利用顆粒細胞端粒長度來判斷胚胎發育潛能的方法

2023-10-06 04:16:09

利用顆粒細胞端粒長度來判斷胚胎發育潛能的方法
【專利摘要】本發明涉及一種利用顆粒細胞端粒長度來判斷胚胎發育潛能的方法，將女性的年齡段化分為小於等於35歲或大於35歲兩個階段，然後根據用於受精的卵母細胞的顆粒細胞相對端粒長度T／S值來判斷其是高發育潛能的胚胎或是低發育潛能的胚胎。本發明是一種較為客觀、準確、可量化的胚胎質量評價方法，無創、且無需反覆拿出培養箱觀察，減少了不良環境刺激。由於本發明可量化，有具體的數值範圍，操作容易，避免了因人為主觀因素使判斷標準出現不統一的問題。
【專利說明】利用顆粒細胞端粒長度來判斷胚胎發育潛能的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種利用顆粒細胞端粒長度來判斷胚胎發育潛能的方法。

【背景技術】
[0002] 卵泡（follicle)中卵母細胞四周有一層菱形或扁平細胞圍繞，在卵泡開始發育、 卵細胞成長的同時，周圍的菱形細胞變為立方形，並由單層增生成復層，因其細胞漿內含有 顆粒，故稱為顆粒細胞（granulosa cells)。端粒學說由Olovnikov提出，認為細胞在每 次分裂過程中都會由於DNA聚合酶功能障礙而不能完全複製它們的染色體，因此最後複製 DNA序列可能會丟失，最終造成細胞衰老死亡。故顆粒細胞一般與人體的衰老研宄有關。
[0003] 體外受精-胚胎移植（in-vitro fertilization，IVF-ET)和卵母細胞單精子注射 (intra-cytoplasmic sperm injection，ICSI)治療不孕症的成功率主要取決於體內子宮 環境和移植胚胎的質量和數目。研宄證明，胚胎質量的評估選擇有助於減少多胎妊娠，提高 種植率和臨床妊娠率。評估胚胎是否具有高著床潛能是現代輔助生殖技術的重點，用於評 估胚胎質量的主要參數為原核期評分和卵裂期胚胎的形態及發育速度。
[0004] 目前，臨床實踐中，胚胎評級主要基於主觀的光鏡形態學分析，包括卵母細胞質 量、原核期形態、卵裂球數量、卵裂球的均勻程度及胚胎碎片。未見有利用顆粒細胞端粒長 度來判斷胚胎發育潛能的相關研宄報導。


【發明內容】

[0005] 本發明要解決的技術問題是：提供一種較為客觀、準確、可量化的利用顆粒細胞端 粒長度來判斷胚胎發育潛能的方法。
[0006] 解決上述技術問題的技術方案是：一種利用顆粒細胞端粒長度來判斷胚胎發育潛 能的方法，所述的顆粒細胞端粒長度是指顆粒細胞相對端粒長度，用T/S值表示，
[0007] 年齡小於或等於35歲的女性，用於受精的卵母細胞的顆粒細胞相對端粒長度T/S 值為4. 09?5. 89時，判斷得到的胚胎為高發育潛能的胚胎，用於受精的卵母細胞的顆粒細 胞相對端粒長度T/S值為1. 95?3. 95時，判斷得到的胚胎為低發育潛能的胚胎；
[0008] 年齡大於35歲的女性，用於受精的卵母細胞的顆粒細胞相對端粒長度T/S值為 3. 72?5. 92時，判斷得到的胚胎為高發育潛能的胚胎，用於受精的卵母細胞的顆粒細胞相 對端粒長度T/S值為1. 44?3. 20時，判斷得到的胚胎為低發育潛能的胚胎。
[0009] 現有的形態學評分存在的缺陷，如胚胎形態學評分並不能全面地反映胚胎的發育 潛能，過多依賴於實驗室技術人員的主觀判斷標準，觀察時間過短，數據之間缺乏聯繫，同 時缺少客觀可量化的指標等。而本發明是一種較為客觀、準確、可量化的胚胎質量評價方 法，無創、且無需反覆拿出培養箱觀察，減少了不良環境刺激。由於本發明可量化，有具體的 數值範圍，操作容易，避免了因人為主觀因素使判斷標準出現不統一的問題。
[0010] 下面，結合實施例對本發明之利用顆粒細胞端粒長度來判斷胚胎發育潛能的方法 的技術特徵作進一步的說明。

【具體實施方式】
[0011] 實施例1: 一種利用顆粒細胞端粒長度來判斷胚胎發育潛能的方法，所述的顆粒 細胞端粒長度是指顆粒細胞相對端粒長度，用T/S值表示，
[0012] 年齡小於或等於35歲的女性，用於受精的卵母細胞的顆粒細胞相對端粒長度T/S 值為4. 09?5. 89時，判斷得到的胚胎為高發育潛能的胚胎，用於受精的卵母細胞的顆粒細 胞相對端粒長度T/S值為1. 95?3. 95時，判斷得到的胚胎為低發育潛能的胚胎；
[0013] 年齡大於35歲的女性，用於受精的卵母細胞的顆粒細胞相對端粒長度T/S值為 3. 72?5. 92時，判斷得到的胚胎為高發育潛能的胚胎，用於受精的卵母細胞的顆粒細胞相 對端粒長度T/S值為1. 44?3. 20時，判斷得到的胚胎為低發育潛能的胚胎。
[0014] 本實施例中，通過以下步驟測量顆粒細胞相對端粒長度：
[0015] 1.顆粒細胞基因組DNA提取及定量。
[0016] (1)每個卵母細胞的顆粒細胞沉澱中加入Protease K 20uL、Buffer AL 200uL，混 勻後56 °C水浴10分鐘。
[0017] (2)加入無水乙醇200ul/管，混勾後轉移入Spin Colunm，室溫下以13200rpm離 心2. 5分鐘。
[0018] (3)棄濾液，將Spin Column移入清潔收集管中，加AW1液600ul，室溫下以 13200rpm離心2. 5分鐘。
[0019] (4)棄濾液，將Spin Column移入另一清潔收集管中加AW2液600ul，室溫下以 13200rpm離心2. 5分鐘。
[0020] (5)棄濾液，將Spin Column轉移入已標患者姓名的新1. 5ml離心管中，加Buffer AE300ul，室溫下以13200rpm離心2. 5分鐘。
[0021] (6)核對標本姓名及編碼，收集離心管內液體（即提出的DNA)，用超微量分光光度 計測定0D260和0D280, -20°C保存備用。
[0022] (7)選擇一例基礎內分泌正常、有正常排卵功能且無其他疾病的不孕婦女DNA樣 本做為 Calibrator。
[0023] 2.引物設計與合成。
[0024] 表1引物序列

【權利要求】
1. 一種利用顆粒細胞端粒長度來判斷胚胎發育潛能的方法，所述的顆粒細胞端粒長度 是指顆粒細胞相對端粒長度，用T / S值表示，其特徵在於： 年齡小於或等於35歲的女性，用於受精的卵母細胞的顆粒細胞相對端粒長度T/S值為 4. 09?5. 89時，判斷得到的胚胎為高發育潛能的胚胎，用於受精的卵母細胞的顆粒細胞 相對端粒長度T/S值為1. 95?3. 95時，判斷得到的胚胎為低發育潛能的胚胎； 年齡大於35歲的女性，用於受精的卵母細胞的顆粒細胞相對端粒長度T/S值為 3. 72?5. 92時，判斷得到的胚胎為高發育潛能的胚胎，用於受精的卵母細胞的顆粒細胞相 對端粒長度T/S值為1. 44?3. 20時，判斷得到的胚胎為低發育潛能的胚胎。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450904SQ201410718285
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月2日 優先權日:2014年12月2日
【發明者】李楠, 王麟, 韋繼紅, 韋立紅, 唐永梅, 牟聯俊, 秦祖興 申請人:柳州市婦幼保健院