一種脊髓、周圍神經修復材料的製備工藝的製作方法

2023-05-12 21:01:36

專利名稱：一種脊髓、周圍神經修復材料的製備工藝的製作方法
一、所屬領域本發明涉及醫學領域中可用於人體創傷後的治療或動物實驗研究的一種材料的製備，特別涉及一種用膠原蛋白和氨基聚糖製成的用於橋接周圍神經或脊髓節段性損傷的具有同方向微管型結構特性的脊髓、周圍神經修復材料的製備工藝。
為了實現上述目的，本發明所採用的技術方案是該脊髓、周圍神經修復材料可用膠原(I、III、IV型)與氨基聚糖(硫酸軟骨素-6或硫酸軟骨素-4)混合製成，在一定的低溫條件下，調整注有膠原-氨基聚糖混合物管降入冷淋液中速度和/或冷淋液溫度，以達到製備在內部結構上具有微管徑大小不同和微管隙呈軸向均勻且平行的規律性排列的具有同方向微管型結構特性的修復材料，其製作方法按以下步驟進行1)在製作中稱取一定量的膠原蛋白按27.5mg/ml放入0.05M(醋酸、鹽酸等，以下與此相同)酸性溶液中，在恆溫4℃環境中，以2000r/min，攪拌90min，製成懸濁液；2)再稱取氨基聚糖按1.33mg/ml加入0.05M酸性溶液中，同樣在恆溫4℃、2000r/min，攪拌90min，製成懸濁液；3)膠原與氨基聚糖混合比按所制材料應用需要，可以在(60-120)∶(1-2)之間調節，按比例混合兩種懸濁液，在4℃、2000r/min、繼續攪拌90min，製成膠原纖維和氨基聚糖懸濁液，將此懸濁液放入長頸燒瓶中，抽真空靜置30min。再將其注入矽膠管中(所制材料直徑可以在3mm-16mm之間調節)，兩端封堵，順軸向放入冷淋劑中，並控制放入速度；a)調節浸入速度，速度分別為1.0×10-4m/s、1.0×10-5m/s……依次遞減至10×10-8m/s；從而得到相應溫度的各種速度下的膠原-氨基聚糖懸濁液冰晶圓柱體；b)調節冷淋液溫度在-10℃～-180℃之間任意變化，從而得到相應速度下的各種溫度下的膠原懸濁液冰晶圓柱體；c)注有懸濁液矽膠管每次保留於冷淋劑中30min～60min，將膠原-氨基聚糖懸濁液徹底冷凍結晶；d)將懸濁液-矽膠管冰凍體按應用要求切成短節段，取中央完整的放在鋁盤中，凍幹(-30℃、100mtorr)24h，真空狀態下升溫至0℃保持24h；e)再繼續升溫至22℃保持45min-90min，解除真空，取出乾燥的膠原基質節段，最後將膠原基質節段包入鋁箔小包中(開放)，放入烤箱，壓力為30mmHg、溫度為105℃、時間24h，然後取出將小包密封保存至乾燥箱；f)通過改變冷凍速度和/或冷淋液溫度來控制材料內微管的直徑和走行方向。
本發明的其它特點是，所述膠原-氨基聚糖混合物包括I、III、IV型膠原和硫酸軟骨素-6或硫酸軟骨素-4。
實施例1參見

圖1，按照本發明的技術方案，以I型膠原蛋白和硫酸軟骨素-6為例，其製作方法按以下步驟進行1)在製作時將I型膠原蛋白按27.5mg/ml溶於0.05M(醋酸、鹽酸等，以下與此相同)酸性溶液中，在恆溫4℃～10℃環境下，以2000r/min攪拌90min，製成懸濁液；2)將硫酸軟骨素-6按1.33mg/ml加入0.05M酸性溶液中，同樣在恆溫4℃～10℃下，以2000r/min攪拌90min，製成懸濁液；3)按5∶1比例混合兩種懸濁液，在4℃～10℃，以2000r/min、繼續攪拌90min，製成膠原蛋白和硫酸軟骨素-6混合性懸濁液，將此懸濁液放置於長頸燒瓶中，抽真空靜置30min，消除泡沫；4)將膠原蛋白和硫酸軟骨素-6混合性懸濁液其注入內徑為3mm～16mm的管中，兩端封堵後垂直、縱向緩慢地放入冷淋劑(-10℃～-180℃)中，控制放入速度分別為1.0×10-4m/s、1.0×10-5m/s、1.0×10-6m/s、1.0×10-7m/s、1.0×10-8m/s；5)將膠原蛋白和硫酸軟骨素-6混合性懸濁液管保留於冷淋劑中30min～60min，使其混合性懸濁液完全徹底冷凍結晶；可得到各種條件(溫度、浸入速度)下的膠原懸濁液冰晶圓柱體；6)將膠原蛋白和硫酸軟骨素-6混合性懸濁液冰晶圓柱體凍幹(-30℃、100mtorr)24h，真空狀態下升溫至0℃保持24h；7)將膠原蛋白和硫酸軟骨素-6凍乾物放入烤箱，壓力為30mmHg、溫度為105℃、時間24h；8)將膠原蛋白和硫酸軟骨素-6凍乾物包裝、三層密封，同位素照射滅菌，保存於乾燥箱。
為了達到速度快慢變化大、勻速平穩性要求高的實驗要求，用可調速度控制器，它是由可調控速度的馬達配以直徑在1.5cm～4cm之間的五個由小到大的齒輪等部件構成。冷淋液溫度調節則另外研製了冷淋裝置，調節冷淋液溫度在-10℃～-180℃之間任意變化。從而得到各種條件下的膠原懸濁液冰晶圓柱體。注有懸濁液矽膠管每次保留於冷淋劑中30min～60min，將膠原凍透。先將鋁盤、刀片放入-30℃恆溫箱中，冷凍備用。將10cm長懸濁液-矽膠管冰凍體切成長2.0cm短節段，取中央完整的放在鋁盤中，凍幹(-30℃、100mtorr)24h，真空狀態下升溫至0℃保持24h。再繼續升溫至22℃保持45 min-90min，解除真空，取出乾燥的膠原基質節段。最後將膠原基質節段包入鋁箔小包中(開放)，放入烤箱，壓力為30mmhg、溫度為105℃、時間24h，然後取出將小包密封保存至乾燥箱。
將各種條件下制出的材料切成橫截面和縱截面，在物鏡下觀察其內部孔的規律性，微管徑大小和微管的走向，通過電鏡觀察膠原基質內孔和微管的三維結構並將所得照片，採用Leica WinQ.3.2v圖象分析軟體先測量出孔和微管的直徑(見表1)。
表1 在-180℃，速度與孔徑、孔向間的關係
本發明在製備脊髓、周圍神經修復材料著重解決了以下的技術問題1.製備過程中研製了①調速度調控儀，使速度控制在10×10-5m/s～1.5×10-7m/s之間；②冷淋溫控儀，使冷淋溫度在-10℃～-180℃之間任意調控。
2.探明了溫度、速度與神經組織修復材料內部結構間關係(1)如在-180℃、速度為10×10-5m/s，脊髓、周圍神經修復基本材料的孔呈無規律性排列，孔徑為74.70μm～48.60μm；(2)如在-180℃、速度為1.25×10-6m/s，孔呈軸縱向微管排列，管徑為25.39μm～19.09μm；；(3)如在-180℃、速度在2×10-5m/s時，孔呈軸縱向微管排列，微管直徑最大，為146.97μm～178.47μm；(4)各種溫度、速度電鏡下材料外表面為全封閉結構；(5)各條件下的材料內軸向微管均平行且基本均勻。
本發明所制出的脊髓、周圍神經修復材料參見圖2～4，具有以下特點①材料的外表面為全封閉結構，可有效阻止體內纖維結締組織的長入。②材料的微管徑大小可控制在30μm～200μm，有利於神經再生纖維的生長；③微管的排列走行方向為軸向且相互間平行、均勻，有利於神經再生纖維的定向延伸。本發明製備的脊髓、周圍神經修復材料，既可直接植入修復脊髓、周圍神經缺損；也可作為各種細胞移植的載體，攜帶不同的神經生長因子及嗅鞘細胞、雪旺細胞和神經幹細胞等，用於修復脊髓、外周神經節段性損傷、缺損。
以下實例2～6.膠原(I、III、IV型)與氨基聚糖(硫酸軟骨素-6或硫酸軟骨素-4)混合比相同。
實施例2採用III型膠原蛋白和硫酸軟骨素-6作為原始材料製備。其實施過程同實施例1。
實施例3採用IV型膠原蛋白和硫酸軟骨素-6作為原始材料製備。其實施過程同實施例1。
實施例4採用I型膠原蛋白和硫酸軟骨素-4作為原始材料製備。其實施過程同實施例1。
實施例5採用III型膠原蛋白和硫酸軟骨素-4作為原始材料製備。其實施過程同實施例1。
實施例6採用IV型膠原蛋白和硫酸軟骨素-4作為原始材料製備。其實施過程同實施例1。
權利要求
1.一種脊髓、周圍神經修復材料的製備工藝，該脊髓、周圍神經修復材料可膠原(I、III、IV型)與氨基聚糖(硫酸軟骨素-6或硫酸軟骨素-4)混合製成，在一定的低溫條件下，改變注有膠原-氨基聚糖混合物矽膠管降入冷淋液中速度和/或冷淋液溫度可以達到製備在內部結構上具有微管徑大小不同和微管呈軸向均勻且平行的規律性排列的具有同方向微管型結構特性的新型脊髓、周圍神經組織工程修復材料，其製作方法按以下步驟進行1)在製作中稱取一定量的膠原蛋白按27.5mg/ml放入0.05M(醋酸、鹽酸等，以下與此相同)酸性溶液中，在恆溫4℃環境中，以2000r/min，攪拌90min，製成懸濁液；2)再稱取氨基聚糖按1.33mg/ml加入0.05M酸性溶液中，同樣在恆溫4℃、2000r/min，攪拌90min，製成懸濁液；3)膠原與氨基聚糖混合比按所制材料應用需要，可以在(60-120)∶(1-2)之間調節，按比例混合兩種懸濁液，在4℃、2000r/min、繼續攪拌90min，製成膠原纖維和氨基聚糖懸濁液，將此懸濁液放入長頸燒瓶中，抽真空靜置30min。再將其注入矽膠管中(所制材料直徑可以在3mm-16mm之間調節)，兩端封堵，順軸向放入冷淋劑中，並控制放入速度；a)調節浸入速度，速度分別為1.0×10-4m/s、1.0×10-5m/s……依次遞減至10×10-8m/s；從而得到相應溫度的各種速度下的膠原-氨基聚糖懸濁液冰晶圓柱體；b)調節冷淋液溫度在-10℃～-180℃之間任意變化，從而得到相應速度下的各種溫度下的膠原懸濁液冰晶圓柱體；c)注有懸濁液矽膠管每次保留於冷淋劑中30min～60min，將膠原-氨基聚糖懸濁液徹底冷凍結晶；d)將懸濁液-矽膠管冰凍體按應用要求切成短節段，取中央完整的放在鋁盤中，凍幹(-30℃、100mtorr)24h，真空狀態下升溫至0℃保持24h；e)再繼續升溫至22℃保持45min-90min，解除真空，取出乾燥的膠原基質節段，最後將膠原基質節段包入鋁箔小包中(開放)，放入烤箱，壓力為30mmHg、溫度為105℃、時間24h，然後取出將小包密封保存至乾燥箱；f)通過改變冷凍速度和/或冷淋液溫度來控制材料內微管的直徑和走行方向。
2.根據權利要求1所述的脊髓、周圍神經修復材料的製備工藝，其特徵在於，所述膠原—氨基聚糖混合物包括I、III、IV型膠原和硫酸軟骨素-6或硫酸軟骨素-4。
全文摘要
本發明所制出的新型脊髓、周圍神經修復材料具有同方向微管型結構特性。按需製成不同的外型,如圓柱型,長方型等。具有以下特點:①材料的外表面為全封閉結構,可有效阻止體內纖維結締組織的長入。②材料的微管徑大小可控制在30μm～200μm,有利於神經再生纖維的生長;③微管的排列走行方向為軸向且相互間平行、均勻,有利於神經再生纖維的定向延伸。本發明製備的脊髓、周圍神經修復材料,既可直接植入修復脊髓、周圍神經缺損;也可作為各種細胞移植的載體,攜帶不同的神經生長因子及嗅鞘細胞、雪旺細胞和神經幹細胞等,用於修復脊髓、外周神經節段性損傷、缺損。
文檔編號A61L29/04GK1380115SQ0211448
公開日2002年11月20日 申請日期2002年3月25日 優先權日2002年3月25日
發明者羅卓荊, 章慶峻 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學