化合物對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用的製作方法

2023-05-20 12:43:51

專利名稱：：化合物對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及醫藥領域，具體涉及一個化合物的治療用途，及其對心血管疾病的治療用途。
背景技術：
：鈉氫交換器(Na+-H+exchanger,NHE)是一種在多種哺乳動物細胞中均有表達的蛋白質，它在調節細胞內pH值，維持Na+和C^+穩定方面起重要調節作用。目前，已經有10種NHE亞型(NHE1NHE10)被確認，其中NHE1在組織中普遍分布，尤其在心肌細胞中佔絕大多數，因此NHE1在調節心肌功能方面有著重要作用。自從1988年第一個NHE抑制劑阿米洛利被證實有保護心肌缺血再灌注損傷的作用以來，這類化合物迅速引起人們的關注，Cariporide、Eniporide、Zoniporide等具有臨床應用前景的特異性NHE1抑制劑也陸續被發現。發明人在前期研究中，合成了系列化合物，這些化合物均具有NHE1抑制效果，公開於C畫1143857。
發明內容發明人在對所合成的化合物的藥理研究中發現，結構式I化合物治療心血管疾病，特別是在保護心肌缺血再灌注損傷的作用明顯強於其它化合物，甚至強過目前已在臨床試驗的Cariporide。結構式I化合物如下formulaseeoriginaldocumentpage3結構式I化合物化學名為3-硝基-4-((4-(2,3,4-三甲氧基苄基)哌嗪-l-基)甲基)苯甲醯胍以下簡稱TG6。下面是TG6的藥理試驗及結果。一、大鼠急性心肌缺血再灌注模型模型製備formulaseeoriginaldocumentpage3大鼠用3%戊巴比妥鈉(按大鼠體重40mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定於手術臺上，連接心電圖，肢體導聯監測心電，記錄正常心電圖。將大鼠頸部、左側胸部皮膚去毛，酒精消毒。在頸部正中切開皮膚，鈍性分離肌肉暴露氣管；用眼科剪在氣管上剪一小口並行氣管插管(插管為直徑2mm的塑料導管)，再接動物人工呼吸機進行人工呼吸。將大鼠沿胸骨左緣心臟搏動處縱行切開皮膚約2cm，逐層分離皮下組織、肌肉，做荷包縫合備用。在心臟搏動最明顯肋間打開胸腔，撕開心包後用力擠壓胸腔，使心臟彈出胸腔，左手拇指、食指和中指輕捏住心臟，在左心耳下方以心臟表面左冠狀靜脈主幹為標誌，用5/0連線彎縫合針於左心耳根部下方2mm處穿過心肌表層(進針深度為1.01.5mm，寬度為23mm)，迅速打活結結紮冠狀動脈形成缺血(假手術組只穿針不結紮)。將心臟放入胸腔，活結兩端留在胸腔外，輕擠胸腔排出氣體，用力拉荷包縫合線兩端關閉胸腔。觀察心電圖可見J點抬高表明缺血成功；45min後鬆開荷包縫合，解開活結形成再灌注，再輕擠胸腔排出氣體，用力拉荷包縫合線兩端關閉胸腔。再灌注過程持續90min。實驗結束後，頸總動脈取血，打開胸腔取心臟。用4。C生理鹽水衝洗心臟並剪去心耳、大血管以及附著的脂肪組織等，再剪去心房和右心室，稱左心室重量，最後將心臟放入冰箱一2(TC保存；取出的血用離心機3000r/min離心10min後取血清置冰箱一2(TC保存。分組及給藥56隻清潔級雄性SD大鼠隨機分為以下7組，每組8隻I組缺血再灌注模型組，按照模型製備方法進行冠狀動脈缺血45min，再灌注90min，組中大鼠於再灌注前5min尾靜脈給予0.9%生理鹽水lmL/kg;II組假手術組，冠狀動脈下只穿線不結紮，其餘操作同模型組，組中大鼠於再灌注前5min尾靜脈給予0.9y。生理鹽水lmL/kg;III組Cariporide(lmg/kg)組，按照模型製備方法進行冠狀動脈缺血45min，再灌注卯min，組中大鼠於再灌注前5min尾靜脈給予Cariporide(lmg/mL)lmL/kg;IV組曲美他嗪(5mg/kg)組，按照模型製備方法進行冠狀動脈缺血45min，再灌注90min。組中大鼠於再灌注前5min尾靜脈給予曲美他嗪(5mg/mL)lmL/kg;V組VII組TG6高劑量(lmg/kg)組、TG6中劑量(0.5mg/kg)組、TG6低劑量(0.25mg/kg)組按照模型製備方法進行冠狀動脈缺血45min，再灌注90min。組中大鼠分別於再灌注前5min尾靜脈給予TG6(lmg/mL)lmL/kg、TG6(0.5mg/mL)lmL/kg、TG6(0.25mg/mL)lmL/kg。心肌梗死範圍測定心臟在一2(TC保存1小時後取出，放置一段時間後與房室溝平行將左心室切成l.Omm薄片約57片，加入到iy。TTC中，置37'C水浴，震蕩染色67min後取出，用水衝洗去多餘的染料，再放入4X甲醛溶液固定24h。固定後的心肌梗死區不著色，非梗死區被TTC染成紅色。剪下各心肌片未染色的梗死心肌稱重，用其與左心室溼重的比值計算心肌梗死範圍，公式如下心肌梗死範圍％=(未染色心肌重量/左心室溼重)xioo%血清生化指標測定將血清從冰箱中取出在室溫中放置至完全融化，按試劑盒說明方法檢測血清中總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力、丙二醛(MDA)含量、肌酸激酶(CK)活力以及乳酸脫氫酶(LDH)活力。結果如圖l所示，假手術組的心肌梗死範圍為6.61%，而缺血再灌注模型組的心肌梗死範圍為28.81%，與假手術組比較，明顯增加(PO.OOl)。C—ride、曲美他嗪、TG6高、中、低各劑量組的心肌梗死範圍分別為21.66%、19.78%、19.95%、22.17%、25.60%，與模型組比較，都明顯減少(PO.05,PO.OOl)。TG6對急性心肌缺血再灌注損傷大鼠血清中CK、LDH活力的影響如表1所示，假手術組血清中的CK、LDH活力不大，而模型組血清中CK、LDH活力明顯高於假手術組(PO.OOl)。各給藥組血清中的CK活力，與模型組比較，明顯減少(P<0.05，PO.Ol，PO.OOl)。各給藥組除TG6低劑量組外，血清中的LDH活力與模型組比較，明顯減少(PO.05,PO.Ol，PO細)。表1.NHE1抑制劑TG6對缺血45分鐘再灌注90分鐘後的大鼠血清中CK和LDH活力的影響(11=8，X±s)tableseeoriginaldocumentpage5TG6對急性心肌缺血再灌注損傷大鼠血清中T-SOD活力以及MDA含量的影響如表2所示，假手術組血清中T-SOD活力很高，MDA含量很少，而模型組與假手術組比較，血清中T-SOD活力明顯降低(PO.OOl)，MDA含量明顯增加(PO.OOl)。各給藥組除TG6低劑量組外，血清中的T-SOD活力比模型組明顯增加(P<0.05，PO.OOl)。各給藥組血清中的MDA含量比模型組明顯減少(P<0.05，PO.OOl)。表2.NHE1抑制劑TG6對缺血45分鐘再灌注90分鐘後的大鼠血清中T-SOD活力和MDA含量的影響(n=8，x±s)tableseeoriginaldocumentpage6*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs假手術組;△P<0.05，AAP<0.01，AAAP<0.001vs模型組二、離體心臟缺血再灌注模型模型製備實驗前將大鼠脫頸處死，迅速開胸，快速取下心臟放入改良的K-H緩衝液(U8.4mMNaCl,4.7mMKC1,2.5mMCaCl2，1.2mMKH2P04，1.2mMMgS04，25.0mMNaHC03,ll.OmMglucose)冰浴中洗淨殘血，迅速主動脈插管懸掛心臟於改良的Langendorff灌流裝置上，用改良的K-H緩衝液(以95%02和5%<:02飽和)行主動脈逆行灌流(速度57mL/min)，溫度穩定在37°C。灌流平衡20min後除正常對照組外都開始低灌(速度約為0.5mL/min)，低灌30min後恢復正常流速再灌30min。分組及給藥80隻清潔級雄性大鼠隨機分為8組(n=10):正常對照組，用改良K-H液以正常流速灌流80min;模型組，平衡20min後用改良K-H液低灌30min，再復灌30min;溶媒組，低灌液為含0.001%DMSO的改良K-H液，其餘同模型組；曲美他嗪組，低灌液為含504M曲美他嗪的改良K-H液，其餘同模型組；Cariporide組，低灌液為含10^MCariporide的改良K-H液，其餘同模型組；TG6高、中、低劑量組低灌液分別為含50PM、10PM、2^MTG6的改良K-H液，其餘均同模型組。冠脈流量分別在平衡末的最後三分鐘、復灌開始後的第3、4、5分鐘以及復灌末的最後三分鐘連續量取3次冠脈流量，每次lmin，取其平均值分別作為平衡末、復灌初以及復灌末的冠脈流量。計算時以平衡末的冠脈流量為1，復灌初和復灌末的冠脈流量則表示為這兩個時間點的冠脈流量與平衡末冠脈流量的比值。心肌組織能量代謝標誌物的測定-實驗結束後，將心肌組織製備成10%的組織勻漿液，按試劑盒說明書測定其中的忖&+-〖+—ATP酶活力、LD以及ATP含量。TG6對離體大鼠心臟缺血再灌注過程冠脈流量變化的影響如表3所示，模型組復灌初和復灌末的冠脈流量明顯低於對照組(PO.OOl)。溶媒組與模型組比較無明顯差異。各給藥組復灌初和復灌末的冠脈流量都明顯高於模型組(PO.OOl)。TG6高、中劑量組復灌初和復灌末的冠脈流量都分別略高於曲美他嗪與Cariporide組。表3.NHE1抑制劑TG6對低速灌流(0.5m1/min)30分鐘後再正常灌流(57m1/min)30分鐘的離體大鼠心臟冠脈流量的影響(n=10，i±s)S冠脈流量組別(幽)(以平衡末的冠脈流量為1)tableseeoriginaldocumentpage7*P<0.05，**P<0.01，**叩<0.001vs正常對照組；△P<0.05，Mp0.01，AAAP<0.001vs模型組TG6對離體大鼠心臟缺血再灌注後心肌組織中能量代謝變化的影響如表4所示，模型組心肌組織中的Na+—K+ATP酶活力和ATP含量明顯低於對照組(PO.OOl)，而LD含量明顯高於對照組(PO.OOl)。溶媒組與模型組比較無明顯差異。各給藥組心肌組織中的Na+—K+ATP酶活力和ATP含量明顯高於模型組(P<0.05，PO.Ol，P<0.001)，LD含量明顯低於模型組(P<0.05,PO.01，PO.OOl)。TG6高劑量組心肌組織中的Na+—K+ATP酶活力和ATP含量略低於曲美他嗪組，LD含量略高於曲美他嗪組，但都沒有明顯差異。TG6中劑量組心肌組織中Na+—K+ATP酶活力略高於Cariporide組，而兩組ATP禾QLD含量幾乎相同。表4.NHE1抑制劑TG6對低速灌流(0.5ml/min)30分鐘後再正常灌流(57m1/min)30分鐘的離體大鼠心臟中Na+-K+ATP酶活力，LD和ATP含量的影響(n=10，x±s)tableseeoriginaldocumentpage8*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001vs正常對照組;AP<0.05,AAP<0.01，AAAP<0.001vs模型組圖l是NHEl抑制劑TG6對缺血45分鐘再灌注90分鐘後的大鼠心臟心肌梗死範圍的影響(n二8).(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs假手術組；AP<0.05，AAP<0.001vs模型組)權利要求1、結構式I的化合物用於製備治療心血管疾病的藥物的用途2、權利要求l的用途，其中心血管疾病是心肌梗死、心肌缺血、心肌肥大或心力衰竭,formulaseeoriginaldocumentpage2全文摘要本發明涉及醫藥領域，具體涉及一個化合物(I)的治療用途，其特徵是化合物(I)對心血管疾病具有治療作用，特別是化合物I對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用。文檔編號A61P9/04GK101524354SQ20091002574公開日2009年9月9日申請日期2009年3月9日優先權日2009年3月9日發明者靜徐,徐雲根,王秋娟,顏天華,龔國清申請人:中國藥科大學