高靈敏監測POPs的轉螢光蛋白基因魚的製作與應用的製作方法

2023-10-30 15:46:55

本發明涉及基因工程與環境科學領域，特別是涉及一種高靈敏監測pops的轉螢光蛋白基因魚的製作與應用。

背景技術：

生物監測是指從生物學角度評價環境質量狀況的過程，通過觀測生物個體、種群或群落對環境質量及其變化所產生的反應和影響，進而闡明其所處環境汙染的性質、程度和範圍，包括生物種群及群落調查、急性慢性毒性試驗、水體微生物測試和魚類組織汙染物分析。德國是最早開展生物監測的國家，早在20世紀初，已經開展利用水生生物監測水質的工作，時至今日，歐盟、美國等發達國家均已建立了相對比較完備的環境生物監測體系。中國起步相對較晚，1993年隨著《水生生物監測手冊》的出版，初次建立了國家水生生物監測網，開始在全國範圍內開展水生生物監測工作。直至21世紀初，生物監測工作才再次得到重視。

目前傳統的生物監測方法，耗時費力，且不能用於直觀監測。2001年，mattingly等證實人的cyp1a1啟動子在tcdd的誘導下在48hpf前胚胎中可以觀察到gfp的局部表達，但不能用於活體直觀監測。2004年，nebert等公布了利用luc轉基因斑馬魚監測芳香烴類pops的專利(專利號：us20040147030)，但是該技術所使用的斑馬魚所轉基因為luc，檢測持續性有機物靈敏度低，同時也不能解決外源基因在受體魚中的整合、表達和遺傳問題；此外，檢測luc基因表達需要特殊儀器。因而，他們所研製的轉luc基因斑馬魚一直未能在環境有毒汙染物的監測中得到實際應用。ngghb(2013)製作了轉綠色螢光蛋白青鱂以及kun-heekima(2013)製作了轉綠色螢光蛋白斑馬魚，這個綠色螢光蛋白前帶有可以誘導的cyp1a啟動子，在進行tcdd暴露後青鱂和斑馬魚螢光表達均有不同程度的增強，但是這些轉基因魚只在實驗室內進行毒物的檢測，並沒有將其應用到環境監測中來，並且綠色螢光在顯微鏡觀察下腹部具有明顯的背景值，不便於觀察。因此構建螢光蛋白斑馬魚並在環境中進行有效應用是當前急需解決的問題。

技術實現要素：

鑑於以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在於提供一種監測pops的轉螢光蛋白基因魚的製作與應用，用於解決現有技術中監測環境中有毒物質時靈敏度低、不便於觀察等問題。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明第一方面提供一種監測pops的轉螢光蛋白基因魚的培養方法，包括如下步驟：

1)獲取響應啟動子：提供能被pops誘導表達的基因的啟動子序列，設計引物，擴增得到對持續有機汙染物有響應的啟動子，即響應啟動子；

2)載體構建：將步驟1)獲得的響應啟動子連接到載體中，得到連接有響應啟動子的載體，即響應載體，所述響應載體還包括螢光蛋白序列；

3)注射培養：將核酸酶與步驟2)獲得的響應載體共同注射至魚的受精卵，培養獲得能夠監測水體中pops的轉螢光蛋白基因魚。

進一步地，步驟1)中，被pops誘導表達的基因選自cyp1a基因。

進一步地，步驟1)中，所述響應啟動子選自cyp1a啟動子，所述cyp1a啟動子含有如seqidno.1所示的序列。

進一步地，步驟3)中，所述魚選自斑馬魚，當然，其他魚類也可適用。根據魚的種類擴增其cyp1a啟動子序列。

進一步地，所述pops選自tcdd、pahs中的至少一種。pahs包括但不限於nap、phe、baa、bap、bghip。

進一步地，步驟1)中，提取並純化魚的基因組dna，通過巢式pcr獲得響應啟動子。

進一步地，步驟1)中，巢式pcr第一輪反應的引物為cyp1a-nested-f和cyp1a-nested-r，cyp1a-nested-f的序列如seqidno.2所示，cyp1a-nested-r的序列如seqidno.3所示。

進一步地，步驟1)中，巢式pcr第二輪反應的引物為cyp1a-apa1-f和cyp1a-apa1-r，cyp1a-apa1-f的序列如seqidno.4所示，cyp1a-apa1-r的序列如seqidno.5所示。

進一步地，步驟2)中，所述響應載體帶有i-scei大範圍核酸酶轉移系統。

進一步地，步驟2)中，所述螢光蛋白選自mcherry。

進一步地，步驟1)中，將pcr產物與peasy-blunt3cloningvector連接，獲得peasy-cyp1apromoter質粒。

進一步地，步驟2)中，採用轉染試劑將響應載體瞬時轉染至細胞中，汙染物暴露，篩選得到對pops有響應效果的響應載體，轉入下一步進行注射。

進一步地，步驟3)中，所述核酸酶選自i-scei酶。

進一步地，步驟3)中，將核酸酶與步驟2)獲得的響應載體共同注射至魚的受精卵，培養獲得f0代魚，篩選獲得對pops有響應的f0代魚，將有響應的f0代魚與野生型魚雜交，收集魚卵，汙染物暴露，篩選得到對pops有響應的f1代魚，f1代魚再次與野生型魚雜交，收集魚卵，汙染物暴露，篩選得到對pops有響應的f2代魚，將f2代魚自交，獲得f3代魚，從f3代魚中篩選得到對pops有響應的純系轉螢光蛋白基因魚。

本發明第二方面提供上述方法培養獲得的轉螢光蛋白基因魚。

本發明第三方面提供上述轉螢光蛋白基因魚在監測水體pops中的應用。

本發明第四方面提供一種響應載體，所述響應載體帶有i-scei大範圍核酸酶轉移系統，所述響應載體包括響應啟動子序列以及螢光蛋白序列。

進一步地，所述響應啟動子選自cyp1a啟動子，所述cyp1a啟動子含有如seqidno.1所示的序列。

進一步地，所述螢光蛋白選自mcherry。

本發明第五方面提供上述響應載體用於培養螢光蛋白基因魚的用途。

如上所述，本發明的一種監測pops的轉螢光蛋白基因魚的製作與應用，具有以下有益效果：本發明針對目前傳統水環境pops(持續性有機汙染物)監測方法繁瑣，且需昂貴的儀器及專業的技術人員，不能實現對環境pops進行有效的監測等缺陷，本發明利用pcr技術原理，從魚的自身獲得對pops敏感的cyp1a基因啟動子，並構建攜帶i-scei大範圍核酸酶轉移系統和螢光蛋白的pi-scei-cyp1apromoter-mcherry質粒，最後通過顯微注射技術，獲得可以對水體中pops進行簡單、高效、直觀監測的轉紅色螢光斑馬魚。因此，與傳統的pops監測手段相比，本發明提供了一種方便快捷的生物監測手段，對實現pops實時監測有重要的推動作用。

附圖說明

圖1顯示為本發明實施例的pi-scei-cyp1apromoter-mcherry質粒圖譜。

圖2顯示為本發明實施例的細胞螢光驗證圖。

圖3顯示為本發明實施例中採用tcdd暴露轉紅色螢光斑馬魚之後的螢光驗證圖。

圖4顯示為本發明實施例中不同pahs暴露轉紅色螢光斑馬魚之後的螢光圖。

圖5顯示為本發明實施例中各土樣提取液暴露轉紅色螢光斑馬魚之後的螢光圖。

圖6顯示本發明實施例中各土樣提取液暴露轉紅色螢光斑馬魚之後的螢光強度定量圖。

圖7顯示為本發明實施例中各土樣的pahs含量圖。

具體實施方式

以下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點與功效。本發明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節也可以基於不同觀點與應用，在沒有背離本發明的精神下進行各種修飾或改變。

實施例1

一、cyp1a啟動子擴增

1、斑馬魚基因組dna提取：取野生型ab斑馬魚，剪取尾鰭20-30mg於蒸餾水中漂洗數次，吸水紙吸乾表面水分，置於1.5ml離心管中，眼科剪剪碎，按takara組織提取試劑盒操作說明，加入組織裂解液200μl，蛋白酶k20μl，rna酶10μl，漩渦混勻，置於56℃水浴鍋裂解2-3h，至無明顯組織塊。後續按試劑盒說明進行基因組dna的提取與純化。採用的試劑盒為takaramninbestuniversalgenomicdnaextactcionkitver5.0，貨號：9765，供應商：寶生物工程(大連)有限公司。cyp1a基因是根據文獻查找，根據前人的實驗結果得到，其具體公開於：zeruthg1,pollenzrs.isolationandcharacterizationofadioxin-induciblecyp1a1promoter/enhancerregionfromzebrafish(daniorerio)zebrafish2(3),197-210(2005)。

2、pcr擴增：根據在ncbi上查詢所得cyp1a啟動子序列，其序列如seqidno.1所示，用primer5引物設計軟體進行引物設計。利用hsdnapolymerase進行巢式pcr，第一輪反應採用引物cyp1a-nested-f(其序列如seqidno.2所示)和cyp1a-nested-r(其序列如seqidno.3所示)，pcr反應體系為50μl，具體包括：5xprimestarbuffer(mg2+plus)10μl、dntpmixture(2.5mmeach)4μl、cyp1a-nested-f+rmix1μl、hsdnapolymerase0.5μl、zebrafishgenomedna1μl、ddh2o33.5μl；pcr反應程序為：98℃預熱2min，98℃變性10s，55℃退火15s，72℃延伸3min，共30個循環，最後72℃延伸10min；以第一輪反應液為模板進行第二輪pcr反應，引物為cyp1a-apa1-f和cyp1a-age1-r，cyp1a-apa1-f序列如seqidno.4所示，cyp1a-age1-r序列如seqidno.5所示，反應體系同第一輪反應，反應退火溫度提高到58℃，待反應結束後，採用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr產物，利用天根瓊脂糖凝膠回收試劑盒(該試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司)回收目的條帶，回收方法按試劑盒操作說明進行操作。

3、目的片段連平端載體並測序：膠回收pcr產物與peasy-blunt3cloningkit(貨號：cb301-01生產商：北京全式金生物技術有限公司)連接，克隆反應體系為5μl，具體包括：pcr產物50ng、peasy-blunt3cloningkit1μl，總體積不足5μl時，用水補足至5μl，25℃反應18min，反應結束後將連接產物加入50μltrans1-t1感受態細胞中，輕彈混勻，冰浴30min，42℃熱激30s，立即置於冰上2min，加入250μl平衡至室溫的lb培養基，在200rpm(搖床轉速)、37℃下培養1h。5000rpm離心1min，棄掉部分上清，剩餘部分混勻，取全部菌液塗la平板，37℃過夜培養。次日菌落pcr挑取陽性克隆，搖菌過夜，提質粒送江蘇金維智生物科技有限公司測序，測序結果與ncbi序列進行比對，與預期結果一致，該載體命名為peasy-cyp1apromoter。

二、質粒構建

1、質粒酶切回收目的條帶：將質粒peasy-cyp1apromoter和質粒pi-scei-cmv-mcherry質粒(實驗室已有質粒，其序列如seqidno.12所示)用賽默飛快切酶apai和agei進行雙酶切，37℃恆溫水浴鍋放置30min，瓊脂糖凝膠電泳回收cyp1apromoter片段和pi-scei–mcherry骨架。cyp1apromoter即cyp1a啟動子，其序列如seqidno.1所示，pi-scei–mcherry骨架序列如seqidno.10所示。快切酶apai和agei均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。mcherry序列如seqidno.8所示。

2、採用t4dna連接酶(購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司)進行連接反應：20μl反應體系包括10×buffer2μl、cyp1apromoter片段50ng、pi-scei–mcherry骨架100ng、t4dna連接酶0.2μl、餘量為水。pcr儀中22℃連接1h，取10μl加入100μl感受態中，輕彈混勻，冰浴30min，42℃熱激90s，立即置於冰上2min，加入850μl平衡至室溫(25℃)的lb培養基，180rpm、37℃培養1h。5000rpm離心1min，棄掉部分上清，剩餘混勻，取全部菌液塗la平板，37℃過夜培養。次日菌落pcr挑取陽性克隆，搖菌過夜，提質粒酶切鑑定，陽性質粒送江蘇金維智生物科技有限公司測序，測序結果與預期一致，該載體命名為pi-scei-cyp1apromoter-mcherry，圖1所示為pi-scei-cyp1apromoter-mcherry質粒圖譜。pi-scei-cyp1apromoter-mcherry的序列如seqidno.9所示。

三、質粒螢光誘導效果驗證

1、細胞傳代鋪板：利用人肝癌細胞hepg2進行螢光誘導效果驗證試驗，將25ml細胞培養瓶中細胞消化傳代至96孔細胞培養板中，接種細胞數量為1×104個/孔，培養基為有血清無抗生素高糖dmem培養基。胎牛血清(fbs)含量為10％；dmem，highglucose(貨號：11965175)；胎牛血清(fbs)貨號：10100147。dmem與胎牛血清均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

2、細胞轉染：第二天，待上述96孔板中細胞長至70～80％融合，將步驟二中構建好的質粒pi-scei-cyp1apromoter-mcherry利用viafecttm轉染試劑(名稱：viafecttmtransfectionreagent；貨號：e4981；供應商：普洛麥格(北京)生物技術有限公司)進行細胞轉染，轉染液體系為：10μldmem、0.1μg質粒、0.3μl轉染試劑，配製混合物時，先加質粒至dmem培養基中混合均勻，然後將轉染試劑直接加入到培養基中，不要沾到離心管壁上，立即吹打混勻，室溫孵育10min。然後將混合物滴加至培養的細胞中，輕輕吹打混合均勻，繼續培養6-8h。

3、tcdd梯度暴露：tcdd設置的濃度梯度為0、0.01、0.05、0.1和0.5nm，按照濃度要求加入完全培養基中，細胞繼續培養24h，利用螢光倒置顯微鏡觀察螢光表達情況，如圖2所示為細胞螢光圖，其中，c圖是指沒有轉染質粒的細胞螢光圖。

四、顯微注射

顯微注射採用eppendorffemtojet4i顯微注射儀。顯微注射前夜，挑取性成熟ab型斑馬魚雌雄魚進行配對，雌雄數量比例為1:1(雌雄斑馬魚各兩條)，雌雄魚用隔板分開，待第二天開燈後根據注射需要依次打開隔板，打開隔板後，雄魚追尾雌魚，數分鐘後雌性斑馬魚即可排卵，收集受精卵用清水簡單清洗，用吸管依次排放在注射凹槽中。取步驟三驗證的重組質粒pi-scei-cyp1apromoter-mcherry，將該重組質粒和i-scei酶共注射到斑馬魚一細胞期胚胎中，注射液體系為10μl：pi-scei-cyp1apromoter-mcherry質粒終濃度20～50ng/μl、10×buffer1μl、i-scei酶0.5μl、酚紅0.5μl，加雙蒸水補足至10μl。注射時，根據毛細玻璃管針尖大小，調試合適的注射壓力和注射時間，注射針從植物極穿過到達動物極，輕踏注射踏板可以看到紅色注射液進入胚胎動物極，輕輕抽出即可完成注射，單個胚胎質粒注射量控制在20-50pg。斑馬魚1細胞期的時間約為0.5h，超過1細胞期的胚胎不進行注射。注射完成後吸取孵化水將胚胎從注射盤上衝洗到一個乾淨的培養皿中，28℃恆溫培養，獲得轉基因斑馬魚f0代。

五、純合子篩選

1、斑馬魚基因組dna提取：將步驟四顯微注射所得斑馬魚胚胎精心飼養至兩月齡。剪取尾部，雙蒸水漂洗數次，吸水紙吸乾表面水分，鑷子夾取放入1.5ml離心管中，用眼科剪儘量剪碎，加入100μlctab(hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨)裂解液(100mmtris-hclph8.5,0.5medta,10％sds,5mnacl)，同時加入1μl20mg/ml的蛋白酶k漩渦振蕩混勻，55℃水浴裂解2-3h，中間漩渦振蕩混勻數次，直至組織塊完全裂解。加入150μl氯仿，顛倒混勻，12000rpm離心4min，小心吸取上清(約80μl)至新的0.6ml離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻可見絮狀沉澱，12000rpm離心4min，棄上清，加入300μl75％乙醇，顛倒懸浮洗滌沉澱，10000rpm離心4min，棄上清，倒置晾乾，加入20μl雙蒸水溶解沉澱，微量分光光度計進行濃度和純度檢測。

2、pcr檢測目的基因：根據注射外源質粒pi-scei-cyp1apromoter-mcherry的序列設計檢測引物，pcr反應採用fasttaqdna聚合酶(購自北京全式金生物技術有限公司)，反應體系為20μl，具體包括：10xbuffer2μl、dntpmix1.6μl、fasttaqdnapolymerase0.1μl、10μm引物cyp1a-jc-f和cyp1a-jc-r的混合液0.4μl、斑馬魚基因組dna模板1μl、雙蒸水14.9μl。反應程序為：94℃3min，94℃5s，55℃15s，72℃10s；共35個循環，72℃延伸5min，16℃保存。反應結束後，採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。引物cyp1a-jc-f序列如seqidno.6所示，引物cyp1a-jc-r序列如seqidno.7所示。

3、連接pmd-19t送測序驗證：取上述步驟2中有目的條帶的陽性pcr產物2μl，加入2μl雙蒸水和1μlpmd-19t載體(名稱：pmd-19tvectorcloningkit；貨號：6013；供應商：寶生物工程(大連)有限公司)，加入5μlsolutioni混勻，16℃反應30min。反應結束後，取反應液加入100μl感受態中，用槍頭輕輕攪拌混勻，冰浴30min，42℃熱激1.5min，加入850μllb培養基，180rpm、37℃恆溫搖床活化1h，5000rpm離心1min，棄部分上清，餘下部分混勻塗布在具有羧苄青黴素的lb平板(羧苄青黴素在lb培養基中的濃度為100μg/ml)上，37℃倒置過夜培養。次日，菌落pcr驗證，陽性菌落搖菌過夜擴大培養，提質粒送江蘇金維智公司測序，測序結果如seqidno.11所示，與預期一致。

4、f0代陽性轉基因魚後代驗證：取前述步驟四獲得的轉基因斑馬魚f0代，將f0代轉基因斑馬魚與野生斑馬魚進行一對一配對，收集f1代受精卵，次日隨機挑取5顆，按照步驟1-2的方法提取基因組dna，並進行pcr驗證。對pcr擴增獲得陽性條帶的受精卵，加入終濃度為1nm的tcdd進行暴露，暴露2天，螢光顯微鏡觀察螢光。將具有螢光的仔魚挑出進行飼養，直至性成熟。

5、轉紅色螢光斑馬魚純合子篩選：篩選出有紅色螢光表達的f1代，繼續培養至性成熟，再次與野生型斑馬魚雜交，低濃度tcdd暴露獲得有螢光表達的斑馬魚f2代，最後將篩選的f2代斑馬魚培育至性成熟後自交獲得f3代，f3代與野生型雜交，若後代均有螢光表達，則表示該f3代個體為純合子。

六：化學標準品和環境樣品檢測

1、轉螢光斑馬魚胚胎收集：試驗前夜，將轉基因紅色螢光蛋白斑馬魚品性成熟雌雄斑馬魚配對，次日收集胚胎於28℃恆溫培養箱12h，剔除其中未受精的斑馬魚胚胎。

2、化學標準品暴露：tcdd暴露共設置0.05、0.1、0.5、1和5nm五個濃度梯度，五種多環芳烴(pahs)暴露濃度為0μm萘、10μm菲、10μm苯並蒽、1μm苯並芘、10μm苯並苝，用dmso作為對照組，每個濃度梯度設置3個平行樣，每個平行樣放置50顆胚胎。胚胎置於生化恆溫培養箱培養60h，期間注意觀察，及時清除死卵，避免惡化水質。暴露結束，ms-222麻醉，利用nikon體式螢光顯微鏡進行螢光觀察記錄。

3、環境樣品暴露：

3.1、樣品來源：巴基斯坦喀拉蚩電子垃圾回收站點土樣，採自喀拉蚩三個地區共14個採樣點：lyari(ly124°85'71"n66°99'44"e、ly224°86'51"n67°01'96"e、ly324°88'09"n67°02'26"e、ly424°86'62"n67°08'52"e)、surjanitown(sj125°06'01"n67°06'01"e、sj225°02'77"n67°07'40"e、sj325°05'28"n67°11'83"e、sj425°02'23"n67°11'77"e、sj524°97'53"n66°09'64"e)和jacoblines(jc124°86'81"n67°02'40"e、jc224°85'26"n67°04'39"e、jc324°87'50"n67°04'42"e、jc424°86'99"n67°09'76"e、jc524°89'46"n67°07'64"e)。其中16種pahs含量由該地球化學所分析提供。

3.2、樣品處理：採用quechers方法對土樣中的pahs進行提取。在50ml玻璃離心管中加入4g電子垃圾樣品、4gmgso4和1gnacl，然後加入10ml提取溶劑(按體積計，二氯甲烷：己烷＝1:1)。漩渦振蕩混勻，室溫放置過夜。次日，漩渦振蕩15min，超聲2min，重複兩次。2500rpm離心5min，吸取上清液至30ml玻璃離心管中，加入150mg硫酸鎂和25mgpsa。漩渦振蕩2min，2500rpm離心5min。吸取上清液5ml到8ml棕色樣品瓶中，氮吹儀吹乾，加入1mldmso漩渦振蕩重新溶解，振蕩時注意轉速，避免將液體振蕩到蓋子上。

3.3、樣品提取液暴露轉基因螢光斑馬魚胚胎：按步驟1中方法收集轉基因螢光斑馬魚胚胎，採用90mm玻璃培養皿進行暴露，每個培養皿中加入50顆胚胎、30ml去離子水，並加入30μl上述步驟3.2中電子垃圾樣品提取液，對照組加30μldmso，倒八字混勻，置於28℃生化恆溫培養箱中暴露60h，每個樣品三個平行。暴露結束用nikon螢光體式顯微鏡對暴露幼魚進行螢光觀察，並進行螢光強度測定。

4、轉基因螢光斑馬魚檢測結果分析

4.1、化學標準品檢測驗證

利用不同梯度tcdd暴露轉基因螢光斑馬魚結果如圖3所示，斑馬魚螢光強度隨暴露濃度的增加而增加，具有明顯的濃度依賴效應。圖4中pahs暴露結果顯示，萘和菲無明顯的誘導效果，苯並苝有誘導效果但不是很明顯；苯並芘誘導效果最為明顯，可見腹部螢光明顯增強，苯並蒽螢光誘導效果次之。

4.2、電子垃圾掩埋點附近土樣浸提液暴露結果

圖5顯示為各土樣提取液的暴露結果圖，nc是指沒有暴露的對照組結果圖；圖6顯示為各土樣提取液暴露的斑馬魚螢光強度圖，c是指沒有暴露的斑馬魚螢光強度圖。

如圖7所示為各土樣的pahs含量圖，三個地區中，採自lyari的土樣pahs含量最高，其螢光誘導效果也最明顯。螢光強度和樣品中pahs含量總體趨勢一致。但樣品中成分相對比較複雜，不能達到一一對應的效果。

三個地區土樣中pahs含量數據如下表1所示：

表1

綜上所述，本發明針對目前傳統水環境持久性有機汙染物(pops)檢測方法繁瑣，且需昂貴的儀器及專業的技術人員，不能實現對環境pops進行有效的檢測等缺陷，本發明利用pcr技術原理，從魚的自身獲得對pops敏感的cyp1a基因啟動子，並構建攜帶iscei大範圍核酸酶轉移系統和螢光蛋白的pi-scei-cyp1apromoter-mcherry質粒，最後通過顯微注射技術，獲得可以對水體中pops進行簡單、高效、直觀監測的轉螢光斑馬魚。因此，與傳統的pops檢測手段相比，本發明提供了一種方便快捷的生物檢測手段，對實現pops實時監測有重要的推動作用。

上述實施例僅例示性說明本發明的原理及其功效，而非用於限制本發明。任何熟悉此技術的人士皆可在不違背本發明的精神及範疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發明所揭示的精神與技術思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應由本發明的權利要求所涵蓋。

sequencelisting

中國科學院重慶綠色智能技術研究院

高靈敏監測pops的轉螢光蛋白基因魚的製作與應用

pcqls171969

patentinversion3.5

2685

dna

artificial

cyp1a啟動子序列

agccgaacaggagggtaaatagagcagaactagtgaacctcttctcctcctccagctcac60

gcaacgtggccaatctttaacccgcgctacaggtgcgcgcacgcgatgctgtttgatcag120

tttatcgtagcgtgtttcacacagcgataacagtctgaggtcgcaggaactcttcccata180

aacccaccgcagaacaaacactccggctttaacactcctcgtgcttttgtgcatgaaccg240

ctgacatgcacgctctccgacggccacgcgcgtctaccccattctgccagctcttcctgt300

tgacagtcaatgagatgcatgaaaaatgtgtgaaggaatctgcagcagcggttcacaaac360

gcacgcacacactctcacacacacacacctttgcacgcgatgctttacctgttgcttaat420

gagttacgagcgcgtgccagatcagcagagactcaaacatgcaggcaattatcggatgtg480

ttgcaacaaacaatttatttagttcacataattgcctaaaccatcacactgatttatgac540

actttagcttagacagctttaaaagataaataaacatctcgagcatgctgtttaactttt600

catgatttatatattctgattttattgggcttatttatttctcgcataataattatgcgc660

attgagtttgctgtatagtgctctctgtgtgtgtttttaagagttgtgatgaaatgtgag720

attgatttctcagttaatgcacgtcgcttttgtctacaaactgttctgtaaaatattaac780

attattacataacatcaaaaacaccgataagcccagttctgcctaattataaaggctaat840

taagcgtctcatttattaatttatttcatttatttatgttttaaatatatatttgtttac900

atattgcaatttagttggaaatgcatgttaaaaatattagtgctgtataattattaccca960

atcaaaaatgttgcatttgtgttaatattgacatatatatgatcacattacataaatatt1020

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3958

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ataacagggtaatgcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattgggtaccgggcc3958

602

dna

artificial

質粒測序結果

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gtaataaaatctcagcccttctcagcatcaaagcctcctgcgctcggtgacgtccgcgga120

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ga602

4579

dna

artificial

pi-scei-cmv-mcherry