一種豬精液冷凍保存方法
2023-08-05 19:22:41 1
專利名稱：一種豬精液冷凍保存方法
技術領域：
本發明涉及一種豬精液冷凍保存方法，屬於家畜繁殖技術領域。
背景技術：
在我國，豬是最主要的飼養家畜，豬肉產量約佔全國肉類總量的70%。近幾年隨著人民生活水平的提高，豬的育種方向從主要著眼於生長速度與瘦肉率的提高，轉變為改善豬肉的品質，提高肉的風味。傳統的選育方式世代間隔時間長，已不能適應市場需求，而採用豬冷凍精液技術，可充分利用優良種畜，縮短良種選育世代間隔時間，快速建立新的適合市場要求的種豬和商品豬雜交繁育體系。同時，近千年的飼養史，已在我國形成了數百種各具特色的地方品種，這是一份非常寶貴的財產，今後畜牧業的競爭，相當部份是遺傳資源，優良基因利用的競爭，但近年國外豬種的引進雜交，已使我國有相當數量的地方品種滅絕或面臨滅絕，而採用豬精液冷凍保存技術可有效保存我國地方豬種質資源，具有不可估量的社會意義和效益。雖然草食家畜精液超低溫(_196°C )冷凍保存技術已在現代化畜牧生產、種質資源保存中發揮著重要作用，並產生了顯見的經濟和社會效益。但豬冷凍精液一直難以在生產中大範圍推廣應用，其原因有兩個，一是豬精子細胞質膜中膽固醇與磷脂比率顯著低於草食動物，在冷凍過程中精子膜的離子通透性增強，脂類物質流失，導致凍精活率低、受胎率低。二是豬精子在冷凍過程中常受到自由基和氧化應激的侵害，從而影響豬精子冷凍後活率和受精能力。自由基是細胞內正常代謝產生的，生物體內含有天然的抗氧化劑(自由基清除劑)以中和自由基的毒副作用。正是在這些抗氧化劑的調節下，體內自由基的產生和消除處於一種動態平衡中。但是，在常規的豬精液冷凍稀釋液中上述抗氧化劑的水平低於體內水平，並且在精子冷凍前的稀釋平衡過程中，不可避免地暴露於空氣，而空氣中的氧氣濃度高於生殖道內氧氣濃度(20% VS. 7% )，加上體外操作時光線和稀釋液中金屬離子的影響，使得冷凍時精子內自由基水平增加，打破了氧化-抗氧化的平衡狀態，導致精子氧化應激損傷。因此，篩選新的冷凍保護劑以提高冷凍後精子活率已成為豬精液冷凍研究領域的熱點。穀胱甘肽是蛋氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的含有巰基的非蛋白三肽，具有較強的抗氧化作用，能夠消除超氧陰離子和過氧化氫等自由基。它是組織細胞中主要的非蛋白巰基化合物，是穀胱甘肽過氧化物酶和穀胱甘肽S-轉移酶兩種酶類的底物，為這兩種酶分解過氧化氫所必需，能穩定含巰基的酶。對於穀胱甘肽的研究已有文獻報導。CN100455592C、CN100503837C、CN1164737C、CN1325511C、CN1313597C、CN100360679C 等多種專利申請公開了穀胱甘肽的製備方法。CN1185008C、CN100435793C等多種專利公開了谷 胱甘肽用作藥物的用途。但到目前為止，尚未見有關穀胱甘肽用於家畜繁殖技術領域，特別是用於豬精液冷凍保存的報導。
發明內容
本發明的目的是提供一種可降低冷凍對精子的損傷、提高冷精活率的豬精液冷凍保存方法。
本發明採用的技術方案是穀胱甘肽在製備豬精液冷凍保存液中的應用。具體的，所述的豬精液冷凍保存液以適用於豬精液冷凍保存的稀釋液為基質，所述豬精液冷凍保存液中還含有2 6mg/mL的穀胱甘肽，5 llmg/mL的乳糖和10 30% (v/v)卵黃、5 10% (v/v)的甘油和O. 5 2mg/mL的十二醇硫酸鈉。一種含穀胱甘肽的豬精液冷凍保存液，所述的豬精液冷凍保存液以常規適用於豬精液冷凍保存的稀釋液為基質，所述豬精液冷凍保存液中還含有2 6mg/mL的穀胱甘肽，5 llmg/mL的乳糖和10 30% (v/v)卵黃、5 10% (v/v)的甘油和O. 5 2mg/mL的十二醇硫酸鈉。所述穀胱甘肽已有多種製取方法，屬於已知工藝和成熟技術，並已有商品出售，較為成熟的生產廠家有美國Sigma-Aldrich公司、陝西融升生物科技有限公司、重慶藥友製藥有限責任公司、湖州朗深系生物技術有限公司等。本發明中所用穀胱甘肽由美國Sigma-Aldrich公司提供，純度為98%。具體的，所述豬精液冷凍保存液每IOOOmL組成如下
穀胱甘肽2 ~ 6 g
乳糖50 ~ IlOg
卵黃100 ~ 300 mL
甘油50 ~ 100 mL
十二自手稅酸納5 ~ 20 g適用於豬精液冷凍保存的稀釋液補足至1000mL。所述適用於豬精液冷凍保存的稀釋液為常規用於豬精液冷凍保存的稀釋液，如BTS稀釋液、韓國產的Seminark 稀釋液等。優選的，所述適用於豬精液冷凍保存的稀釋液為BTS稀釋液(Beltsville thawing solution),每IOOOmL按如下配方配製葡萄糖37g、檸檬酸鈉6g、氯化鉀0. 75g、碳酸氫鈉I. 25g、乙二胺四醋酸I. 25g、青黴素100000單位，鏈黴素IOOmg,去離子水補足至1000mL。優選的，所述豬精液冷凍保存液每IOOOmL組成如下穀胱甘肽4g
乳糖80 g
卵黃200 mL
甘油80 mL
十二醇疏酸納5 gBTS稀釋液補足至1000mL。本發明還涉及一種應用所述含穀胱甘肽的豬精液冷凍保存液進行豬精液冷凍保存的方法，所述方法包括(I)將新鮮採取的豬精液用等溫的BTS稀釋液稀釋一倍；(2)在15°C條件下靜置(平衡)2小時，1000轉離心10分鐘；(3)離心後去除上清液，沉澱用含穀胱甘肽的豬精液冷凍稀釋液稀釋(不含甘油和十二醇硫酸鈉)，使精子密度為2 X IO9個/mL，稀釋後的精液在5°C條件下靜置(平衡)2小時後，再用5°C下保存的含穀胱甘肽的豬精液冷凍保存液稀釋一倍，使精子的最終密度為I X IO9個/mL，得到稀釋後的精液； 所述豬精液冷凍稀釋液每IOOOmL組成如下穀胱甘肽2 6g乳糖50 IlOg卵黃100 300mLBTS稀釋液補足至IOOOmL ；所述豬精液冷凍保存液每IOOOmL組成如下
穀胱甘肽2 ~ 6 g
乳糖50 ~ IlOg
卵黃100~300 mL
甘油50 ~ 100 mL
十二自手稅酸納5 ~ 20 gBTS稀釋液補足至IOOOmL ；(4)將冷凍稀釋後的精液裝入常規冷凍管，置於液氮面上3釐米，燻蒸5分鐘後，直接投入液氮中，冷凍保存備用。本發明豬精液冷凍保存液，是根據豬精液冷凍保存過程中抗氧化、抗自由基的需要，結合穀胱甘肽的生物學功能研製而成。穀胱甘肽具有較強的抗氧化作用，能夠消除超 氧陰離子和過氧化氫等自由基。它是組織細胞中主要的非蛋白巰基化合物，是穀胱甘肽過氧化物酶和穀胱甘肽S-轉移酶兩種酶類的底物，為這兩種酶分解過氧化氫所必需，能穩定含巰基的酶。因此穀胱甘肽應用於豬精液冷凍保存，可以有效地去除冷凍過程中產生的多餘自由基，解決了目前豬精液冷凍保存存活率低的問題。其經濟成本較低，便於在生產中推廣應用。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此實施例I :製備含穀胱甘肽的豬精液冷凍保存液和冷凍稀釋液含穀胱甘肽的豬精液冷凍保存液製備
準確稱取穀胱甘肽400mg，先用50mL的BTS稀釋液(每IOOOmL按如下配方配製葡萄糖37g、檸檬酸鈉6g、氯化鉀O. 75g、碳酸氫鈉I. 25g、乙二胺四醋酸I. 25g、青黴素100000單位，鏈黴素lOOmg，去離子水補足至IOOOmL)溶解，然後向稀釋液中加入8g乳糖、20mL的卵黃(從雞蛋中抽取得到)、8mL甘油和O. 5g的十二醇硫酸鈉，再加入BTS稀釋液至IOOmL,再次攪拌混勻。用O. 22 μ M的微濾膜抽濾消毒後，在5°C下貯存，備用。含穀胱甘肽的豬精液冷凍稀釋液製備準確稱取穀胱甘肽400mg，先用50mL的BTS稀釋液溶解，然後向稀釋液中加入8g乳糖和20mL的卵黃，再加入BTS稀釋液至IOOmL,再次攪拌混勻。用O. 22 μ M的微濾膜抽濾消毒後，在5°C下貯存，備用。實施例2 :含穀胱甘肽的豬精液冷凍保存液用於大約克豬精液冷凍保存選擇繁殖力高、體格健壯的大約克種公豬，採用手握法採精。收集精子豐富部分，經4層滅菌紗布過濾去除膠體後，立即測精液量，並檢查精子活率，收集精子活率在75%以上的精液約50mL，用等溫的BTS稀釋液稀釋一倍。在15°C條件下靜置平衡2小時，然後1000轉離心10分鐘。精液離心後去除精清，精子沉澱用含穀胱甘肽的豬精液冷凍稀釋液(實施例I)稀釋，該稀釋液是不含甘油和十二醇硫酸鈉的本發明冷凍保存液，因為甘油低溫條件下對精子有毒副作用，加入甘油後精子要馬上冷凍不能低溫靜置。使精子密度為2X IO9個/mL。稀釋後的精液在5°C條件下靜置平衡2小時。再用豬精液冷凍保存液(實施例I)稀釋一倍，使精子的最終密度為I X IO9個/mL。對照組精液用不含穀胱甘肽的冷凍保存液(BTS稀釋液)稀釋，然後將試驗組和對照組精液裝入O. 25mL常規冷凍管中，置於液氮面上3釐米，燻蒸5分鐘後，直接投入液氮中長期保存。實施例3 :大約克豬凍精解凍為了檢測本發明專利的實施效果，大約克豬精液依次按照實施例I、實施例2方法處理後，分別將裝有凍精的試驗組和對照組冷凍管置於37°C水浴鍋中10秒解凍，顯微鏡下檢測精力活率，其中對照組凍精解凍後活率為30. 2%，試驗組冷凍管中凍精解凍後精子活率為36. 7%，比對照組提高6. 5%，統計分析表明兩者差異顯著。結果證實，含穀胱甘肽的豬精液冷凍保存液冷凍保存大約克豬精液可有效提高冷精解凍後的存活率。
權利要求
1.一種豬精液冷凍保存方法，所述方法包括 (1)將新鮮採取的豬精液用等溫的BTS稀釋液稀釋一倍； (2)在15°C條件下靜置2小時，1000轉離心10分鐘； (3)離心後去除上清液，沉澱用含穀胱甘肽的豬精液冷凍稀釋液稀釋，使精子密度為2X IO9個/mL，稀釋後的精液在5°C條件下靜置2小時後，再用5°C下保存的所述的豬精液冷凍保存液稀釋一倍，使精子的最終密度為I X IO9個/mL，得到稀釋後的精液；所述含穀胱甘肽的豬精液冷凍稀釋液每IOOOmL組成如下 穀胱甘肽 2 6g 乳糖50 IlOg 卵黃100 300mL BTS稀釋液補足至IOOOmL ； 所述豬精液冷凍保存液每IOOOmL組成如下穀胱甘肽2 ~ 6 g乳糖50 ~ IlOg卵黃100~300 mL甘油50 ~ 100 mL十二自手稅酸納5 ~ 20 g BTS稀釋液補足至IOOOmL ； (4)將冷凍稀釋後的精液裝入冷凍管，置於液氮面上3釐米，燻蒸5分鐘後，直接投入液氮中,冷凍保存備用。
2.如權利要求I所述的方法，其特徵在於所述豬精液冷凍保存液每IOOOmL組成如下穀胱甘肽4g乳糖80 g卵黃200 mL甘油80 mL十二醇疏酸納5 g BTS稀釋液補足至lOOOmL。
全文摘要
本發明提供了一種以含穀胱甘肽的冷凍保存液進行豬精液冷凍保存的方法。所述的冷凍保存液以常規適用於豬精液冷凍保存的稀釋液為基質，還添加有2～6mg/mL的穀胱甘肽，5～11mg/mL的乳糖和10～30％(v/v)卵黃、5～10％(v/v)的甘油和0.5～2mg/mL的十二醇硫酸鈉。本發明將穀胱甘肽應用於豬精液冷凍保存，可以有效地去除冷凍過程中產生的多餘自由基，解決了目前豬精液冷凍保存存活率低的問題。其經濟成本較低，便於在生產中推廣應用。
文檔編號A01N1/02GK102630665SQ20121010034
公開日2012年8月15日 申請日期2009年8月10日 優先權日2009年8月10日
發明者俞頌東, 王爭光, 董文豔, 陳阿琴 申請人:浙江大學