使用相同的無血清培養基。在一些實施方案中，本發明的方法中使用的無血清培養基含有細胞因子。所述細胞因子可以包括IL-2、IL-7以及INF--。本發明的方法使用的培養基中，IL-2的濃度可以是750-1500U/ml，例如 1000U/ml ;IL_7 的濃度可以是 l_30U/ml，例如 20U/ml ；INF-Y 的濃度可以是750-1500U/ml，例如1000U/ml。優選地，本發明的方法中使用的無血清培養基是X-VIV015,TexMACS或MSFlOO培養基。更優選地，所使用的無血清培養基為MSF100培養基。
[0014]使用本發明的擴增活化淋巴細胞的方法，所述生物學樣品中的淋巴細胞可被擴增100至1000倍。優選地，其中擴增後的細胞主要為⑶8+T細胞，例如，所擴增的活化淋巴細胞中，CD8+T細胞可>50%。優選地，所擴增的活化淋巴細胞的活力可保持12小時。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1示出擴增活化淋巴細胞的方法流程圖。
[0016]圖2示出擴增的活化淋巴細胞活力時間變化曲線圖。
[0017]圖3示出五種培養基擴增性能比較和統計學分析。
[0018]圖4示出不同培養基擴增後的細胞表型百分比和統計學分析。
【具體實施方式】
[0019]本發明提供了一種高效擴增活化淋巴細胞的方法，其使用無血清培養基進行培養，安全、高效、產品穩定性好且適宜於大規模生產。
[0020]優化的培養/擴增步驟
[0021]本發明提供了一種擴增活化淋巴細胞的方法，所述方法包括以下步驟:
[0022](a)淋巴細胞活化步驟，其中將含有淋巴細胞的生物學樣品與包被於培養容器上的淋巴細胞活化劑相接觸並在無血清培養基中培養3-6天；
[0023](b)第一擴增步驟，其中向步驟(a)中獲得的培養物加入其體積0.8-1.2倍的無血
清培養基，進一步培養1-3天；
[0024](c)第二擴增步驟，其中向步驟(b)中獲得的培養物加入其體積1-1.5倍的無血清培養基，進一步培養1-3天；
[0025](d)第三擴增步驟，其中向步驟c)中獲得的培養物添加其體積2-4倍的無血清培養基，進一步培養4-6天；
[0026](e)第四擴增步驟，其中向步驟d)中獲得的培養物添加其體積0.5-1.5倍的無血清培養基，進一步培養4-6天；和
[0027](f)收穫步驟(e)中獲得的擴增的活化淋巴細胞。
[0028]上述擴增活化淋巴細胞的方法中，培養基添加的次數和體積以及各步驟的培養時間均進行了優化。本發明的方法使得可以使用基本上一致的條件和步驟對不同患者來源的樣品進行擴增。對於大量樣品而言，擴增可以同步進行，從而實現規模化生產。
[0029]此外，用於擴增的起始細胞原材料一般來自患者外周血，不同性別、年齡和疾病狀態的患者會造成培養前細胞差別較大。通過本發明的方法進行擴增後，可獲得數量和質量相對一致的細胞，符合統一的質量標準，有利於商業上的應用。
[0030]如實施例1所述，對143例患者的淋巴細胞使用本發明的方法擴增，全部獲得了高效擴增，擴增倍數為約100-約1000倍，且培養後細胞數量、細胞表型較培養前的變異係數均有明顯降低，降低幅度達62?85%(表5)，也即是說使用本發明的方法可獲得質量較一致的細胞製品。
[0031]淋巴細朐[0032]能夠使用本發明的方法進行培養和擴增的淋巴細胞可來自外周血淋巴細胞。待擴增的淋巴細胞也可以是其他生物學樣品中存在的淋巴細胞，例如上皮淋巴細胞、腫瘤內浸潤淋巴細胞、癌性腹水或胸水中的浸潤淋巴細胞等。由於外周血中的淋巴細胞分離簡便、分離後淋巴細胞生存率高等原因，因此優選地使用分離自新鮮外周血的淋巴細胞。優選地，本發明的方法中所述「含有淋巴細胞的生物學樣品」是指分離的外周血單個核細胞(PBMC)。從外周血分離PBMC的方法為本領域技術人員所熟知。本發明的方法中所使用的初始外周血單個核細胞的量可低至I X IO7?4X IO7個細胞，相當於正常人僅約20ml外周血，擴增後卻可以獲得IX IO9?12X IO9以殺傷性T細胞為主的淋巴細胞。較低的初始細胞量避免了對患者的大量採血。
[0033]活化淋巴細朐
[0034]術語「活化淋巴細胞」是指經特異性抗原或非特異性淋巴細胞刺激劑/分子刺激的淋巴細胞，所述活化淋巴細胞能合成大分子物質(RNA、蛋白質、DNA)及細胞因子。淋巴細胞經活化後進行細胞增殖，並分化為不同功能的子代效應細胞和記憶細胞。
[0035]術語「淋巴細胞活化劑」是指能夠刺激淋巴細胞活化的試劑/分子。例如，可以使用抗CD3抗體作為淋巴細胞活化劑，該試劑刺激T細胞表面的CD3分子，通過T細胞受體有效活化T淋巴細胞。淋巴細胞有絲分裂原是另一類有效的淋巴細胞活化劑。這類分子快速活化淋巴細胞，其作用不通過T淋巴細胞受體。
[0036]合適的淋巴細胞活化劑的實例是抗CD3抗體。在本發明的淋巴細胞擴增方法的一個【具體實施方式】中，所述淋巴細胞活化劑是包被(固定化)於培養容器表面的抗CD3抗體。使用固定化的抗CD3抗體是優選的，因為其主要活化具有細胞殺傷功能的CD8+T細胞，這特別有利於提高所擴增的淋巴細胞的抗腫瘤活性。固定化抗CD3抗體的方法是已知的，例如固定化可以如下所述進行。
[0037]將抗CD3抗體固定.化於培養容器時，可將抗CD3抗體以滅菌的磷酸氯化鈉緩衝液(PBS)稀釋成1-50μ g/ml的濃度使用。不足I μ g/ml的濃度時，T細胞的增殖傾向於不充分，超過50μ g/ml時，T細胞的增殖雖然充分，但沒有固定於不溶性載體的、自由的抗CD3抗體傾向於增多。另外，作為稀釋液，只要是滅菌的磷酸氯化鈉緩衝液等生理溶液即可，不作特別限定，作為保護劑，可加入白蛋白、瓊脂糖等。
[0038]將稀釋的抗⑶3抗體無菌地平鋪於培養瓶的底面。固定時的反應溫度為4_40°C，更優選為4-25°C，最優選為4-10°C。不足4°C時，抗CD3抗體的固定化效率傾向於降低，超過40°C時，抗CD3抗體的活性傾向於降低。固定化時的反應時間為30分鐘-24小時，優選I小時至24小時。不足30分鐘時，抗CD3抗體的固定化量傾向於降低，超過24小時時，固定時間過長，生產效率傾向於降低。
[0039]緊接著上述抗CD3抗體的固定化，除去沒被固定的殘餘的抗CD3抗體稀釋液。通過使用磷酸氯化鈉緩衝液(PBS)等適當的清洗液清洗沒有被固定的抗CD3抗體，使其乾燥。乾燥方法可以在去除清洗液以後利用4-10°C冷庫中的自然乾燥、10-40°C的加溫乾燥、凍乾等方法。考慮到抗CD3抗體的活性和穩定性，優選凍幹，最優選4-10°C冷庫中的自然乾燥。如上所述，抗CD3抗體被固定化於培養容器。
[0040]本領域技術人員可以了解，在淋巴細胞活化後的擴增步驟中無需再使用淋巴細胞活化劑。例如，任選地，可以在培養步驟(a)、(b)、(c)或(d)之後將培養物轉移至不含有淋巴細胞活化劑的培養容器中進行後續培養步驟。
[0041]優化的細胞因子
[0042]在細胞擴增培養過程中，通常需要在培養基中加入細胞因子以促進細胞的增殖。本發明的方法中對擴增淋巴細胞時使用的細胞因子進行了優化。
[0043]在本發明中，細胞因子使用IL-2、IL-7和INF-gamma的組合。其中IL-2可以高效率、高專一性地擴增CD8+T細胞，而CD8+T細胞是免疫系統發揮抗腫瘤作用的最重要的細胞成分。而IL-7和INF-gamma則額外地促進淋巴細胞增殖，例如，維持記憶細胞的生存能力並減少細胞活化後的死亡，從而達到最好的細胞擴增效果和細胞活性的保持。在本發明的方法使用的培養基中，IL-2的濃度可以是250-3000U/ml，500-2000U/ml，750-1500U/ml，例如1000U/ml ；IL-7 的濃度可以是 1-lOOU/ml，5_50U/ml，10_30U/ml，例如 20U/ml ；INF-y 的濃度可以是 250-3000U/ml，500-2000U/ml，750-1500U/ml，例如 lOOOU/ml。優選地，使用本發明的方法擴增後的細胞主要為CD8+T細胞，例如，所擴增的活化淋巴細胞中，CD8+T細胞的比例可>50%。
[0044]優化的無血清培養基
[0045]本領域常用的細胞培養基如RPM1-1640或DMEM等在培養細胞時必須添加胎牛血清或者人血清。然而添加血清將帶來一些問題，例如引入血清來源病源體汙染，不同批次血清間可能存在的差異，免疫排斥風險等等。
[0046]本領域已開發了一些無血清細胞培養系統。然而，這些無血清培養系統在淋巴細胞培養過程中不能實現高效擴增，不能滿足臨床對治療用細胞數量和活性的要求，並且所獲得的細胞在短期內就失去活性。
[0047]本發明針對已有的無血清細胞培養方法進行了改進，篩選出適於擴增淋巴細胞的無血清培養基，並且結合上面描述的優化的細胞因子組合以及優化的培養步驟，避免了上述問題。適於在本發明的方法中使用的無血清培養基包括X-VIV015 (Lonza)、TexMACS(Miltenyi Biotech)或頂SFIOO(LYMMUNOTECH)培養基。最優選的無血清培養基為MSF100
培養基。
[0048]本發明的方法的一個優點是淋巴細胞培養過程中可以使用相同的培養基(包含相同的優化細胞因子組合)，無需在培養中進行變化，這簡化了培養步驟，便於大規模操作，有利於商業上應用。
[0049]與本領域其它無血清培養方法相比，本發明的方法具有穩定的細胞培養效率，可以達到或超過添加動物血清的培養體系的擴增效力，獲得的細胞活性穩定，具有較長的有效期。使用本發明的擴增活化淋巴細胞的方法，所述生物學樣品中的淋巴細胞可被擴增至少10倍，優選至少100倍，更優選至少1000倍。使用本發明的方法所擴增的活化淋巴細胞的活力可保持至少4小時，優選至少8小時，更優選至少12小時。
[0050]免疫治療方法和藥物組合物
[0051]本發明還提供了一種免疫治療方法，包括給個體施用通過本發明方法而獲得的活化淋巴細胞。
[0052]在本發明的免疫治療方法的一個實施方式中，通過上述擴增方法所獲得的淋巴細胞是自體淋巴細胞，且所述免疫治療方法包括以下步驟:
[0053](i)從個體獲得含有淋巴細胞的生物學樣品；[0054](?)採用本發明的方法擴增所述淋巴細胞，由此獲得擴增的活化淋巴細胞；和
[0055](iii)將所述擴增的活化淋巴細胞回輸給所述個體。
[0056]在本發明的免疫治療方法中，使用的淋巴細胞來源於病人自身的少量外周血。這些淋巴細胞在短時間內可以活化擴增達100-1000倍，再回輸於病人體內。
[0057]本發明的方法獲得的活化細胞大部分是⑶8+T淋巴細胞(>50%)。⑶8+T淋巴細胞在殺傷病毒感染的細胞和癌症細胞中發揮重要的功能。人體內T淋巴細胞包括許多針對不同抗原的特異性細胞。這些細胞經過培養後，會針對不同的腫瘤抗原/病毒抗原具有廣泛的識別和殺傷效果。本發明的免疫治療方法可用於治療患有例如腫瘤、感染性疾病、先天性或後天性免疫缺陷症、以及器官移植後感染性疾病及感染誘發的腫瘤的個體。
[0058]可使用本發明的免疫治療方法進行治療的腫瘤包括但不限於肝癌、肺癌、賁門癌、結腸癌、乳腺癌、髓母細胞瘤、胃癌、腎癌、和惡性黑色素瘤，且患有腫瘤的個體可以是正在接受放療和/或化療的個體。
[0059]本發明還提供一種免疫治療的藥物組合物，其包括通過本發明方法而獲得的活化淋巴細胞。
_0] 本發明的各種優勢
[0061]總而言之，本發明所提供的擴增活化淋巴細胞的方法相對於現有技術具有以下優勢:
[0062]1.使用無血清培養基進行培養
[0063]本發明的方法可以使用無血清培養基進行，無血清培養避免了使用血清可能導致的病源微生物汙染及其它對細胞生長的不利因素，也避免了可能帶來的安全性因素。
[0064]2.細胞擴增效率高，不需要使用血細胞單採機
[0065]通過本發明的方法在體外高效活化和擴增患者自身的T淋巴細胞，從IX IO7?4 X IO7外周血單個核細胞開始，可以獲得I X IO9?12 X IO9活化擴增的以殺傷性T細胞為主的淋巴細胞，這種約100?約1000倍以上高效擴增，避免了傳統免疫細胞治療需要使用單採機採取大量起始外周血單個核細胞對患者整體免疫細胞系統的破壞作用。
[0066]3.細胞產品活性高、穩定性好
[0067]傳統非特異性細胞培養後，細胞活性一般保持在2小時左右。而本發明的方法產生的細胞活性和穩定性好，細胞可保存12個小時而不影響其治療效果。
[0068]4.可以實現規範化、系統化生產
[0069]本發明的方法操作簡單、步驟統一、出錯風險小，特別適宜於大規模系統生產。
[0070]5.細胞產品可符合統一質量標準
[0071]經過本發明的方法進行擴增後可獲得數量和質量相對一致的淋巴細胞，符合統一的質量標準，有利於商業應用。
[0072]實施例
[0073]下面將通過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所描述的實施例範圍中。
[0074]實施例1:143例患者的活化淋巴細胞擴增
[0075]⑴採集了共計143例患者的外周血，不同性別、年齡和腫瘤類型均有分布。患者基本信息見下表1、2和3。[0076]表1:患者性別
[0077]
【權利要求】
1.一種通過無血清培養擴增活化淋巴細胞的方法，所述方法包括: a)淋巴細胞活化步驟，其中將含有淋巴細胞的生物學樣品與包被於培養容器上的淋巴細胞活化劑相接觸並在無血清培養基中培養3-6天； b)第一擴增步驟，其中向步驟(a)中獲得的培養物加入其體積0.8-1.2倍的無血清培養基，進一步培養1-3天； c)第二擴增步驟，其中向步驟(b)中獲得的培養物加入其體積1-1.5倍的無血清培養基，進一步培養1-3天； d)第三擴增步驟，其中向步驟c)中獲得的培養物添加其體積2-4倍的無血清培養基，進一步培養4-6天； e)第四擴增步驟，其中向步驟d)中獲得的培養物添加其體積0.5-1.5倍的無血清培養基，進一步培養4-6天；和 f)收穫步驟(e)中獲得的擴增的活化淋巴細胞。
2.權利要求1的方法，其中所述淋巴細胞活化劑是抗CD3抗體。
3.權利要求1或2的方法，其中步驟(a)-(e)中使用相同的無血清培養基。
4.權利要求1-3任一項的方法，其中所述無血清培養基還含有細胞因子。
5.權利要求4的方法，其中所述細胞因子包括IL-2、IL-7以及INF-Y。
6.權利要求5的方法，其中所述無血清培養基中IL-2的濃度是750-1500U/ml，優選1000U/ml。
7.權利要求5的方法，其中所述無血清培養基中IL-7的濃度是10-30U/ml，優選20U/ml ο
8.權利要求5的方法，其中所述無血清培養基中INF-Y的濃度是750-1500U/ml，優選1000U/ml。
9.權利要求1-8任一項的方法，其中所述無血清培養基選自X-VIV015、TexMACS和IMSF100培養基。
10.權利要求1-9任一項的方法，其中所述淋巴細胞被擴增100-1000倍。
11.權利要求1-9任一項的方法，其中被擴增後的淋巴細胞主要是⑶8+T細胞。
12.權利要求1-9任一項的方法，其中所獲得的擴增的活化淋巴細胞的活力可以保持至少12小時。
【文檔編號】C12N5/0783GK103436492SQ201310334666
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月2日 優先權日:2013年8月2日
【發明者】邵誼 申請人:北京賽諾泰生物科技有限公司