重組BsaI限制性內切酶的製備方法與流程
2023-10-09 14:43:29 4
本發明涉及一種重組bsai限制性內切酶的製備方法。
背景技術：
限制性核酸內切酶是可以識別特定的核苷酸序列，並在每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵進行切割的一類酶，簡稱限制酶。根據限制酶的結構，輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第一型(typei)、第二型(typeii)及第三型(typeiii)。
第一型限制酶同時具有修飾及識別切割的作用；另有識別dna上特定鹼基序列的能力，通常其切割位距離識別位可達數千個鹼基之遠。例如：ecob、ecok。
第二型限制酶只具有識別切割的作用，修飾作用由其他酶進行。所識別的位置多為短的迴文序列；所剪切的鹼基序列通常即為所識別的序列。是遺傳工程上，實用性較高的限制酶種類。例如：banhi、hindiii。
第三型限制酶與第一型限制酶類似，同時具有修飾及識別切割的作用。可識別短的不對稱序列，切割位與識別序列約距24～26個鹼基對。例如：hinfiii。
ii型限制與修飾系統所佔的比例最大，達93％。
其中ii型酶相對來說最簡單，它們識別回文對稱序列，在迴文序列內部或附近切割dna，產生帶3′-羥基和5′-磷酸基團的dna產物，需mg2+的存在才能發揮活性，相應的修飾酶只需sam。識別序列主要為4～6bp，或更長且呈二重對稱的特殊序列，但有少數酶識別更長的序列或簡併序列，切割位置因酶而異，有些是隔開的。
限制性內切酶typeii又分了四種子型：iip，iis，iic和iit。大多數情況下實驗室使用的iip只有一個蛋白結構域，具有同時識別序列和在序列內進行切割的能力，而iis擁有兩個結構域，其中一個負責識別序列，另一個負責切割，由於兩個結構域具有一定的距離，導致蛋白的切割位點在識別序列之外。
本發明的bsai限制性內切酶即屬於iis型限制酶，其識別位點為：
5』-ggtctc(n)1^-3』
5』-ccagag(n)5^-3』
bsai作為一個typeiis限制性內切酶，在生物領域屬於新型酶類，常用於goldengate技術。目前商品化bsai蛋白的價格偏高，較少生物公司有此類產品。通過對本蛋白的研發可以增加在產品方面的競爭力，同時可以用於goldengate技術的研究。
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題是提供一種重組bsai蛋白在大腸桿菌中的誘導表達以及純化方法。該方法通過將目的基因重組到表達載體並轉化至大腸桿菌表達菌株中進而進行誘導表達。
為了解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是，重組bsai限制性內切酶的製備方法，包括以下步驟：
(1)表達質粒pcreatsii-bsai的構建；
(2)bsai蛋白的誘導表達與鑑定；
(3)bsai蛋白的純化與鑑定。
作為優選，步驟(1)所述表達質粒pcreatsii-bsai的構建，具體包括以下步驟：
(4)bsai的基因合成：根據密碼子優化後的基因序列，直接進行基因合成；
(5)gibson重組連接：將pcreatsii通過酶切進行線性化，線性化產物與步驟(4)的基因合成產物進行無縫克隆；
(6)重組產物轉化：將上述重組連接產物20μl轉移到top10感受態細胞中，冰上靜置30min，42℃熱激90s，冰上再靜置2min；加入600ullb液體培養基，37℃搖床200rpm搖45min，塗布於含50ug/ml卡那黴素的lb平板中，37℃培養箱培養過夜；
(7)重組克隆的鑑定：隨機挑取至少4個克隆，接入4ml含卡那黴素lb中；37℃搖床220rpm搖過夜，抽提質粒並測序。
作為優選，步驟(2)具體包括以下步驟：
(8)重組質粒轉化大腸桿菌
將上述鑑定為陽性的重組質粒pcreatsii-bsai轉入感受態bl21(de3)中，塗布於含卡那黴素的lb平板上，37℃倒置培養過夜；
(9)iptg誘導蛋白表達
挑單克隆於含卡那黴素lb中，37℃搖床，220rpm培養過夜，以1∶100接過夜菌於4ml含卡那黴素lb板中，繼續培養2.5h，od600nm達到0.6～0.8時加入iptg至0.5mm，於15℃過夜誘導蛋白表達；
(10)sds-page鑑定
取2ml菌液12000rpm離心1min收集菌體，加入100μl的1×上樣緩衝液，煮沸5min，冷卻後12000rpm離心1min，取10μl樣品進行12％聚丙烯醯胺凝膠電泳，取下凝膠利用快染儀染色脫色10min，觀察誘導前後蛋白條帶的變化，結果顯示目的蛋白有表達。
作為優選，步驟(3)具體包括以下步驟：
(11)bsai蛋白的誘導表達
將過夜培養已轉入pcreatsii-bsai的bl21(de3)菌液以1∶100接於800ml含卡那黴素lb中，37℃搖床，220rpm培養2h，od600nm達到0.6～0.8時，加入iptg至0.5mm，於15℃過夜誘導蛋白表達，8000rpm離心10min，收集菌體，-20℃保存；
(12)細菌蛋白表達形式的分析
-20℃凍存菌體按每克溼菌5ml的比例加入細菌裂解液，超聲破菌，4℃，16000rpm離心15min，沉澱在底部，分別取上清、包涵體做sds-page，結果顯示bsai蛋白一部分存在於上清中；
(13)bsai蛋白的純化
收集菌體加入裂解液重懸，超聲破碎後離心，16000rpm離心15min，將上清液置於乾淨的50ml的離心管中加入2mlni柱，4℃孵育2h，裂解液洗柱100ml；利用含有20mm咪唑的裂解液洗脫30ml，含有500mm咪唑的裂解液洗脫5ml；以bsai儲存液作為流動相過分子篩superdex200，根據紫外吸收值收集合目的蛋白的洗脫液，將目的蛋白液用12％的sds-page進行檢測。
本發明的有益效果是：
本發明應用蛋白純化系統，superdex200分子篩層析對蛋白進行提純，經純化工藝摸索及條件優化，整個純化過程僅需5～6h，極大簡化了純化過程及時間，從而保證了酶活性，有利於酶產量的提高，且純化後bsai經酶活力與商業化酶相當，通過大腸桿菌表達bsai極大的降低了成本，效率也有很大的提升。該純化工藝的新方法，為研發及生產其他ii型限制性內切酶奠定了基礎。
具體實施方式
以下通過具體的實施例對本發明作進一步闡述。
1.菌種
宿主菌大腸桿菌top10、bl21(de3)及表達載體pcreatsii。
2.試劑
限制性內切酶為neb(北京)有限公司產品；pcreatsii為通用生物系統(安徽)有限公司研發；dna聚合酶為通用生物系統(安徽)有限公司自產；膠回收及質粒小抽試劑盒為axygen產品；nintabeads6ff購自常州天地人和生物科技有限公司；t4dna連接酶購自thermo公司。
3.蛋白酶基因合成
bsai蛋白酶與甲基化酶基因由通用生物系統(安徽)有限公司基因部根據基因序列直接合成，5』及3』分別帶有pcreatsii的同源臂。
4.pcreatsii-bsai表達載體的構建
將bsai蛋白酶基因及線性化載體pcreatsii利用利用重組酶進行同源重組，重組產物轉化大腸桿菌top10，抽提質粒由本公司測序部進行測序驗證。
5.pcreatsii-bsai表達及產物純化
將測序正確的陽性重組子轉化到大腸桿菌bl21(de3)中挑取單菌落轉化到30ml含卡那黴素(50mg/ml)的lb液體培養基中，37℃培養過夜，次日按1∶100接種至800ml含卡那黴素的液體培養基中，37℃培養，當od600達到0.5時加入iptg(終濃度0.5mm)於15℃誘導過夜。
收集菌體加入裂解液重懸，超聲破碎後離心，16000rpm離心15min，將上清液置於乾淨的50ml的離心管中加入2mlni柱，4℃孵育2h，裂解液洗柱100ml。利用含有20mm咪唑的裂解液洗脫30ml，含有500mm咪唑的裂解液洗脫5ml。以bsai儲存液作為流動相過分子篩superdex200，根據紫外吸收值收集含目的蛋白的洗脫液，將目的蛋白液用12％的sds-page進行檢測。
6.將目的蛋白純化產物進行酶切驗證。
以上所述的本發明實施方式，並不構成對本發明保護範圍的限定。任何在本發明的精神和原則之內所作的修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的權利要求保護範圍之內。