腫瘤熱休克蛋白－多肽複合物抗原的分離純化方法

2023-05-21 20:06:01

專利名稱：腫瘤熱休克蛋白－多肽複合物抗原的分離純化方法
技術領域：
本發明涉及生物化學的蛋白質分離提純技術，腫瘤抗原的分離純化方法。
目前研究表明很多惡性腫瘤細胞有熱休克蛋白-多肽複合物(Heat ShockProteins-peptide complexes，HSPs)表達。由於HSPs上結合有腫瘤抗原肽，因此，分離得到腫瘤細胞的HSPs就可得到腫瘤抗原，用於製備抗腫瘤的生物製劑，所以研究HSPs的分離提取方法並不斷進行技術改進，探索大批量生產的工藝，對實現提供大量的成品HSPs抗原供臨床使用有重大的實用價值。
現在普遍採用的分離HSPs技術一是用ATP-agarose，但分離後HSPs無生物活性(免疫原性)，沒有臨床使用價值。二是過Con A-sephrose後再過Mono Q柱。這種方法提純量小，只能用於試驗室，並且因柱子價格昂貴、易損，一旦操作不慎造成柱子損壞，浪費很大，又影響進度，柱子是進口的，不能自行組裝，所以該方法的最大缺點是成本高。
本發明的目的是提供一種降低成本、適於製備大量樣品的腫瘤HSP-多肽複合物抗原的分離純化方法。
腫瘤熱休克蛋白-多肽複合物(HSP)抗原的分離純化方法，包括取瘤組織破碎，使細胞核與膜分離，然後離心、第一次層析、透析、濃縮、第二次層析、定性定量、純度測定，其特徵是破碎時將低滲裂解液與超聲粉碎機並用；在層析時用DEAE-52行第二次分離。
本發明分離純化方法的優點是1、在裂解步驟中低滲裂解液及超聲粉碎機並用，這樣既減少了裂解液的用量，是原有用量的1/18，又能使細胞在行超聲粉碎前膨脹或部分破裂，易於粉碎。因此該法操作簡便、適於處理量大的樣品，使規模化生產成為可能。單純使用低滲裂解液，在處理大量組織細胞時裂解液量大，離心及過柱費時，效率低，且不必要，但單純應用超聲粉碎機恐難將細胞器徹底粉碎，而影響HSPs的產率。
2、在第二次層析中改用DEAE-52有如下優點(1)傳統的ATP-agarose方法分離得到的HSPs無抗原性，因HSPs具有ATP酶的活性，HSPs與ATP接觸後HSP與多肽分離，喪失抗原性，使得HSPs無臨床使用
(2)目前國外用的Mono Q柱分離方法，純度高，分離效果好。但Mono Q柱容積小(10×0.5cm)，價格昂貴，8900元/支。該柱對樣品要求高，且易損壞。一旦損壞使提純成本倍增。而且Mono Q柱主要用於處理少量的實驗用品，不適於大批量生產成品。而本發明改用DEAE-52層析柱進行第二次分離，效果與用Mono Q相同。DEAE-52價格低廉，且可自行裝柱，多次使用。其成本較MonoQ柱層析顯著下降，比用現有技術下降2/3-3/4，適合於大批量生產用。
(3)本發明中層析時還可省去ConA-Sepharose層析步驟，而只用DEAE-52進行兩次層析，此法比方案1更進一步地降低成本。
實施例1腫瘤HSP-多肽複合物抗原的分離純化方法，包括取瘤組織或培養的瘤細胞株(若取組織則需將組織研碎後，過200目網)，細胞清洗乾淨、離心後，破碎，其特徵是破碎時用低滲裂解液與超聲粉碎機並用；按固體物體積比1/10加入低滲裂解液，10分鐘(4℃)後再用超聲粉碎機破碎，實驗室用的超聲粉碎機，在10ml試管內加入樣品5-8ml，反覆三次，每次3秒，於冰水中進行。使細胞核與膜分離，然後用超高速離心機離心，105g/分鐘，離心1小時，取上清液，層析先過ConA-Sepharose層析柱行第一次層析，收集洗脫液，透析、濃縮後再用快速液相蛋白系統(FPLC)，過DEAE-52層析柱行第二次層析，用20-500mmol/L NaCl洗脫，收集250-350mmol/L濃度的洗脫液透析、濃縮後可得HSPs。分離得到的HSPs經定性(聚丙烯醯胺凝膠電泳SDS-PAGE、免疫印跡雜交Western-Blot法)、定量後，純度達到電脈純，(電脈後為一條帶)。每次上樣品量與所用的DEAE-52要相匹配，將前步驟的濃縮樣品按1∶5比例配DEAE-52。純度測定後，可作為抗原使用。主要用於惡性腫瘤及傳染病的免疫治療。
實施例2本方法還可在此基礎上試行改進層析時省去Con A-Sepharose層析柱，而只用DEAE-52層析柱行兩次分離。這樣可使成本比方案1進一步大幅度下降。細胞破碎後，直接於FPLC系統上過DEAE-52柱，用20-500mmol/L NaCl洗脫，收集各峰蛋白，行SDS-PAGE，再行Western-Blot，然後尋找HSPs的蛋白峰純化，再測純度及產率，直至HSPs達到電脈純。
用上述方法提取Hcaf細胞(小鼠的肝癌細胞株)HSP-多肽腫瘤抗原實例1、Hcaf細胞培養、擴增、一共9個克氏瓶(每個容積100ml)盛培養液10ml，內有約107細胞)總計用Hcaf細胞9×107個，量約90-100ml，將上述細胞用PBS洗三次，用低滲裂解液60毫升，作用10分鐘後用超聲粉碎機破碎三次，每次3秒，於冰水中，用超高速離心機在4℃環境下離心(105g/分)一小時，取上清液。
2、層析將上清液過Con A-Sepharose柱，6ml/分，收集洗脫液透析濃縮至5ml。再將該樣品於FPLC系統上用DEAE-52分離劑分離，柱子規格40×1.5，20-500mmol/L NaCl洗脫，收集各洗脫峰蛋白，然後每個峰均行SDS-PAGE，測分子量，在E峰發現-70KD蛋白質，再行電泳；用電轉移法將蛋白轉移至硝酸素纖維膜上，以抗HSP-70抗體為一抗，鹼性磷酸酶標記的抗鼠IgG抗體為二抗，行Western-blot定性，顯色後證實該蛋白為HSP70。測定該蛋白純度為97.3％。
以此蛋白為抗原注射給健康的615系近交系小鼠10μg/次，連續二次，每周一次，最後一次注射一周後，再向實驗組小鼠腹腔內注射活的HCaf細胞107個/次/只，則注射HSP70的小鼠長期存活，無一死於腫瘤，而對照組於10日內全部死亡，荷瘤組鼠的生存期比對照組延長了2-3倍。
用HSP70為抗原成功地誘導出了腫瘤特異性的細胞毒T細胞(CTL)，效靶比例為50∶1時，體外殺瘤效應為84.8％，注射給荷瘤鼠後，小鼠腫瘤於注射三次後全部消退，該組小鼠全部存活，無一死於腫瘤。進一步說明該方法提取的腫瘤HSP70具有強大的免疫原性，證明該分離方法實用、有效、純化效果好。
權利要求
1.一種腫瘤HSP-多肽複合物抗原的分離純化方法，包括取瘤組織破碎，使細胞核與膜分離，然後離心、第一次層析、透析、濃縮、第二次層析、定性定量、純度測定，其特徵是破碎時用低滲裂解液與超聲粉碎機並用；在層析時用DEAE-52行第二次層析分離。
2.根據權利要求1所述的分離純化方法，其特徵是破碎步驟a將組織研碎後，過濾一次，用200目網篩；b按固體物體積比1/10，加入低滲裂解液，4℃浸10分鐘後再粉碎；c將低滲裂解液浸泡物放入超聲粉碎機，破碎三次，每次3秒，於冰水中進行，再離心，105g/分鐘，1小時、取上清液。
3.根據權利要求1所述的分離純化方法，其特徵是層析時提取液經ConA-Sepharose層析柱，透析、濃縮後，再用快速液相蛋白系統(FPLC)、過DEAE-52層析柱行第二次分離，用20-500m mol/L NaCl洗脫液，濃縮樣品按1∶5比例配DEAE-52，經上述步驟得到的HSPs可達電脈純。
4.根據權利要求1和3所述的分離純化方法，其特徵是層析時省去ConA-Sepharose層析柱步驟，而只用DEAE-52進行兩次層析分離；細胞破碎後，直接於FPLC系統上過DEAE-52柱，用20-500mmol/L NaCl洗脫，收集各峰蛋白，行SDS-PAGE，再行Western-Blot，然後尋找HSPs的相應蛋白峰，再行一次DEAE-52，以純化，再測純度及產率，直到HSPs達到電脈純。
全文摘要
腫瘤熱休克蛋白－多肽複合物抗原的分離純化方法,包括取瘤組織破碎,使細胞核與膜分離,然後離心、第一次層析、透析、濃縮、第二次層析、定性定量、純度測定,其特徵是破碎時低滲裂解液與超聲粉碎機並用;用EDAE－52行第二次層析分離。這種破碎方法既減少了裂解液的用量,是原有用量的1/18,又能使細胞易於粉碎;該分離純化方法使成本比現有技術下降2/3—3/4,適合於大批量生產,從而使該抗原能夠用於臨床。本發明中層析時還可省去ConA－Sepharose層析步驟,而只用DEAE－52進行兩次層析,此法比方案1更進一步降低成本。
文檔編號C07K1/36GK1257870SQ9812109
公開日2000年6月28日 申請日期1998年12月18日 優先權日1998年12月18日
發明者傅慶國, 郭仁宣 申請人:傅慶國, 郭仁宣