Upf0538蛋白多克隆抗體的獲取方法

2023-05-23 08:21:51

Upf0538蛋白多克隆抗體的獲取方法
【專利摘要】本發明公開了一種UPF0538蛋白多克隆抗體的獲取方法，該方法通過設計的特異性引物，通過RT-PCR技術對UPF0538基因進行克隆測序，再進行原核表達載體pET-28a(+)-UPF0538的構建，然後進行了UPF0538原核表達；最後將UPF0538蛋白純化到85%以上後進行UPF0538多克隆抗體的製備與純化。本發明獲得的產品效價高，特異性好，可以滿足UPF0538蛋白的相關測定，彌補了UPF0538的多克隆抗體的研究空白，為研究UPF0538蛋白提供材料。
【專利說明】UPF0538蛋白多克隆抗體的獲取方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體為UPF0538蛋白多克隆抗體的獲取方法。
【背景技術】
[0002]金屬螯合親和層析是建立在蛋白質表面的胺基酸與固定化金屬離子的親和力的不同來進行蛋白質分離的一項技術。金屬離子能夠與電子供體，如氮、氧、硫等原子以配位鍵結合，金屬離子上剩餘的空軌道是電子供體的配位點，當它在水溶液中時，會被水分子或者陰離子佔據。然而，當蛋白質表面的胺基酸殘基與金屬離子的結合能力較強時，胺基酸殘基的供電原子就會取代原先結合的水分子或者陰離子，從而與金屬離子結合形成複合物。鎳柱親和層析的原理是利用蛋白質表面的組氨酸能與金屬離子Ni2+發生特殊的相互作用，能夠吸附富含組氨酸的蛋白質，從而達到分離純化的目的。
[0003]小鼠UPR)538基因位於I號染色體上，其cDNA為381nt，UPR)538蛋白含有126個胺基酸，分子量約為14.6 kDa。在不同天數(9.5d-17.5d)小鼠胎肝的差異蛋白質組中，發現了 UPR)538蛋白。由此推測，UPF0538蛋白可能與小鼠紅細胞生成有關。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種效價高，特異性好的UPR)538蛋白多克隆抗體的獲取方 法。
[0005]為了實現上述目的，本發明所解決的技術問題採用以下技術方案來實現:
UPF0538蛋白多克隆抗體的獲取方法是利用設計的含有酶切位點引物將
UPTO 5 38基因進行P CR擴增，並通過酶切構建原核表達載體，從而獲得原核表達載體pET-28a (+) -UPF0538 ;再將原核表達載體 pET_28a (+) -UPF0538 轉化大腸桿菌 E.coliBL21 (DE3)並用IPTG進行目的基因的誘導表達，獲得UPR)538蛋白；將UPR)538蛋白純化至85%以上；將純化後的UPR)538蛋白通過脫鹽、濃縮用於免疫兔，在最後一次免疫的一周後頸動脈取血，收集血清；血清純化後，獲得目的UPR)538多克隆抗體。
[0006]作為本發明的進一步方案，所述酶切位點引物包括上遊引物:5 ' -GAGGAATTCATGGCTGCGGAGGAAG-3 ;和下遊引物:5 ; -ACCCTCGAGTCACCAGGACGAGATG-3 ;，上遊引物序列中的 GAATTC 片段為 EcoR I 酶切位點；下遊引物序列中的CTCGAG片段為Xho I酶切位點。
[0007]作為本發明的進一步方案，所述免疫兔為紐西蘭大白兔上，首次免疫後，每隔7天加強免疫I次，抗原量為首次免疫用量的一半，共加強免疫3次，均採用頸部皮下多點注射，首次免疫用弗氏完全佐劑乳化，加強免疫用弗氏不完全佐劑乳化，最後一次免疫7 d後頸動脈取血，血清純化後，獲得目的UPR)538多克隆抗體。
[0008]有益效果
本發明通過設計的特異性引物，通過RT-PCR技術對UPR)538基因進行克隆測序，再進行原核表達載體pET-28a(+)-UPR)538的構建，然後進行了 UPR)538原核表達；最後將UPF0538蛋白純化到85%以上後進行UPR)538多克隆抗體的製備與純化。本發明獲得的產品效價高，特異性好，可以滿足UPR)538蛋白的相關測定，彌補了 UPR)538的多克隆抗體的研究空白，為研究UPF0538蛋白提供材料。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1為為UPR)538PCR的擴增結果示意圖:圖中，1:DL2000 marker, 2:PCR產物；
圖2為重組質粒酶切鑑定圖:圖中，M:DL15000 marker, 1:pET_28a(+)質粒，2:
pET-28a(+)-UPF0538重組質粒，3: EcoR I單酶切重組質粒，4 =EcoR I與Xho I雙酶切重組質粒;
圖3為UPR)538蛋白的表達:圖中，Μ:蛋白marker，1:BL21/pET_28a(+) 未誘導，2:BL21/pET-28a(+)誘導，3:BL21/pET_28a (+) _UPR)538 未誘導，4:BL21/pET-28a(+)-UPF0538 誘導，5:BL21/pET_28a (+)-UPF0538 誘導後超聲上清；
圖4為UPR)538蛋白的純化結果示意圖；
圖5為純化後的UPR)538抗體的效價示意圖； 圖6為PBDCl多克隆抗體的Western blot檢測電鏡圖。
【具體實施方式】
[0010]下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
[0011]UPR)538蛋白多克隆抗體的獲取方法及實驗步驟如下:
(1)將MEL細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養至對數增殖期，收集細胞樣品，_80°C冰箱保存備用；
(2)總RNA的提取及質量、濃度測定:
取培養至對數生長期MEL細胞約5~1X 16'加ImL Trizol，混勻並在_80°C放置過夜，第二天取出置於冰上融化，加200uL氯仿，震蕩使其充分混勻；12000rpm，4°C，離心15分鐘；取上清，加0.5mL異丙醇，-80°C沉澱2小時後，12000rpm，4°C，離心15分鐘，棄上清；加ImL 75%乙醇洗滌RNA沉澱，12000rpm，4°C，離心5分鐘後，棄上清；自然晾乾後，加25 μ LDEPC水溶解RNA，1%甲醛變性凝膠電泳檢測RNA的完整性，核酸定量儀測定濃度，_80°C冰箱保存備用；
(3)引物設計及克隆:
根據鼠UPR)538基因cDNA序列(序列表中的序列2)，設計酶切位點引物:上遊引物:5 ; -GAGGAATTCATGGCTGCGGAGGAAG-3 ;，該引物中序列中的 GAATTC 片段為 EcoR I 酶切位點；下遊引物:5' -ACCCTCGAGTCACCAGGACGAGATG-3 ;，該引物序列中的CTCGAG片段為XhoI酶切位點；
按照反轉錄試劑盒操作程序進行反轉錄，UPF0538基因的PCR擴增:反轉錄產物I μ L，10XK0D Buffer 2.5 μ L, dNTPs(2.5mmol/L)2.5 μ L，上下遊引物各 0.5 μ L, MgSO 4 (25mmol/L) 1.5 μ L，KOD-PIus-Neo 0.5 μ L,加超純水至總體積為25 μ L ;循環程序:95。C預變性5min ;94。C變性30 s，58。C退火30 s，68。C延伸I min，共30個循環；再68。C延伸10 min ；4 ° C保存，1%瓊脂糖凝膠電泳回收UPR)538基因片段；
(4)原核表達載體的構建:
PCR產物經電泳檢測後，按DNA凝膠回收試劑盒說明進行膠回收，pET-28a (+)載體連接PCR純化產物，16° C過夜後轉化連接產物到疋coli BL21 (DE3)感受態細胞，均勻接種於含卡那黴素的LB瓊脂糖平板中，37° C培養過夜後，挑取含有Kan抗性的克隆，對重組質粒進行菌液PCR鑑定、EcoR I/Xho I雙酶切鑑定以及送上海桑尼生物科技有限公司測序分析；將該載體命名為 BL21/pET-28a(+)-UPR)538 ；
(5)UPF-0538蛋白的誘導表達:
將篩選到的含陽性克隆的BL21 (DE3)菌株接種到4 mL含50 mg/L Kan的LB培養基中，37 ° C振蕩培養過夜；再將培養物按1:100的比例接種至400 mL含Kan的LB培養基中，37 ° C振蕩培養4 h，使培養液的A_值達到0.5~0.7，加入IPTG至終濃度為I mmol/L，37° C繼續振蕩培養4 h,最後離心收集菌體；
(6)UPF0538蛋白的純化:
將收集得到的菌體重懸於裂解緩衝液(50 mmol/L NaH2PO4,0.3 mo I/L NaCl，10 mmol/L咪唑，pH 8.0)中，冰浴並超聲波破碎後，離心收集上清，上樣於鎳離子親和層析柱，用洗滌緩衝液(50 mmol/L NaH2PO4,0.3 mo I/L NaCl，40 mmol/L 咪唑，pH 8.0)洗柱，除去非特異結合的蛋白質，最後用洗脫緩衝液(50 mmol/L NaH2PO4,0.3 mo I/L NaCl，100 mmol/L 咪唑，pH 8.0)洗脫，收集目的蛋白溶液，並通過SDS-PAGE來檢測純化結果，將純化好的UPR)538蛋白進行質譜鑑定，UPF0538蛋白氨 基酸序列為序列表中的序列3 ；
(7)UPF0538多克隆抗體的製備:
將純化得到的UPR)538蛋白通過脫鹽、濃縮用於免疫兔，首次免疫500 μ g蛋白，之後每隔7天加強免疫I次，抗原量減半，頸部皮下多點注射，共加強免疫3次；首次免疫用弗氏完全佐劑乳化，加強免疫用弗氏不完全佐劑乳化；末次免疫7 d後頸動脈取血，收集血清作為一抗;
(8)UPF0538多克隆抗體的純化:
20 mL PBS處理proA層析柱，流速為60 mL/h ; 15 mL血清，用PBS稀釋至20 mL,重複上樣一次，流速為 60 mL/h ；30 mL PBS 清洗，流速為 60 mL/h ;用 ρΗ3.0，0.2 M glycine-HCl 抗體洗脫；用PBS洗滌層析柱，4 ° C保存層析柱；
(9)UPF0538多克隆抗體的特異性檢測:
使用ELISA分別檢測終放血後血清效價和純化後得到的抗體效價；4° C抗原包被過夜，BSA封閉，然後加200，1000,5000,10000，20000，60000和240000七個稀釋比進行檢測(一抗)，最後加二抗(羊抗兔-HRP: 1:5000)；
(10)用純化的UPR)538蛋白進行SDS-PAGE電泳，蛋白電轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，然後用上述製備的多克隆抗體(TBST稀釋，稀釋度為1:10000) 4 ° C孵育過夜；TBST洗膜，以辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG室溫孵育2 h，最後用ECL化學發光法顯色。
[0012]結果與分析如下:
1、目的基因PBDCl擴增:以cDNA為模板，PCR擴增含酶切位點序列的基因產物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖1，可見擴增片段與預期基因片段長度一致；
2、重組質粒pET-28a(+)-UPR)538的鑑定:
挑選較好的單克隆菌落搖菌培養後，擴大培養，提取質粒，分別進行EcoR I單酶切和EcoR I與Xho I雙酶切實驗，結果序列表中的序列I所示；
3、UPF0538的誘導表達及可溶性分析:
BL21/pET-28a(+)-UPF0538 經 IPTG 誘導，採取各組份樣品，進行 12% SDS-PAGE 80V
2.5h電泳顯示在約15kDa處存在大量表達的蛋白，與預期大小相符，初步表明UPR)538蛋白在大腸桿菌中得到了表達，表達形式為可溶性表達，如圖3所示；
4、UPF0538蛋白的純化及鑑定:
採用鎳離子親和層析方法對目的蛋白進行純化後，得到的UPR)538融合蛋白純度較高，其相對分子質量約為15kDa，如圖4所示，進一步通過質譜鑑定證實該蛋白確實是UPF0538 蛋白；
5、UPF0538多克隆抗體的ELISA檢測:
ELISA檢測純化的UPR)538抗體的效價，研究發現抗體的效價達6X 104，如圖5所示；
6、PBDCl多克隆抗體 的Westernblot檢測:
Western blot結果表明在15 kDa和25 kDa之間存在特異性條帶，表明製備得到的抗UPF0538蛋白的抗體能與UPR)538蛋白發生免疫印跡反應，如圖6所示；
綜上所述，UPR)538是一個新發現的蛋白。目前，有關它的特性及功能尚不了解。然而，目前還沒有商品化的UPR)538抗體，本研究擬將UPR)538基因片段插入pET_28a(+)載體，轉入大腸桿菌BL21 (DE3)經IPTG誘導，表達出大量、可溶的UPR)538融合蛋白。通過鎳離子親和層析柱分離純化得到含His標籤的重組蛋白。UPR)538蛋白免疫紐西蘭大白兔製備了抗UPF0538蛋白的多克隆抗體，為後續深入研究相關蛋白功能提供實驗材料。且本實驗克隆了 UPR)538基因cDNA序列399bp，進行了原核表達，原核表達載體pET_28a (+) _UPR)538得到了高效表達；純化的UPR)538蛋白能夠滿足多克隆抗體的要求；經ELISA檢測，UPF0538多克隆抗體能與該蛋白特異性結合。製備了高特異性UPR)538多克隆抗體。
[0013]對於本領域技術人員而言，顯然本發明不限於上述示範性實施例的細節，而且在不背離本發明的精神或基本特徵的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示範性的，而且是非限制性的，本發明的範圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和範圍內的所有變化囊括在本發明內。
[0014]此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但並非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。
【權利要求】
1.UPF0538蛋白多克隆抗體的獲取方法，其特徵是，包括以下步驟: (O設計的含有酶切位點引物； (2)利用設計的含有酶切位點引物將UPR)538基因進行PCR擴增，並通過酶切構建原核表達載體，從而獲得原核表達載體pET-28a (+) -UPF0538 ； (3)再將原核表達載體pET-28a(+)-UPF0538轉化大腸桿菌Ε.coli BL21(DE3)並用IPTG進行目的基因的誘導表達，獲得UPR)538蛋白；將UPF0538蛋白純化至85%以上； (4)將純化後的UPF0538蛋白免疫到紐西蘭大白兔上，在最後一次免疫的一周後頸動脈取血，收集血清；血清純化後，獲得目的UPR)538多克隆抗體。
2.根據權利要求1所述的UPR)538蛋白多克隆抗體的獲取方法，其特徵是，所述酶切位點引物包括上遊引物:5 ^ -GAGGAATTCATGGCTGCGGAGGAAG-3丨和下遊引物:5 ; -ACCCTCGAGTCACCAGGACGAGATG-3 ;，上遊引物序列中的 GAATTC 片段為 EcoR I 酶切位點；下遊引物序列中的CTCGAG片段 為Xho I酶切位點。
3.根據權利要求1所述的UPR)538蛋白多克隆抗體的獲取方法，其特徵是，所述免疫兔為紐西蘭大白兔上，首次免疫後，每隔7天加強免疫I次，抗原量為首次免疫用量的一半，共加強免疫3次，均採用頸部皮下多點注射，首次免疫用弗氏完全佐劑乳化，加強免疫用弗氏不完全佐劑乳化，最後一次免疫7 d後頸動脈取血，血清純化後，獲得目的UPR)538多克隆抗體。
【文檔編號】C07K16/18GK104031931SQ201410311523
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年7月2日 優先權日:2014年7月2日
【發明者】胡江江, 戚武林, 高亞軍, 張世馥, 趙輔昆 申請人:浙江理工大學