掃描實時微流體熱循環儀和用於同步的熱循環和掃描光學檢測的方法

2023-10-31 16:52:52 2

掃描實時微流體熱循環儀和用於同步的熱循環和掃描光學檢測的方法
【專利摘要】進行同時核酸擴增和檢測的系統和方法。該系統和方法包括處理多個協議連同指導傳感器陣列通過多個反應室中每個的方法。在某些實施方式中，該協議包括熱循環廓線，和該方法將偏移和持續時間延伸引入熱循環廓線以獲得更有效的檢測行為。
【專利說明】掃描實時微流體熱循環儀和用於同步的熱循環和掃描光學檢測的方法
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年4月15日提交的名稱為「使熱循環和掃描光學檢測同步的軟體控制過程」的共同未決的美國臨時專利申請系列號61/476，175和2011年4月15日提交的名稱為「6色掃描實時微流體(microfIuidic)熱循環儀」的共同未決的美國臨時專利申請系列號61/476，167的35U.S.C.章節119(e)下的權益，其申請以其全部通過引用被併入本文。
【技術領域】
[0003]本文公開的系統和方法總體上涉及在微流體盒中在多個微流體反應室中核酸擴增測定，如聚合酶鏈反應(PCR)，和在一些情況中實時PCR的自動化執行。該系統可隨後檢測每個反應室內的靶核酸，例如，靶擴增子。
[0004]發明背景
[0005]醫學診斷學產業是目前保健基礎設施的關鍵要素。然而，目前，體外診斷分析，無論多常規，都已變成患者醫療護理中的瓶頸。對此存在幾個原因。首先，許多診斷分析只可用高度專門的設備進行，該設備既昂貴又僅由受過培訓的臨床醫生操作。這樣的設備可僅在少數場所一常常在任何給定的市區裡僅一個。這需要醫院將樣品送出到這些場所進行分析，由此引起裝運成本和運輸延遲，和可能甚至樣品丟失或誤操作。其次，該設備通常在「需要時」不可用，而是成批運行，由此延遲許多樣品的處理時間，因為在它們被運行之前必須等機器達到容量。
[0006]應當理解，對生物樣品的診斷測定可分解成幾個主要步驟，常常期望使一個或多個步驟自動化。例如，生物樣品，如獲自患者的那些樣品，可用於核酸擴增測定以擴增感興趣的靶核酸(例如，DNA、RNA等等)。一旦擴增，可檢測靶核酸的存在，或靶核酸(例如，靶擴增子)反應器的擴增產物，其中靶核酸和/或靶擴增子的存在用於鑑定和/或定量靶(例如，靶微生物等)的存在。通常，核酸擴增測定包括多個步驟，其可包括核酸提取、核酸擴增和檢測。期望使這些過程中的某些步驟自動化。
[0007]存在對平行進行多個樣品的分子診斷測定——具有或沒有靶核酸擴增，和對製備的生物樣品檢測的方法和裝置的需要。可配置系統用於高通量，和在商業的參考實驗室或在護理點操作，由此消除將樣品送出到專門機構的需要。
[0008]發明概述
[0009]本文公開的實施方式涉及用於同時測試多個樣品的方法和設備。某些實施方式考慮進行實時核酸擴增和檢測的裝置。該裝置可包括檢測器頭，其包括多個光檢測器和光源對。可將檢測器頭安裝到導軌上，其中將檢測器和光源對在第一排和第二排中排列。裝置可包括微流體盒的容器，其具有多個在第一排和第二排相鄰的列中排列的獨立反應室。裝置還可包括孔板，其被配置以當盒存在於容器中時位於微流體盒之上。孔板可包括多個孔，當容器容納微流體盒時，這些孔每個排列在多個反應室中每個之上。檢測器頭可位於孔板之上，並沿著導軌可移動，以便可將第一排中多個光檢測器和光源對中的每個安置在孔板第一排中每個孔之上，和可將第二排中多個光檢測器和光源對中的每個安置在孔板第二排中每個孔之上。
[0010]在一些實施方式中，裝置還包括第二檢測器頭，其具有多個排列到第一排和第二排中的光檢測器和光源對。可將第二檢測器頭安裝在導軌上。裝置還可包括微流體盒的第二容器，其包括多個在第一排和第二排相鄰的列中排列的獨立反應室。裝置還可包括第二孔板，其被配置以當第二盒存在於第二容器中時位於第二微流體盒之上，並且第二孔板可包括多個孔，當第二容器容納第二微流體盒時，這些孔每個排列在第二微流體盒的多個反應室中每個之上。第二檢測器頭可位於孔板之上，並沿著導軌可移動，以便可將第二檢測器頭的第一排中多個光檢測器和光源對中的每個安置在第二孔板第一排中每個孔之上，和可將第二檢測器頭的第二排中多個光檢測器和光源對中的每個安置在第二排孔板的第二排中每個孔之上。
[0011]在一些實施方式中，光檢測器和光源對可包括至少六個不同的光檢測器和光源對，其以六個不同的波長操作。在一些實施方式中，六個不同的波長包括發射綠色光的光源、發射黃色光的光源、發射橙色光的光源、發射紅色光的光源和發射深紅色光的光源。在一些實施方式中，檢測器頭包括至少N排光檢測器和光源對，並配置檢測器以在包括M排孔的孔板之上移動到至少M+N-1個位置。
[0012]在一些實施方式中，孔板包括鋼、鋁、鎳或其組合。在一些實施方式中，孔板可具有大約.25英寸的厚度。在一些實施方式中，將至少部分孔板電化學地氧化以比當孔板未被電化學地氧化時更黑。在一些實施方式中，當盒存在於容器中時，孔板提供通過(across)微流體盒區域的基本上均勻的壓力。在一些實施方式中，孔板包括鋁、鋅或鎳中至少一個，孔板進一步包括著色劑。
[0013]在一些實施方式中，裝置進一步包括加熱器板，其中當盒存在於容器中時將加熱器板安置於微流體盒下面。在一些實施方式中，加熱器板包括玻璃或石英中至少一個。在一些實施方式中，當盒存在於容器中時，孔板提供通過微流體盒區域的基本上均勻的壓力。基本上均勻的壓力可促進微流體反應室和加熱器板之間基本上均勻的熱接觸。像這樣，在一些實施方式中，孔板提供均勻的壓力，其可保證微流體盒中多個反應室或反應器中的每個與位於加熱器板內多個加熱元件的各個均勻地熱接觸或聯繫。
[0014]在一些實施方式中，裝置進一步包括光檢測器，光檢測器位於孔板之上，其中配置微流體室以相對於光檢測器在掠射角從光源接收光。在一些實施方式中，加熱器板包括多個加熱元件，其中安置多個加熱元件中的每個，以便當微流體盒存在於容器中時，多個加熱元件分別與多個反應室中的每個熱連通。
[0015]某些實施方式考慮在一個或多個計算機處理器上執行的用於優化協議(protocols),如聚合酶鏈反應(PCR)協議等，同時進行多個熱循環反應的方法，其中每個熱循環反應包括一個或多個檢測步驟，和其中熱循環反應在多個反應器中進行。該方法可包括以下步驟:測定或提供或訪問多個反應器中每個的檢測循環時間；接收或訪問協議步驟，該步驟與步驟持續時間相關，該步驟包括檢測時間；和測定對步驟的第一調節以便步驟持續時間是多倍檢測循環時間。
[0016]在一些實施方式中，該方法進一步包括測定對步驟的第二調節，其中當步驟由第一調節和由第二調節來調節時，檢測時間是多倍檢測循環時間。在一些實施方式中，該方法進一步包括基於與協議相關的反應室的位置測定起始偏移調節(starting offsetadjustment)。在一些實施方式中，檢測循環時間包括檢測器頭對反應器進行預設的多個檢測所需要的時間量。在一些實施方式中，檢測循環時間包括檢測器頭運動到多個反應器中的每個和檢測器頭運動到起始位置所需要的時間。在一些實施方式中，該方法進一步包括啟動該協議。
[0017]某些實施方式考慮包括指令的永久性計算機可讀介質，配置該指令以引起一個或多個處理器進行以下步驟:測定或提供或訪問檢測循環時間；接收或訪問協議步驟，其中該步驟與步驟持續時間相關，並且其中步驟包括檢測時間；和測定對步驟的第一調節以便步驟持續時間是多倍檢測循環時間。
[0018]在一些實施方式中，協議步驟與來自多個協議的協議相關。多個協議中的每個可與多個熱循環反應，如聚合酶鏈反應(PCR)協議中至少一個相關，其中每個熱循環反應包括一個或多個檢測步驟，並且當多個協議中的兩個或多個同時運行時，其中測定第一調節至少部分基於一個或多個與多個協議中至少兩個或多個的熱循環反應相關的檢測步驟的計時。在一些實施方式中，該方法還包括測定對步驟的第二調節的步驟，其中當步驟由第一調節和由第二調節來調節時，檢測時間是多倍的檢測循環時間。在一些實施方式中，該方法還包括基於與協議相關的反應室的位置測定起始偏移調節的步驟。在一些實施方式中，檢測循環時間包括檢測器頭對反應室進行預設的多個檢測所需要的時間量。在一些實施方式中，檢測循環時間還包括檢測器頭運動到多個反應室檢測位置中的每個和檢測器頭運動到起始位置所需要的時間。在一些實施方式中，該方法進一步包括啟動該協議。
[0019]某些實施方式考慮優化針對多個反應室的協議的系統。該系統可包括處理器，其被配置以進行以下操作:測定或提供或訪問檢測循環時間；接收或訪問協議步驟，其中該步驟可與步驟持續時間相關，和其中該步驟包括檢測時間；和測定對步驟的第一調節以便步驟持續時間是多倍檢測循環時間。
[0020]在一些實施方式中，協議步驟與來自多個協議的協議相關。多個協議中的每個可與多個熱循環反應，如聚合酶鏈反應(PCR)協議中至少一個相關，其中每個熱循環反應包括一個或多個檢測步驟，並且其中當多個協議中的兩個或多個同時運行時，測定第一調節至少部分基於一個或多個與多個協議中至少兩個或多個的熱循環反應相關的檢測步驟的計時。在一些實施方式中，還配置處理器以測定對步驟的第二調節，其中當步驟由第一調節和由第二調節來調節時，檢測時間是多倍檢測循環時間。在一些實施方式中，還配置處理器以基於與協議相關的反應室的位置測定起始偏移調節。在一些實施方式中，檢測循環時間包括檢測器頭對反應室進行預設的多個檢測所需要的時間量。在一些實施方式中，檢測循環時間還包括檢測器頭運動到多個反應室檢測位置中的每個和檢測器頭運動到起始位置所需要的時間。在一些實施方式中，該處理器被進一步配置以啟動該協議。
[0021]某些實施方式考慮在多個PCR反應室中同時進行實時PCR的方法，包括:(a)提供足以讓檢測器組合件進行掃描循環的掃描時間，在該時間內其可針對至少一個可檢測的信號掃描多個PCR反應室中的每個和變為準備重複掃描；(b)為PCR反應室中的每個提供反應協議，其包括多個循環，每個循環包括循環時間，循環時間包括至少一個加熱步驟、至少一個冷卻步驟和至少一個溫度平穩時期，該溫度平穩時期包括讀取循環時期，檢測器組合件在該期間將針對至少一個可檢測的信號而掃描反應室；(C)利用處理器測定是否該反應 室的循環時間與掃描時間相同或是掃描時間的整數倍，如果不是，則調節掃描時間或循環 時間以便循環時間與掃描時間相同或是掃描時間的整數倍；(d)針對多個PCR反應室中每 個的反應協議進行至少步驟(b)和(C)，以便每個反應協議的循環時間與掃描時間相同或 是掃描時間的整數倍；和(e)在處理器的指導下，在每個反應室上利用每個反應室的反應 協議進行實時PCR，包括用檢測器組合件進行多掃描循環，其中每個PCR反應室在該反應室 的每個讀取循環時期期間由檢測器組合件來掃描。
[0022]在一些實施方式中，該方法進一步包括調節至少一個反應室的反應協議循環時間 的階段。在一些實施方式中，至少一個所述反應協議與另一個所述反應協議不同。在一些 實施方式中，一個反應協議中至少一個循環時間與另一個反應協議中的循環時間不同。
[0023]附圖簡述
[0024]圖1A是用於某些實施方式的診斷裝置的前平面圖。
[0025]圖1B是顯示某些裝置的內部部件的圖1A的診斷裝置的頂部透視圖。
[0026]圖2顯示圖1A和IB的診斷裝置的內部圖。
[0027]圖3A顯示本文描述的微流體盒的某些實施方式內一個可能的微流體排列的頂部 平面圖。
[0028]圖3B顯示與某些實施方式的反應室有關的加熱器基底的布置圖。
[0029]圖4A顯示包括本文描述的某些實施方式的檢測器頭的光學模塊的外部圖。
[0030]圖4B顯示側蓋去除的圖4A的光學模塊的圖。
[0031]圖4C顯示圖4A的光學模塊的底視圖。
[0032]圖5顯示在某些實施方式的光學模塊內使用的沿著圖4B的線13的檢測器頭。
[0033]圖6描述用於本文公開的檢測器頭的某些實施方式的光源和光學檢測器的布置 圖。
[0034]圖7是利用在本文描述的某些實施方式的裝置中進行的靶核酸實時PCR的螢光對 時間的圖。
[0035]圖8是在本文描述的某些實施方式中發現的某些室、孔和加熱層的概括描述。
[0036]圖9A-H顯示孔板的一個實施方式的各個透視圖。
[0037]圖10顯示圖9A-H的孔板的透視圖的各個尺度。
[0038]圖11是某些實施方式中執行的可能協議的部分熱廓線(thermal profile)的圖。
[0039]圖12是描述測定協議持續時間、偏移和檢測次數以優化和管理檢測器效率的過 程的流程圖。
[0040]圖13顯示選擇某些協議步驟和子步驟的持續時間和測定伴隨的內循環調節的用 戶界面部分。
[0041]圖14是包括內循環調節的熱廓線的圖。
[0042]圖15A-C繪製某些實施方式中執行的多個協議的多個熱廓線。圖15A和15B顯示 起始偏移調節之前協議廓線的特徵。圖15C顯示應用起始偏移調節之後相對於彼此的多個 協議廓線。
[0043]圖16是如在某些實施方式中執行的在有效冷卻下的熱廊線的圖。
[0044]詳細描述[0045]某些本實施方式考慮裝置，本文稱作熱循環儀，其可連貫地加熱和分析微流體室。多核苷酸擴增，如通過實時PCR，可在微流體室內進行。在一些實施方式中，可配置熱循環儀以在微流體盒內多個微流體反應室中進行個別的(individual)熱循環和檢測協議。熱循環可用於在微流體反應室內，例如，通過實時PCR或本文描述的其它核酸擴增協議來擴增核酸，例如，DNA、RNA等。熱循環儀可包括檢測器頭，其包括多個檢測器對，例如，六個或更多檢測器頭對，其中每個檢測器對包括發光源，例如，LED等，和同種的光電二極體。在一些實施方式中，配置每個個別檢測器對以產生和檢測從螢光部分，例如，螢光探針發射的光，以指示靶多核苷酸的存在。
[0046]如本文所用，術語「微流體」指小於Iml，優選小於0.9ml，例如，0.8ml、0.7ml、0.6ml、0.5ml、0.4ml、0.3ml、0.2ml、0.1ml>90 μ I>80 μ I>70 μ I>60 μ I>50 μ 1、40 μ 1、30 μ I>20 μ 1、10 μ 1、5μ 1、4μ 1、3μ 1、2μ 1、I μ I或更小或兩者之間任何量的體積。應當理解，除非相反地特別解釋，術語PCR用於本文的地方，意欲包括PCR——包括但不限於實時和定量PCR——和任何其它形式的多核苷酸擴增的任何變體。
[0047]用於該測定的檢測過程還可以是多種多樣的以允許同時在多個反應上進行多個同時發生的測量。在一些實施方式中，這些測量可從分開的反應室進行。這些實施方式中的某些在單個PCR反應室中同時進行多個PCR反應，例如，多重PCR。PCR協議可包括在檢測之前對在反應室中進行多核苷酸的連續退火和變性的指導。這樣的指導——包括用於加熱室的時間廓線——可被稱作「協議」。公開的實施方式中的某些促進通過多個進行PCR的反應室連貫的加熱和/或冷卻，同時利用傳感器陣列促進檢測。在某些實施方式中，裝置可包括孔板，其通過將壓力施加給含有多個PCR反應室的盒而促進反應室連貫的加熱和冷卻。處理多核苷酸的某些細節和方法可在，例如，美國專利申請公開2009-0131650和美國專利申請公開2010-0009351中找到，其通過引用被併入本文。
[0048]技術人員將理解本文公開的實施方式用於多種類型的核酸擴增反應。例如，核酸擴增方法連同本文公開的實施方式可包括，但不限於:聚合酶鏈反應(PCR)、鏈置換擴增(SDA)例如多重置換擴增(MDA)、環介導的等溫擴增(LAMP)、連接酶鏈反應(LCR)、免疫-擴增和許多種基於轉錄的擴增操作，包括轉錄-介導的擴增(TMA)、基於核酸序列的擴增(NASBA)、自持續的序列複製(3SR)和滾環擴增。參見，例如，Mullis, 「擴增、檢測和/或克隆核酸序列的方法」，美國專利號4，683，195;Walker，「鏈置換擴增」，美國專利號
5,455, 166 ；Dean et al, 「多重置換擴增」，美國專利號 6，977，148 ;Notomi et al., 「合成核酸的方法」，美國專利號6，410，278;1^11(1叩代11 et al.美國專利號4，988，617，「檢測核酸中核苷酸變化的方法」 ;Birkenmeyer，「利用空位填補連接酶鏈反應的祀核酸擴增」,美國專利號5，427，930 ；Cashman, 「阻斷的聚合酶多核苷酸免疫測定法和試劑盒」，美國專利號5，849，478 ；Kacian et al.，「核酸序列擴增方法，」美國專利號5，399，491 ；Malek etal., 「增強的核酸擴增方法」，美國專利號 5，130，238 ;Lizardi et al., BioTechnology, 6:1197(1988) ；Lizardi et al.，美國專利號5，854，033 「滾環複製報導基因系統」。
[0049]在本文公開的一些實施方式中，利用寡核苷酸探針可檢測靶核酸，例如，靶擴增子。優選，探針包括一個或多個可檢測的部分一其可由本文公開的系統檢測。技術人員將理解幾種探針技術用於本文描述的實施方式。通過實例，本文公開的實施方式可與TAQMAN?探針、分子信標探針、SCORPION?探針等等一起使用。[0050]TaqMan?測定是用於檢測多核苷酸的同源測定(參見美國專利號5，723，591)。在
TAQMAN?測定中，兩個PCR引物位於中央TAQMAN?探針寡核苷酸兩側。探針寡核苷酸
含有螢光團和猝滅劑。PCR過程的聚合步驟期間，聚合酶的5』核酸酶活性切割探針寡核苷酸，引起螢光團部分變得與猝滅劑物理分離，這增加螢光發射。隨著更多PCR產物產生，在新的波長的發射強度增加。
[0051]分子信標是用於檢測多核苷酸的TAQMAN?:探針的替代物，並在，例如，美國專利號6，277，607 ;6，150,097 ;和6，037，130中被描述。分子信標是寡核苷酸髮夾，其在結合到完全匹配的模板之後經歷構象變化。寡核苷酸的構象變化增加存在於寡核苷酸上的螢光團部分和猝滅劑部分之間的物理距離。物理距離的這種增加引起猝滅劑的作用被減小，因此增加來自螢光團的信號。
[0052]鄰近的探針方法通過聚合酶鏈反應在存在兩個與靶序列的鄰近區域雜交的核酸探針的情況下擴增靶序列，探針之一用受體螢光團標記，另一個探針用螢光能量轉移對的供體螢光團標記。兩個探針與靶序列雜交之後，供體螢光團與受體螢光團相互作用，產生可檢測的信號。然後用在供體螢光團吸收的波長的光刺激樣品，和檢測來自螢光能量轉移對的螢光發射用於靶總量的測定。美國專利號6，174，670公開這樣的方法。
[0053]日出引物(Sunrise primer)利用與分子信標相似但連接到充當引物的祀結合序列的髮夾結構。當合成引物的互補鏈時，髮夾結構斷裂，由此消除淬滅。這些引物檢測擴增的產物和不需要使用具有5』外切核酸酶活性的聚合酶。日出引物由Nazarenko et al.描述(Nucleic Acids Res.25:2516-21 (1997)和在美國專利號 5，866，336 中被描述。
[0054]SCORPION?探針將引物與加入的與日出引物相似的髮夾結構結合。然而，SCORPION?探針的髮夾結構不被互補鏈的合成打開，但是由髮夾結構部分與靶的部分的雜交打開，該靶位於與引物雜 交的部分的下遊。
[0055]DzyNA-PCR包括含有DNA酶的反義序列的引物、能切割特異的RNA磷酸二酯鍵的寡核苷酸。引物結合靶序列和驅動產生擴增子的擴增反應，擴增子含有活性DNA酶。活性DNA酶然後在反應混合物中切割通用報導基因底物。報導基因底物含有螢光團-猝滅劑對，並且底物的切割產生螢光信號，螢光信號隨著靶序列的擴增而增加。DNAzy-PCR在Todd etal.，Clin.Chem.46:625-30(2000)和美國專利號 6，140，055 中被描述。
[0056]Fiandaca et al.描述利用粹滅劑標記的肽核酸(Q-PNA)探針和突光團標記的寡核苷酸引物的PCR分析的突光方法。Fiandaca et al.GenomeResearch.11:609-613(2001)。Q-PNA在引物的5』末端雜交到標籤序列。
[0057]Li et al.描述在相對的寡核苷酸鏈上具有猝滅劑和螢光團的雙鏈探針。Li etal.Nucleic Acids Research.30 (2): e5, 1-9 (2002) ? 當未結合fE時，鏈互相雜交和探針被淬滅。然而，當靶存在時，至少一條鏈與靶雜交，產生螢光信號。
[0058]用於本文公開的實施方式的螢光團標記和部分包括，但不限於，螢光素家族、羧基羅丹明家族、花青家族和羅丹明家族的染料。可用於本發明的其它家族的染料包括，例如，
聚滷螢光素-家族染料、六氯螢光素-家族染料、香豆素-家族染利P惡嗪-家族染料、
噻嗪-家族染料、方酸-家族染料、螯合的鑭系元素-家族染料、在貿易名稱AlexaFluorJ-來自Molecular Probes-下可獲得的染料家族和在貿易名稱AlexaBodipy J-來自Invitrogen(Carlsbad, Calif)--下可獲得的染料家族。突光素家族的染料包括，
例如，6-羧基螢光素(FAM)、2』，4，l，4，-四氯螢光素(TET)、2』，4』，5』，7』，l，4-六氯螢光素(HEX)、2』, 7』 -二甲氧基-4』, 5』 -二氯-6-羧基羅丹明(JOE)、2』 -氯_5』 -氟-7』，8』 -稠合的苯基_1，4- 二氣-6-竣基突光素(NED)、2』 -氣_7』 -苯基-1，4- 二氣-6-竣基突光素(VIC)、6-羧基-X-羅丹明(ROX)和2』，4』，5』，7』 -四氯-5-羧基-螢光素(ZOE)。羧基羅丹明家族染料包括四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)、四丙醇-6-羧基羅丹明(R0X)、德克薩斯紅、RllO和R6G。花青家族染料包括Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。螢光團容易商業上獲自，例如，Perkin-Elmer (Foster City, Calif.), Molecular Probes, Inc.(Eugene, Oreg.)和Amersham GE Healthcare(Piscataway, N.J.)。
[0059]如上面所討論的，在一些實施方式中，用於本文公開的實施方式的探針可包括猝滅劑。猝滅劑可以是螢光猝滅劑或非螢光猝滅劑。螢光猝滅劑包括，但不限於，TAMRA、R0X、DABCYL, DABSYL,花青染料——包括硝基噻唑藍(NTB)、蒽醌、孔雀綠、硝基噻唑和硝基噻唑化合物。消散從螢光團吸收的能量的示例性非螢光猝滅劑包括在貿易名稱Black
Hole?-來自 Biosearch Technologies, Inc.(Novato, Calif)-下可獲得的那些粹
滅劑、在貿易名稱 Eclipse?.Dark-來自 Epoch Biosciences (Bothell, Wash.)-下 可獲得的那些粹滅劑、在貿易名稱Qxl J-來自Anaspec, Inc.(San Jose, Calif.)-
下可獲得的那些粹滅劑和在貿易名稱1wa Black?-來自Integrated DNA
Technologies (Coralville, 1wa)-下可獲得的那些粹滅劑。
[0060]在上面討論的一些實施方式中，螢光團和猝滅劑一起使用，和可以在相同或不同的寡核苷酸上。當一起配對時，螢光團和螢光猝滅劑可被分別稱作供體螢光團和受體螢光團。許多方便的螢光團/猝滅劑對在本領域已知(參見，例如，Glazer etal,Current Opinion in Biotechnology, 1997;8:94-102 ；Tyagi et al., 1998, Nat.Biotechnol., 16:49-53)和容易地商業上獲自，例如，Molecular Probes (JunctionCity, Oreg.)和 Applied Biosystems (Foster City, Calif.) ? 可與多種受體突光團一起使用的供體螢光團的實例包括，但不限於，螢光素、螢光黃、B-藻紅蛋白、9-吖啶異硫氰酸鹽、螢光黃VS、4_乙酸胺基-4』 _異硫-氰酸均二苯乙烯-2，2』 _二橫酸、7-二乙氨基-3-(4』 -異硫氰醯苯基)-4_甲基香豆素、琥珀醯亞胺1-芘丁酸鹽和4-乙醯氨基-4』 -異硫氰醯均二苯乙烯-2-，2』-二磺酸衍生物。受體螢光團通常取決於使用的供體螢光團。受體螢光團的實例包括，但不限於，LC-Red640、LC_Red705、Cy5、Cy5.5、麗絲胺羅丹明B磺醯氯、四甲基羅丹明異硫氰酸鹽、羅丹明X異硫氰酸鹽、赤蘚紅異硫氰酸鹽、螢光素、二乙撐三胺戊乙酸酯或鑭系元素離子(例如，銪或鋱)的其它螯合物。供體和受體螢光團容易商業上獲自，例如，Molecular Probes 或 Sigma Chemical C0.(St.Louis, M0.) ? 用於本文公開的組合物和方法的突光團/粹滅劑對在本領域熟知和可在，S.Marras, 「用於突光核酸雜交
探針的突光團和粹滅劑對的選擇」-在全球資訊網站molecular-beacons.0rg/download/
marras.mmb06%28335%293.pdf可獲得(截至2012年4月11日)——中找到，例如，所描述。
[0061]用於本文公開的測定的檢測方法有利地允許多個可檢測的部分的多個同時的測量，例如，多個含有不同的可檢測的部分的探針等。在一些實施方式中，這些測量可從微流體盒內單獨的反應室——例如，包括室層(室層在本文指含有反應室的微流體盒的部分)——進行。這些實施方式中的某些在單個反應室中同時進行多個擴增反應，例如，多重PCR。PCR協議可包括在檢測之前對在反應室中進行多核苷酸的連續退火和變性的指導。在 某些實施方式中，配置裝置以促進通過多個反應室的連貫的加熱和/或冷卻以進行核酸擴 增，以促進個別反應室中靶擴增子的檢測，例如，通過利用傳感器陣列檢測螢光發射。
[0062]在某些實施方式中，裝置可包括孔板，其通過多個獨立的光學對將壓力施加給含 有多個反應室的盒來促進反應室的連貫的加熱和冷卻。優選配置孔板以能夠和促進多個獨 立反應室內來自探針的螢光信號的產生和檢測。在一些實施方式中，配置孔板以便微流體 盒中存在個別的孔(或窗)，其位於個別反應室中的每個之上。
[0063]診斷裝置
[0064]圖1A和IB顯示本實施方式中的某些的診斷裝置10。在圖1A中顯示的實施方式 中，診斷裝置包括裝置外殼30。外殼30可保證用於微流體樣品處理和防止不期望的光進入 檢測空間的受控環境。外殼30可包括蓋16，其包括把手14和半透明的窗12。當診斷裝置 10運行時，可將蓋16可落下以關閉診斷裝置10前面的開口。
[0065]如圖1A和IB的實施方式中所看到的，診斷裝置10可在診斷裝置10的前部容納 兩個樣本架24a、24b。然而，技術人員將理解，圖1A和IB中的診斷裝置的描述只是示例 性的，並且在一些實施方式中，可配置裝置以容納超過兩個樣本架，例如，三、四、五、六、七、 八、九、十或更多個樣本架。優選，配置裝置以容納與微流體盒相同數目的樣本架，例如，兩 個。
[0066]在一些實施方式中，每個樣本架24a、24b可包括多個支架26。支架26可包括裝診 斷試劑，如用於核酸擴增的試劑，例如，PCR試劑等的容器。架24還可包括用於製備診斷待 命樣品，如擴增待命樣品的樣本管(未顯示)和混合管(未顯示)。裝置可在架24a、24b中利 用分配器400製備期望的試劑。多種流體分配器的進一步描述可在，例如，通過引用併入本 文的美國專利申請公開2009-0130719和美國專利申請公開2009-0155123中找到。
[0067]在一些實施方式中，微流體盒(或多個)內的反應室包括核酸擴增測定中使用的一 個或多個試劑、緩衝劑等。例如，在一些實施方式中，微流體盒的反應室可包括，例如，擴增 引物、探針、核苷酸、酶如聚合酶、緩衝劑等。通過實例，在一些實施方式中，反應室可包括凍 幹試劑，將處理的生物樣品(例如，提取的核酸溶液)加入其中。然後可將製備的液體轉移至 微流體盒和插入加熱器/光學模塊500a、500b用於處理和分析。
[0068]圖1A是某些實施方式的診斷裝置10的前面平面圖。如圖1A所看到的，診斷裝置 10可包括流體分配器400——安裝在側面導軌20上。側面導軌20可以是電動機驅動的構 臺18的部分，構臺18還可包括前-後導軌22 (未顯示)。可將前-後導軌22與側面導軌 20連接和垂直地安裝到診斷裝置10中的側面導軌20。
[0069]圖1A進一步顯示加熱器/光學模塊500a、500b之上的蓋28。接收託盤520a和 520b可位於加熱器/光學模塊500a、500b的外殼下面或之內。顯不接收託盤520a處於打 開的位置，使其可接收微流體盒200。顯示接收託盤520b處於關閉的位置。關閉託盤不但 將試劑放置在合適的位置用於處理，而且進一步保護加熱器/光學模塊的內部不接收任何 不需要的雜散光。如果雜散光引入到檢測區域，那麼系統可識別來自不是從反應室發射的 光的錯誤的螢光水平。
[0070]圖1B是診斷裝置10顯示某些實施方式中內部部件中某些的診斷裝置10的透視 圖。為了更好地顯示某些部件，已將圖1A中的裝置外殼30、蓋16和加熱器/光學蓋28從圖IB的圖中去除。圖1B顯示構臺18，包括側面導軌20前-後導軌22。可將流體分配器400安裝在側面導軌20上和可沿著長的側面導軌20側面地滑動。可將側面導軌20與前-後導軌22連接，前-後導軌22可以以前-後運動。以該方式，流體分配器400可遍及診斷設備10以X、Y方向運動。如下面所描述的，流體分配器400還可在側面導軌20上在z平面中上下運動，由此給予分配器400遍及診斷設備10以三個方向的度運動的能力。
[0071]圖1B還顯示加熱器/光學模塊500a、500b，去除了圖1A的加熱器/光學模塊的蓋28。描述接收託盤520a和520b處於打開的位置和每個裝有盒200。在一些實施方式中，接收託盤可每個包括微流體盒200中的每個下面的加熱器基底600 (未顯示)。加熱器/光學模塊500a、500b還可每個包括檢測器頭700——下面被更詳細地描述。
[0072]如下面將更詳細地描述的，診斷裝置10能夠對一個或多個樣品進行實時診斷。首先可將待檢測的樣品放置在架24a或24b上的樣本管(未顯示)中。可診斷試劑可位於診斷裝置10內架24a上的支架26中。流體分配器400可混合和製備樣品用於診斷測試和然後可將製備的樣品遞送到微流體盒200用於加熱器/光學模塊500a、500b中的熱循環和分析物檢測。可選地，流體分配器400可將核酸樣品遞送到微流體盒的反應室，其中微流體盒的反應室已經含有擴增反應的試劑。
[0073]圖2顯示診斷裝置10的內部視圖，顯示容納許多樣品管32和試劑支架26的架24a，和位於接收託盤520a中的盒200。接收託盤520a處於打開的位置——從具有連接的蓋28的加熱器/光學模塊500a延伸。接收託盤520b處於關閉的位置。有利地,在一些實施方式中，接收託盤520a、b可允許用戶或自動裝填設備容易地放置微流體盒200。這樣的設計還可利用機器人流體分配器400提供樣品的多路復用(multiplexed)移液。
[0074]接收託盤
[0075]如圖2所顯示的，凹面板524可以是接收託盤520的部分，其被配置以選擇性地接收微流體盒200。例如，凹面板524和微流體盒200可具有邊緣526，其在形狀上互補以便微流體盒200以，例如，單個定向而被選擇性地接收。例如，微流體盒200可具有定位(registration)部件202,其適合凹面板的互補特徵。定位部件202可以是,例如，盒200邊緣上的切掉部分(如圖3A所示)或一個或多個在一個或多個側面上形成的凹口。技術人員將容易理解，利用其它合適的排列，例如，在孔內適合的標杆或突出，盒和接收板之間的互補性可容易獲得。通過選擇性地接收盒200，凹面板524可幫助用戶放置盒200以便光學模塊502可在盒200上正確地運行。以該方式，可獲得盒200的無誤差排列。
[0076]可排列接收託盤520以便安置可在微流體盒200上運行的裝置的各個部件(如，熱源、檢測器、力部件等)以在微流體盒200正確地運行，同時將盒200接收在接收託盤520的凹面板524中。例如，可將加熱器基底600上的接觸熱源安置在凹面板524中，以便熱源可熱連接到接收託盤520中接收的微流體盒200上的不同位置。
[0077]微流體盒
[0078]某些實施方式考慮微流體盒，該微流體盒被配置以對來自一個或多個樣品的一個或多個多核苷酸進行擴增，如通過PCR。盒指整體或部分地用後可棄或可重複使用的單元，和可被配置以與一些其它裝置——已被合適和互補地配置以在(如將能量遞送給)盒上接收和運行-一起使用的單元。
[0079]如本文所用，微流體指樣品、和/或試劑、和/或擴增的多核苷酸的體積是約0.1μ I至約999 μ 1，如1-100 μ 1，或2-25 μ 1，如上面所定義的。相似地，當應用到盒時，術語微流體指盒的各個部件和通道，如本文所進一步描述的，被配置以接受、和/或保留、和/或促進樣品、試劑或擴增的多核苷酸的微流體體積的通過。本文的某些實施方式還可用納升體積(在10-500納升的範圍，如100納升)起作用。
[0080]圖3Α是微流體盒200的頂部平面圖。盒200可包括多個樣品泳道1706a_c。泳道可通往位於盒的「左」和「右」側(即，排)的PCR室1703。如圖3a中所指出的，泳道可在接近用戶的方便位置提供入口 1705。然而，與口連接的泳道然後可採取獨立的路徑以分離室1703a_c。在圖3a的實施方式中，例如，第一泳道1706a與左側的第一室1703a相通，第二泳道1706b與右側1703b的第一室相通，第三泳道1706c與左側的第二室1703c相通，等等。每個微流體泳道還可包括微流體閥1702、1704，微流體門和微流體通道。這些門和閥可，例如，通過熱致動，被配置以促進盒200的泳道1706內某些流體的定時釋放和受控擴散。該實施方式的盒可包括通風孔1701，其防止空氣阻塞盒內的液體通道。各個盒部件如閥的進一步描述可在，例如，通過引用併入本文的美國專利申請公開2009-0130719中找到。
[0081]微流體盒200可包括定位部件202，例如，線路中斷器(cutout)，其對應加熱器/光學模塊500a、500b的接收託盤520a、b的凹面板524中互補的邊緣。定位部件202和互補的邊緣526可允許接收託盤520a、b中的微流體盒200的安全和正確的放置。
[0082]在各種實施方式中，盒200的樣品泳道1706中微流體網絡的部件可在加熱器基底600中通過用加熱器熱耦合它們而被加熱。加熱器基底600可被配置以加熱樣品混合物一一包括擴增試劑和擴增待命的多核苷酸樣品——和使其經歷適合從擴增待命的樣品產生擴增子的熱循環條件。在一些實施方式中，加熱器基底600可位於盒200上或在凹面板524中。
[0083]每個泳道中的微流體網絡可被配置以對擴增待命的樣品，如含有從樣品提取的核酸的擴增待命的樣品進行核酸擴增，如通過PCR。擴增待命的樣品可包括擴增試劑和提取的多核苷酸樣品的混合物。混合物可適合經受熱循環條件以從提取的多核苷酸樣品產生擴增子。例如，擴增待命的樣品，如PCR待命的樣品，可包括PCR試劑混合物，其包括聚合酶、陽性對照核酸、對陽性對照核酸的至少部分選擇性的螢光雜交探針和多個核苷酸，和對靶多核苷酸序列選擇性的至少一個探針。微流體網絡可被配置將來自外部熱源的熱與包括PCR試劑和提取的多核苷酸樣品的混合物在適合從提取的多核苷酸樣品產生PCR擴增子的熱循環條件下結合。
[0084]在各個實施方式中，試劑混合物可包括螢光標記或其它光學上可檢測的標記用於期望的擴增子的產生的檢測。在一些實施方式中，多組引物和多個標記可用於多重測定形式，例如，多重PCR，其中多個不同的擴增子中的每個可在單個反應室中被檢測，如果存在的話。例如，一個測定室可包括來自測試樣品的模板核酸、陽性對照模板核酸、一個或多個用於特定靶序列擴增的引物、一個或多個用於靶擴增子檢測的探針、和用於陽性對照擴增子檢測的一個或多個引物對和探針。另外，技術人員將理解，在一些實施方式中，微流體盒提供陰性對照多核苷酸，其將不用用於擴增靶序列或陽性對照序列的引物對產生擴增子。
[0085]在顯示的實施方式中的某些中，分別與多泳道盒200的每個泳道1706a_c連接的室1703a-c可進行獨立的擴增反應。前兩個泳道(1706a、1706b)的第一列室(1703a、1703b)的反應結果然後可利用包括「左」和「右」光源-光檢測器對的檢測器頭同時和獨立地測量。即每個泳道1706a-b的每個室1703a-b可接收來自單獨光源的光和由單獨光檢測器同時觀察。以該方式，許多種反應組合可在盒中有效地進行。例如，在一些實施方式中，用於多個靶核酸檢測的多個擴增測定可在一個泳道中進行，陽性對照和陰性對照在兩個其它泳道中進行；或用於一個或多個靶核酸的檢測的一個或多個擴增測定分別連同內部陽性對照在一個泳道中進行，陰性對照在單獨的泳道中。在一個【具體實施方式】中，2、3、4、5、6或更多個測定在單個泳道中多重進行，反應室中具有至少該數目的螢光性不同的螢光團。
[0086]微流體盒200可由許多層構成。相應地，本技術的一個方面涉及微流體盒，其包括第一、第二、第三、第四和第五層，其中一個或多個層限定多個微流體網絡，每個網絡具有多個部件——其被配置以對樣品進行PCR，其中一個或多個多核苷酸的存在或缺乏將被測定。在另一個實施方式中，微流體盒200可包括多個泳道，每個包括反應室一其在單個平面如在模塑基底中被蝕刻或塑造，每個泳道由蓋層如粘性塑料薄膜層關閉。考慮具有每個盒8、
10、12、14、16、18、20、22、24、28、30或更多個泳道的實施方式。例如，一個合適的設計是具有24個反應室的單個盒200，24個反應室分兩排排列，每排12個反應室，任選地具有相對對齊的入口。各種盒和它們的部件的進一步描述可在，例如，通過引入併入本文的美國專利申請公開2008-0182301和美國專利申請公開2009-0130719中找到。
[0087]加熱器基底
[0088]圖3B顯示加熱器基底600的某些實施方式的頂部平面圖。可使用任何類型的加熱器，包括加熱電阻絲、珀爾加熱器或動液(moving-fluid)加熱器，考慮被動或主動冷卻。許多可能的實施方式之一包括多個與每個反應室熱接觸的加熱電阻絲，優選還包括一個或多個溫度傳感器。因為加熱電阻絲還顯示一些熱敏電阻作用，即，它們的電阻隨著溫度而變化，加熱電阻絲自身可兼作溫度傳感器，允許每個反應室的精確的溫度控制同時簡化產物設計。雖然加熱器可被彼此一致地控制，但是在一些實施方式中，每個反應室可具有一個或多個與此熱接觸的個別的加熱器，以便加熱器是分別可控的和每個反應室可與其他反應室被獨立地加熱和允許冷卻。這允許在多個反應室中的每個中同時進行不同的測定。與個別反應室一起使用的一個具體的加熱電阻絲部件顯示在圖3B中。在圖3B顯示的實施方式中，頂部傳感器加熱器/傳感器1604、底部加熱器/傳感器1603、側面加熱器/傳感器1601和中央加熱器/傳感器1602的任何組合可用於加熱位於上面的反應室。為了容易理解，將某些實施方式的PCR室1703的輪廓覆蓋在加熱器基底上。在某些實施方式中，加熱器基底600中的加熱器可以是接觸加熱器。這樣的接觸加熱器可包括(例如)加熱電阻絲(或其網絡)、散熱器、流體熱交換器和珀爾(Peltier)設備。接觸熱源可被配置在凹面板524中以被熱耦合到接收託盤520a、b中接收的微流體盒200中的一個或多個不同位置，藉此不同位置被選擇性地加熱。接觸熱源可每個被配置在加熱器基底600中以被獨立地熱耦合到接收託盤520a、b中接收的微流體盒200的不同位置，藉此不同位置被獨立地加熱。接觸熱源可有利地被配置以與接收託盤520a、b中接收的微流體盒200中的不同位置直接的物理接觸。在各個實施方式中，每個接觸源加熱器可被配置以加熱具有約I毫米(_)至約15_(通常約Imm至約IOmm)的2維平均直徑的不同位置,或具有約Imm約225mm之間(在一些實施方式中，約Imm和約IOOmm之間，或在一些實施方式中，約5mm和約50mm之間)的表面面積的不同位置。
[0089]可將加熱器基底600構成「泳道」1605a、b——平行盒200的泳道1706a_c的結構。在一些實施方式中，加熱器基底600可包括24個加熱器泳道1605a、1605b——對應盒200 的樣品泳道1706。當將微流體盒200放置在接收託盤520a、b的凹面板524中時，可將盒 200的部件鄰近加熱器基底600中相應的加熱器和在加熱器基底600中相應的加熱器之上 排列。當將微流體盒200放置在凹面板524中時，可將加熱器與各自的部件物理接觸。在 一些實施方式中，加熱器保持熱耦合到它們各自的部件，例如，通過一個或多個中間層或材 料，儘管不是直接的物理接觸。泳道的進一步描述可在例如，通過引用併入本文的美國專利 申請公開2009-0130719中找到。
[0090]在一些實施方式中，多個加熱器可被配置以同時和均勻地激活從而加熱微流體盒 200中微流體網絡的各自鄰近的盒部件。每個加熱器可以由處理器和/或與本文描述的裝 置一起使用的控制電路獨立地控制。通常，微流體盒200中微流體部件(門、閥、室等)的加 熱通過使電流通過合適配置的微製造的加熱器來控制。在合適的電路控制下，多泳道盒的 泳道1706然後可被彼此獨立地加熱，和由此被獨立地控制。此外，如下面更詳細地描述，個 別加熱器1601-1604可被彼此獨立地加熱，和由此被獨立地控制。這可導致更大的能效和 對裝置的控制，因為不是所有的加熱器在同一時間被加熱，並且給定的加熱器正接收電流 持續僅當它需要加熱時的時間部分。
[0091]加熱器基底600還可包括一個或多個熱傳感器。為了減少控制加熱器泳道1605a、 1605b中的加熱器所需要的傳感器或加熱器的數目，加熱器可用於傳感溫度以及熱，和由此 排除每個加熱器都具有單獨的專用傳感器的需要。例如，一些材料的阻抗和/或電阻隨著 周圍溫度而變化。相應地，加熱器/傳感器1601-1604的電阻可用作當傳感器沒有正被主 動加熱時的溫度指示。
[0092]在一些實施方式中，加熱器基底600中的加熱器可被設計具有足夠的瓦特數以允 許加將熱器串聯或並聯聚集以減少電子可控的元件的數目，由此減少連接的電子電路的負 荷。以該方式集合的加熱器將在同步和基本上同時控制下運行。
[0093]在一些實施方式中，第二階段加熱器對側上的反應室加熱器可被聚集和配置以在 同步的控制下運行。例如，在一些實施方式中，PCR/擴增加熱器1601-1602可被聚集和配 置以在同步的控制下運行。可選的聚集和配置可應用到PCR/擴增加熱器1601-1604的其 它加熱器組。PCR/擴增加熱器1601-1604可被配置以個別地和獨立地運行或它們可被配置 以兩個(成對)、三個、四個、五個或六個的組來運行。
[0094]在一些實施方式中，加熱可通過用不同的脈衝寬度調製(PWM)周期性地接通和斷 開到各自加熱器的電流來控制，其中脈衝寬度調製指電路的接通持續時間/停止時間比。 電流可通過將微制(micro fabricated)加熱器連接到高壓源(例如,30V)而供應,這可由 PWM信號選通。在一些實施方式中，該設備可包括48個PWM信號發生器。在一些實施方式 中，將存在兩個與每個反應室連接的PWM信號發生器。PWM發生器的運行可包括產生具有 選擇的、可編程的時期(結束計數(the end count))和粒度的信號。例如，信號可以是具有 Ius粒度的4000us (微秒),在這種情況中PWM發生器可保持當它返回到零時在零開始和以 Ius的增量前進直到它達到4000US的計數器。因此，產生的熱的量可通過調節結束計數來 調節。高的結束計數對應更大長度的時間，在該時間期間微制加熱器接收電流和因此產生 的更大量的熱。
[0095]在各個實施方式中，除了前面提到的結束計數和粒度，PWM發生器的運行還可包括可編程的起始計數。在這樣的實施方式中，多個PWM發生器可產生這樣的信號，其可選擇性地非重疊(例如，通過加倍各個加熱器的接通持續時間)以便不超過高壓電源的電流容量。
[0096]多個加熱器可由具有變化的起始和結束計數的不同的PWM信號發生器控制。加熱器可被分成組，藉此組限定一組具有相同起始計數的加熱器。某些實施方式中加熱元件，和冷卻元件——如果存在的話——的控制在下面被進一步詳細地討論。
[0097]光學模塊
[0098]圖4A-C顯示某些實施方式中提供的檢測裝置10的加熱器/光學模塊500。加熱器/光學模塊500可包括光學模塊502和接收託盤520或接收託盤的部分。圖4A顯不封入的光學模塊502的一個實施方式，該光學模塊502具有與其外部連接的電動機504用於驅動檢測器頭700的運動。可將檢測器頭700放置在光學模塊502內部。圖4A顯示接收託盤520，其與光學模塊502的底面506連接。接收託盤520可接收包括樣品的盒200，對樣品將進行檢測。接收樣品之後，可將接收託盤520在導軌522上運動(例如，機械地或手動地)到光學模塊502下面的位置。在下面被更詳細地描述的一些實施方式中，接收託盤可包括自動裝載設備，一旦位於光學模塊502下面，該自動裝載設備自動地排列盒。在一些實施方式中，接收託盤520的凹面板524可含有加熱器基底600。在一些實施方式中，接收託盤可隨後被升高以將盒與光學模塊502接觸，如與在光學模塊502基底的孔板540接觸而放置。
[0099]圖4B顯不光學模塊502的實施方式,前面板508被去除以顯不光學模塊502的內部。圖4B顯示檢測器頭700。如下面更詳細地描述的，檢測器頭700的運動可由電動機504驅動以穿過光學模塊502的內部側向運動，以當盒200安置於接收託盤520中光學模塊502下面時提供對盒200的光學掃描和檢測。圖4B顯不孔板540,其位於光學模塊502的底面506 上。
[0100]圖4C提供光學模塊502的底部平面圖。圖4C顯不孔板540,規格化裝置板(normalizer plate) 546與光學模塊502的底部506連接。規格化裝置板可用於校準檢測器頭的光源-光檢測器對。規格化裝置板546優選包括一個或多個具有已知、標準化的光學特性的部件，和被配置以校準、標準化或證實檢測器頭700和連接的電路的正確操作。規格化裝置板546可延伸進光學模塊，並可將檢測器頭700位於規格化裝置板之上。在一些實施方式中，在盒光學測量開始之前，利用規格化裝置板546的已知性質校準檢測器頭700。如果檢測器頭700沒有正確地工作，那麼可採取校正活動，如包括測量中的偏移或通知用戶該錯誤。在一些實施方式中，規格化裝置板可由光學上透明的材料製成，如混合有高度螢光染料的聚碳酸酯或其它標準化的生色團或螢光團。在一個實施方式中，規格化裝置板包括針對檢測器頭700中每個通道或顏色的標準化的生色團或螢光團。
[0101]如圖4C所示，孔板540含有孔557。孔557的尺度是這樣的，當將檢測器運動到光學模塊502內的多個位置時，檢測器的光源和光檢測器可接近(光學地激發或觀察)盒200的反應室中的內容物。即，當檢測器的光源-光檢測器對位於特定孔之上的位置時，光可從光源運行和通過孔557達到室反應器。反應室中的發螢光試劑然後可通過孔557對光檢測器可見。
[0102]檢測器頭
[0103]圖5顯示沿著圖4B的線13取得的檢測器頭700的橫斷面。檢測器頭700可被配置以光學地激發和/或監測從一個或多個存在於反應室1703的多核苷酸發射的螢光連同檢測一個或多個存在於反應室1703的多核苷酸。注意，陽性結果(靶擴增子的存在)可由增加的螢光或減少的螢光指示，取決於測定設計。例如，當測定包括螢光團和猝滅劑時，當靶存在時猝滅劑可淬滅螢光，或在其它測定設計中，當缺乏靶時。該系統可包括，例如，多個檢測器對，例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 或更多，如檢測器對726。每個檢測器對726可由光源726a，如發光二極體(LED)，和相應的光檢測器726b,如光電二極體構成。光源726a可選擇性地在突光探針的吸收譜帶發射光。光檢測器726b可選擇性地在螢光探針的發射譜帶檢測光，其中螢光探針對應多核苷酸探針或其片段。在某些實施方式中，光源726a可包括帶通過濾的二極體，其選擇性地在螢光探針的吸收譜帶發射光。光檢測器726b可包括帶通過濾的光電二極體，其選擇性地在螢光部分的發射譜帶——例如，螢光探針的發射——檢測光。在某些實施方式中，濾波器726al，如帶通濾波器可被應用到光源726a的光。來自光源726a的光在通過微流體通道中的樣品(在某些實施方式中300g深)之前通過濾波器。在某些實施方式中，從反應室到光檢測器726b的光的光路長度可以非常小。來自光源726a的入射光在反應室中產生螢光。來自反應室的光然後傳播到光檢測器726b。某些實施方式尋求減輕任何不期望的光進入檢測器和由此不利地影響來自反應室的光信號。
[0104]在一些實施方式中，多個檢測器對中的每一個可沿著檢測器頭700的長度成排排列。即，圖5中顯示的對726和727後面可以是以相似或相同定向的另一列對。為了說明，將沿著盒的長度的盒或檢測器對的集合稱作「排」，和將沿著寬度的那些稱作「列」。因此，圖3A和6中的垂直方向指示「列」和水平的方向為「排」。某些實施方式考慮這樣的檢測器對的六或更多個列。在這些實施方式中，將存在總共12個檢測器對(兩排，每排六個)，每列兩個檢測器對，允許12分開和同時檢測。
[0105]每個光源，如例如光源726a，可被配置以產生對與，例如，反應室中含有的探針關聯的特定螢光部分特異的波長的光。每個光檢測器，如例如726b，可被配置以檢測與檢測器對中的光發射器產生的光關聯的螢光探針發射的光。檢測器對可被配置以獨立地檢測多個螢光部分，例如，不同的螢光探針，具有不同的螢光發射光譜，其中在每個反應室中，來自每個螢光探針的發射指示一個特定的靶多核苷酸或其片段的存在或不存在。雖然可利用摺疊光路，但是一個實施方式利用這樣的檢測器和發射器對，其中每個與反應室直接光學接觸，優選同時這樣的接觸。任選地，將一對檢測器和發射器與反應室沿著在反應室以銳角基本相交的線排列。該角可以是，例如，約5和70度之間，優選約8和60度之間，更優選約10和50度之間。
[0106]在一些實施方式中，當存在於裝置中時，檢測器頭包括兩排光檢測器和光源對，其對應微流體盒的兩排反應室。例如，檢測器頭可包括第一排或頂排六個光檢測器和光源對，和第二排或底排光檢測器和光源對，其被配置以分別查詢微流體盒內的第一和第二排反應室。
[0107]圖6顯示檢測器的某些實施方式中執行的一個可能的光檢測器和光源布置圖。第一列包括ROX光發射器201a、201b和對應的檢測器207a、207b。第二列包括HRM光發射器201c、201d和對應的檢測器207c、207d。第三列包括CY5光發射器201e、201f和對應的檢測器207e，207f。第四列包括FAM光發射器201g、201h和對應的檢測器207g、207h。第五列包括Q705光發射器2011、201 j和對應的檢測器2071、207j。第六列包括VIC光發射器201k、2011和對應的檢測器207k、2071。在一些實例中，參考將用於測定的特定螢光團來選擇檢測器和發射器。在圖6中顯示的實施方式中，第一排或頂排檢測器和光源對包括多個光檢測器和光源對，例如發射器201a、201c、201e、201g、201i和201k和檢測器207a、207c、207e.207g.207i和207k。第二排或底排檢測器和光源對包括多個光檢測器和光源對，例如發射器 201b、201d、201f、201h、201 j 和 2011 和檢測器 207b、207d、207f、207h、207 j 和 2071。示例的發射器和檢測器的性質概括顯示在下面的表1中。
[0108]表1
[0109]
【權利要求】
1.進行實時核酸擴增和檢測的裝置，包括:檢測器頭，所述檢測器頭包括多個光檢測器和光源對，所述檢測器頭被安裝到導軌上，其中將所述檢測器和光源對排列到第一排和第二排中；微流體盒的容器，所述微流體盒的容器包括多個在第一排和第二排相鄰的列中排列的獨立反應室；和孔板，所述孔板被配置以當所述盒存在於所述容器中時安置在所述微流體盒之上，所述檢測器頭位於所述孔板之上；其中所述孔板包括多個孔，當所述容器容納所述微流體盒時，所述多個孔每個排列在所述多個反應室的每個之上；其中所述檢測器頭沿著所述導軌可移動，以便可將所述第一排中所述多個光檢測器和光源對中的每個安置在所述孔板的所述第一排中每個孔之上，和可將所述第二排中所述多個光檢測器和光源對中的每個安置在所述孔板的所述第二排中每個孔之上。
2.權利要求1所述的裝置，進一步包括第二檢測器頭，所述第二檢測器頭包括多個光檢測器和光源對，被安裝到所述導軌上，其中將所述第二檢測器和光源對排列到第一排和第二排中；微流體盒的第二容 器，所述微流體盒的第二容器包括多個在第一排和第二排相鄰的列中排列的獨立反應室；和第二孔板，所述第二孔板被配置以當所述第二盒存在於所述第二容器中時安置在所述第二微流體盒之上，所述第二檢測器頭位於所述孔板之上；其中所述第二孔板包括多個孔，當所述容器容納所述第二微流體盒時，所述多個孔每個排列在所述第二微流體盒的所述多個反應室的每個之上；其中所述第二檢測器頭沿著所述導軌可移動，以便可將所述第二檢測器頭的所述第一排中所述多個光檢測器和光源對中的每個安置在所述第二排孔板的所述第一排中每個孔之上，和可將所述第二檢測器頭的所述第二排中所述多個光檢測器和光源對中的每個安置在所述第二排孔板的所述第二排中每個孔之上。
3.權利要求1所述的裝置，其中所述光檢測器和光源對包括以六個不同的波長操作的至少六個不同的光檢測器和光源對。
4.權利要求3所述的裝置，其中所述六個不同的波長包括發射綠色光的光源、發射黃色光的光源、發射橙色光的光源、發射紅色光的光源和發射深紅色光的光源。
5.權利要求1所述的裝置，所述檢測器頭包括至少N排光檢測器和光源對，並配置所述檢測器以在包括M排孔的孔板之上移動到至少M+N-1個位置。
6.權利要求1所述的裝置，其中所述孔板包括鋼。
7.權利要求6所述的裝置，其中所述孔板包括大約.25英寸的厚度。
8.權利要求1所述的裝置，其中將至少部分所述孔板電化學地氧化以比當所述孔板未被電化學地氧化時更暗。
9.權利要求1所述的裝置，其中當所述盒存在於所述容器中時，所述孔板提供通過所述微流體盒區域的基本上均勻的壓力。
10.權利要求1所述的裝置，進一步包括加熱器板，其中如果存在於所述容器中時，將所述加熱器板安置於所述微流體盒下面。
11.權利要求10所述的裝置，其中當所述盒存在於所述容器中時，所述孔板提供基本上通過所述微流體盒區域的基本上均勻的壓力，並且其中所述基本上均勻的壓力促進所述反應室和所述加熱器板之間基本上均勻的熱接觸。
12.權利要求1所述的裝置，其中所述孔板包括鋁、鋅或鎳中至少一個，所述孔板進一步包括著色劑。
13.權利要求1所述的裝置，其中配置所述反應室以相對於所述光檢測器在掠射角從所述光源接收光。
14.權利要求12所述的裝置，其中所述加熱器板包括多個加熱元件，其中安置所述多個加熱元件中的每個，以便當所述微流體盒存在於所述容器中時，所述多個加熱元件分別與所述多個反應室中的每個熱連通。
15.在一個或多個計算機處理器上執行的用於優化同時進行多個熱循環反應的協議的方法，其中每個熱循環反應包括一個或多個檢測步驟，和其中所述熱循環反應在多個反應器中進行，所述方法包括:測定或提供或訪問所述多個反應器中每個的檢測循環時間；接收或訪問協議步驟，所述步驟與步驟持續時間相關，所述步驟包括檢測時間；和測定對所述步驟的第一調節以便所述步驟持續時間是多倍所述檢測循環時間。
16.權利要求15所述的方法，進一步包括測定對所述步驟的第二調節，其中當所述步驟由所述第一調節和由所述第二調節來調節時，所述檢測時間是多倍所述檢測循環時間。
17.權利要求15所述的方法，進一步包括基於與所述協議相關的反應室的位置測定起始偏移調節。
18.權利要求15所述的方法，其中所述檢測循環時間包括檢測器頭對反應器進行的預設的多個檢測需要的時間量。
19.權利要求18所述的方法，其中所述檢測循環時間進一步包括所述檢測器頭運動到多個反應器中的每個和所述檢測器頭運動到所述起始位置所需要的時間。
20.權利要求15所述的·方法，其中協議包括聚合酶鏈反應(PCR)協議。
21.權利要求15所述的方法，進一步包括啟動所述協議。
22.包括指令的永久性計算機可讀介質，所述指令被配置以引起一個或多個處理器進行以下方法:測定或提供或訪問檢測循環時間；接收或訪問協議步驟，所述步驟與步驟持續時間相關，所述步驟包括檢測時間；測定對所述步驟的第一調節以便所述步驟持續時間是多倍所述檢測循環時間。
23.權利要求22所述的永久性計算機可讀介質，其中所述協議步驟與來自多個協議的協議相關，所述多個協議中的每個與多個熱循環反應中至少一個相關，其中每個熱循環反應包括一個或多個檢測步驟，並且其中當所述多個協議中的兩個或多個同時運行時，所述測定第一調節至少部分基於一個或多個與所述多個協議中至少兩個或多個的所述熱循環反應相關的檢測步驟的計時。
24.權利要求22所述的永久性計算機可讀介質，所述方法進一步包括測定對所述步驟的第二調節，其中當所述步驟由所述第一調節和由所述第二調節來調節時，所述檢測時間是多倍所述檢測循環時間。
25.權利要求22所述的永久性計算機可讀介質，所述方法進一步包括基於與所述協議相關的反應室的位置測定起始偏移調節。
26.權利要求22所述的永久性計算機可讀介質，其中檢測循環時間包括檢測器頭對反應室進行預設的多個檢測所需要的時間量。
27.權利要求26所述的永久性計算機可讀介質，其中所述檢測循環時間進一步包括所述檢測器頭運動到多個反應室檢測位置中的每個和所述檢測器頭運動到起始位置所需要的時間。
28.權利要求22所述的永久性計算機可讀介質，其中所述協議包括聚合酶鏈反應(PCR)協議。
29.權利要求22所述的永久性計算機可讀介質，所述方法進一步包括啟動所述協議。
30.優化針對多個反應室的協議的系統，所述系統包括: 處理器，其被配置以進行以下操作: 測定或提供或訪問檢測循環時間； 接收或訪問協議步驟，所述步驟與步驟持續時間相關，所述步驟包括檢測時間；和 測定對所述步驟的第一調節以便所述步驟持續時間是多倍所述檢測循環時間。
31.權利要求30所述的系統，其中所述協議步驟與來自多個協議的協議相關，所述多個協議中的每個與多個熱循環反應中至少一個相關，其中每個熱循環反應包括一個或多個檢測步驟，並且其中當所述多個協議中的兩個或多個同時運行時，測定第一調節至少部分基於一個或多個與所述多個協議中至少兩個或多個的所述熱循環反應相關的檢測步驟的計時。
32.權利要求30所述的系統，其中所述處理器被進一步配置以測定對所述步驟的第二調節，其中當所述步驟由所述第一調節和由所述第二調節來調節時，所述檢測時間是多倍所述檢測循環時間。
33.權利要求30所述的系統，其中所述處理器被進一步配置以基於與所述協議相關的反應室的位置測定起始偏移調節。
34.權利要求30所述的系統，其中所述檢測循環時間包括檢測器頭對反應室進行預設的多個檢測所需要的時間量。
35.權利要求34所述的系統，其中所述檢測循環時間進一步包括所述檢測器頭運動到多個反應室檢測位置中的每個和所述檢測器頭運動到所述起始位置所需要的時間。
36.權利要求30所述的系統，其中所述協議包括聚合酶鏈反應(PCR)協議。
37.權利要求30所述的系統，所述處理器被進一步配置以啟動所述協議。
38.在多個PCR反應室中同時進行實時PCR的方法，包括: (a)提供足以讓檢測器組合件進行掃描循環的掃描時間，在所述時間裡其可針對至少一個可檢測的信號掃描所述多個PCR反應室中的每個和變為準備重複所述掃描； (b)為所述PCR反應室中的每個提供反應協議，所述反應協議包括多個循環，每個循環包括循環時間，所述循環時間包括至少一個加熱步驟、至少一個冷卻步驟和至少一個溫度平穩時期，所述溫度平穩時期包括讀取循環時期，所述檢測器組合件在所述讀取循環時期期間將針對至少一個可檢測的信號而掃描所述反應室； (c)利用處理器測定是否所述反應室的所述循環時間與所述掃描時間相同或是整數倍的所述掃描時間，如果不是，則調節所述掃描時間或所述循環時間以便所述循環時間與所述掃描時間相同或是整數倍的所述掃描時間；(d)針對所述多個PCR反應室中每個的所述反應協議進行至少步驟(b)和(C)，以便每個反應協議的所述循環時間與所述掃描時間相同或是整數倍的所述掃描時間；和(e)在處理器的指導下，在所述反應室中的每個上利用所述反應室中每個的所述反應協議進行實時PCR，包括用所述檢測器組合件進行多個掃描循環，其中每個PCR反應室在所述反應室的每個讀取循環時期期間由所述檢測器組合件來掃描。
39.權利要求38所述的方法，進一步包括調節至少一個所述反應室的所述反應協議的所述循環時間的階段。
40.權利要求38所述的方法，其中至少一個所述反應協議與另一個所述反應協議不同。
41.權利要求40所述的方法,其中一個反應協議中至少一個循環時間與另一個反應協議中的所述循環時間 不同。
【文檔編號】G01N35/02GK103597358SQ201280029319
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年4月13日 優先權日:2011年4月15日
【發明者】T·C·古巴塔瑤, K·漢卓爾, K·加尼森, D·M·多蒙德 申請人:貝克頓·迪金森公司