一種快速檢測犬的巴貝西蟲pcr方法及應用的製作方法
2023-05-23 21:39:56 3
專利名稱：一種快速檢測犬的巴貝西蟲pcr方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物工程技術，特別是一種快速檢測犬的巴貝西蟲PCR方法及應用，基於巴貝西蟲18s RNA基因序列設計合成的1對特異性診斷引物，同時公開了 PCR診斷方法的操作。
背景技術：
巴貝西蟲病是廣泛發生於各種家畜，經蜱傳播的一種血源性原蟲病。其在家畜體內單個或成對寄生於紅細胞內，引起嚴重的貧血和血紅蛋白尿症。引起犬的巴貝西蟲病的病原體有3種，即犬巴貝西蟲(Babeisa canis)、韋氏巴貝西蟲(B. vitlli)和吉氏巴貝西蟲(B. gibsoni)。犬巴貝西蟲分布於歐洲、美洲和印度，韋氏巴貝西蟲分布於南美洲，吉氏巴貝西蟲分布於亞洲。我國主要流行的蟲種為吉氏巴貝西蟲，該病在國內廣泛分布，有蜱滋生的地方，春、夏、秋季均可發病，故對這類疾病應當有一定的認識。目前，血液原蟲診斷方法主要有塗片染色鏡檢、酶聯免疫反應、間接螢光、多聚酶鏈式反應(PCR)等。塗片染色鏡檢法雖然設備簡單、操作簡便，但是檢測率低。在檢測隱性帶蟲感染時則易出現假陰性。血清學診斷法不能區別是現在感染還是過去感染。而PCR技術以其較高的特異性和敏感性被學者認為是檢測巴貝西蟲的最有效方法。因此建立行之有效的巴貝西蟲檢測方法，進而為診斷和治療犬巴貝西蟲病提供良好的基礎，對巴貝西蟲的防控工作有著積極的作用。本發明利用PCR技術，提供了一對特異性引物，擴增出包含犬的巴貝西蟲18s RNA 基因差異序列的片段，並在此基礎上建立了診斷方法，該方法可在犬的巴貝西蟲的診斷和流行病學調查中發揮一定作用。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種快速檢測犬的巴貝西蟲PCR方法及應用， 針對現有診斷巴貝西蟲方法的不足，提供一種能夠快速，特異性的診斷方法；基於巴貝西蟲 18s RNA基因序列設計合成的1對特異性診斷引物，同時公開了 PCR診斷方法的操作。為了實現解決上述技術問題的目的，本發明採用了如下技術方案 本發明的一種快速檢測犬的巴貝西蟲PCR方法，包括下述步驟
(1)樣品DNA抽提
首先於待檢犬前肢隱靜脈取300 μ 1抗凝血，之後提取DNA，獲得DNA即可作為PCR檢測的DNA樣品；
(2)樣品檢測
犬的巴貝西蟲PCR的診斷方法如下其反應體系為25μ 1，即Taq酶即熱穩定性的DNA 聚合酶 1 U、Taq 酶自帶 10XPCR Buffer 2. 5 μ 1、Taq 酶自帶 25 mmol · Γ1 Mg2+鹽 3. 0μ 1、10 mmol · L—1 mix dNTP即三磷酸脫氧核糖核苷0. 5 μ 1、IOpmol · μΓ1本發明提供的一對犬巴貝西蟲特異性PCR引物的上下遊引物各0. 5 μ 1、待測犬全血DNA樣品4. 0 μ 1， 加純水至25.0 μ 1;反應程序為95 °C預變性5 min，之後95 °C變性45 s，56°C退火45 s， 72°C延伸45 s，將變性、退火、延伸三個過程進行35個循環，最後再72 °C延伸7 min，之後冷卻至4°C，PCR反應結束；所述的一對犬的巴貝西蟲特異性PCR引物，其上遊引物Fl核苷酸序列為GTAATTCCAGCTCCAATA，下遊引物F2核苷酸序列為TTTCGCAGTAGTTCGTC ； (3)結果判定
反應結束後取5 μ PCR產物在2.0 %ΕΒ (溴化乙錠)染色的瓊脂糖凝膠上電泳；電泳後，紫外燈下觀察結果，出現大小約為319bp的片段的樣品為陽性結果，即為巴貝西蟲感染犬。提取DNA的方法可以為使用市售全血DNA提取試劑盒按說明書進行操作提取，以 TAKARA公司全血DNA提取試劑盒為例，步驟如下
(1)、按處理樣品數準備1.5 ml離心管，並各加入(ienTLE Solution I 500 μ 1。把混合均勻的100 μ 1血液，加入到分裝好的GenTLE Solution I的離心管中，立即震蕩數秒鐘，例如3 15秒；
(2)、室溫放置10分鐘以上，然後在室溫條件下12，000rpm以上離心5分鐘；
(3)、用移液槍小心除去管中溶液，此時沉澱看不清，緊貼在離心管微車的內壁上，除去溶液時，槍頭不要碰到離心管外側的內壁，插到離心管內側的底部，不要吸走沉澱物；
(4)、加入1ml的GenTLE Solution II ；此時GenTLE Solution II應沿著理性管內側壁加入大離心管中；
(5)、輕柔地上下顛倒離心管2 10次，室溫12，000rpm以上離心2分鐘，用移液槍小心地除去上清溶液；
(6)、向離心管中加入GenTLESolution III 500 μ 1，輕微震蕩10秒充分混合； 室溫12，000 rpm以上離心5分鐘，把上清溶液移至另一個新的離心管中；
(7)、加入等體積(500μ 1)的異丙醇，上下輕柔顛倒2 10次，均勻混合；
(8)、4°C、12，000rpm離心5分鐘，小心除去上清溶液；
(9)、加入Iml的70%乙醇清洗沉澱，4°C、12，000rpm離心5分鐘，小心除去上清溶液；
(10)、乾燥沉澱；離心管中沒有乙醇氣味即可；
(11)、用10-50μ1的TE緩衝液(IOmM Tris-HCl (三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩衝液)，ImM EDTA (乙二胺四乙酸)，ρΗ=8.0)溶解沉澱。注以上步驟中出現的試劑GenTLE Solution I、II、III均為試劑盒自帶試劑。本發明的上述快速檢測犬的巴貝西蟲PCR方法在檢測犬巴貝西蟲上的應用。通過採用上述技術方案，本發明具有以下的有益效果
1、利用本發明中的方法對犬的巴貝西蟲進行檢測，檢測速度快——僅需2小時即可得到結果、靈敏度高——樣品稀釋1000倍仍能檢測出蟲體DNA的存在、選擇性強不與其他DNA 反應；
2、利用本發明中的方法對犬巴貝西蟲進行檢測，只需一臺PCR儀和一臺電泳儀即可檢測，另外，PCR擴增獲得的片段包含三種犬的巴貝西蟲(犬巴貝西蟲、韋氏巴貝西蟲和吉氏巴貝西蟲)差異序列可作為犬巴貝西蟲流行病學調查之用。
具體實施例方式在本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。下面結合具體的製備實施例和應用實施例，並參照數據進一步詳細地描述本發明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的範圍。實施例1 1.發病情況
2010年7月16日，洛陽市郊區某廠一德國牧羊犬，雄性，4個月，按正常程序免疫。據了解，場內有許多草地運動場，犬只常在草地上玩耍，經常能在犬隻身上找到蜱蟲，隔壁廠內有一隻患血蟲病的犬只。臨床觀察，該犬只精神沉鬱，少食或者不食，尿液呈黃褐色，體溫高達40攝氏度，可視黏膜為貧血輕度黃疸，尿液呈黃色。經鏡檢未發現蟲體，建議進行PCR 檢測。操作過程如下 (1)樣品DNA抽提
首先於待檢犬前肢隱靜脈取300 μ 1抗凝血，之後使用全血DNA提取試劑盒(ΤΑΚΑΤΑ公司)按說明書進行操作提取DNA，獲得DNA即可作為PCR檢測的DNA樣品。(2)樣品檢測
將DNA樣品進行PCR檢測。其反應體系為25 μ 1，即Taq酶(TAKARA公司)1 U、Taq酶自帶 10XPCR Buffer 2. 5 μ 1、Taq 酶自帶 25 mmol · L-1 Mg2+鹽 3.0 μ 1,10 mmol · L-1 mix dNTP (三磷酸脫氧核糖核苷)0.5 μ 、IOpmol · μΓ1本發明提供的上下遊引物各0. 5 μ 1、第一步獲得的待測犬全血DNA樣品4.0 μ 1，加雙蒸水至25.0 μ 1。另其反應程序為 95 °C預變性5 min，之後95 °C變性45 s，56°C退火45 s，72°C延伸45 s，將變性、退火、延伸三個過程進行35個循環，最後再72 °C延伸7 min，之後冷卻至4°C，PCR反應結束。(3)結果判定
反應結束後取5 ul PCR產物在2. 0%ΕΒ染色的瓊脂糖凝膠上電泳。電泳後，紫外燈下觀察結果。出現大小約為319bp的片段的樣品為陽性結果，即判定為巴貝西蟲感染犬。其檢測結果具體圖片表現為測試結果瓊脂糖凝膠上自左至右依次為Marker、犬的巴貝西蟲DNA PCR結果、陽性犬PCR結果的特性條帶；陽性犬PCR結果的特性條帶與犬的巴貝西蟲DNA PCR結果的特性條帶出現在與Marker 300bp條帶大體相同的水平位置。檢測犬的巴貝西蟲PCR診斷方法的特異性的結果圖片為測試結果瓊脂糖凝膠上自左至右依次為Marker、陽性犬PCR結果、陰性對照、滅菌三蒸水、巴氏桿菌、附紅細胞體的的特性條帶。陽性犬PCR結果的特性條帶與Marker 300bp條帶大體相同的水平位置。其他陰性對照、滅菌三蒸水、巴氏桿菌、附紅細胞體未出現近似位置特性條帶。檢測犬的巴貝西蟲PCR方法的靈敏度的結果圖片為測試結果瓊脂糖凝膠上自左至右依次為Marker、陽性犬PCR結果、陰性對照、10倍稀釋樣品PCR結果、100倍稀釋樣品 PCR結果、1 000倍稀釋樣品PCR結果、10 000倍稀釋樣品PCR結果、100 000倍稀釋樣品 PCR結果、1 000 000倍稀釋樣品PCR結果。陽性犬PCR結果、10倍稀釋樣品PCR結果、100 倍稀釋樣品PCR結果、1 000倍稀釋樣品PCR結果均出現的特異性條帶與Marker 300bp條帶出現在近似位置。其他陰性對照、10 000倍稀釋樣品PCR結果、100 000倍稀釋樣品PCR結果、1 000 000倍稀釋樣品PCR結果未出現近似位置特性條帶。2.診斷與治療
根據流行病學、臨床症狀觀察和PCR方法檢測將該病犬診斷為患有巴貝西蟲病。病犬按犬的巴貝西蟲病常規治療，治療後症狀基本消失，食慾、飲欲恢復。3.小結
目前血液原蟲診斷方法主要使用塗片染色鏡檢的方法，但該方法往往出現漏檢的情況，本發明提供的PCR診斷引物及PCR方法在不失快速簡便的前提下，提高了檢出率為臨床正確治療犬的巴貝西蟲病提供了有力支持。
權利要求
1.一種快速檢測犬的巴貝西蟲PCR方法，其特徵是包括下述步驟(1)樣品DNA抽提首先於待檢犬前肢隱靜脈取300 μ 1抗凝血，之後提取DNA，獲得DNA即可作為PCR檢測的DNA樣品；(2)樣品檢測犬的巴貝西蟲PCR的診斷方法如下其反應體系為25μ 1，即Taq酶即熱穩定性的DNA 聚合酶 1 U、Taq 酶自帶 10XPCR Buffer 2. 5 μ 1、Taq 酶自帶 25 mmol · Γ1 Mg2+鹽 3. 0 μ 1、10 mmol · L—1 mix dNTP即三磷酸脫氧核糖核苷0. 5 μ 1、IOpmol · μΓ1本發明提供的一對犬巴貝西蟲特異性PCR引物的上下遊引物各0. 5 μ 1、待測犬全血DNA樣品4. 0 μ 1， 加純水至25.0 μ 1;反應程序為95 °C預變性5 min，之後95 °C變性45 s，56°C退火45 s， 72°C延伸45 s，將變性、退火、延伸三個過程進行35個循環，最後再72 °C延伸7 min，之後冷卻至4°C，PCR反應結束；所述的一對犬的巴貝西蟲特異性PCR引物，其上遊引物Fl核苷酸序列為GTAATTCCAGCTCCAATA，下遊引物F2核苷酸序列為TTTCGCAGTAGTTCGTC ；(3)結果判定反應結束後取5 μ PCR產物在2.0 %ΕΒ (溴化乙錠)染色的瓊脂糖凝膠上電泳；電泳後，紫外燈下觀察結果，出現大小約為319bp的片段的樣品為陽性結果，即為巴貝西蟲感染犬。
2.根據權利要求1所述快速檢測犬的巴貝西蟲PCR方法，其特徵是提取DNA的方法為使用市售全血DNA提取試劑盒按說明書進行操作進行提取。
3.根據權利要求1所述快速檢測犬的巴貝西蟲PCR方法，其特徵是抗凝血提取DNA 使用市售全血DNA提取試劑盒按說明書進行操作，具體使用TAKARA公司全血DNA提取試劑盒，步驟如下(1)、按處理樣品數準備1.5ml離心管，並各加入GenTLE Solution I 500 μ 1 ；把混合均勻的100 μ 1血液，加入到分裝好的GenTLE Solution I的離心管中，立即震蕩3 15秒鐘；(2)、室溫放置10分鐘以上，然後在室溫條件下12，000rpm以上離心5分鐘；(3)、用移液槍小心除去管中溶液，此時沉澱看不清，緊貼在離心管微車的內壁上，除去溶液時，槍頭不要碰到離心管外側的內壁，插到離心管內側的底部，不要吸走沉澱物；(4)、加入1ml的GenTLE Solution II ；此時GenTLE Solution II應沿著理性管內側壁加入大離心管中；(5)、輕柔地上下顛倒離心管2 10次，室溫12，000rpm以上離心2分鐘，用移液槍小心地除去上清溶液；(6)、向離心管中加入GenTLESolution III 500 μ 1，輕微震蕩10秒充分混合；室溫12，000 rpm以上離心5分鐘，把上清溶液移至另一個新的離心管中；(7)、加入等體積(500μ 1)的異丙醇，上下輕柔顛倒2 10次，均勻混合；(8)、4°C、12，000rpm離心5分鐘，小心除去上清溶液；(9)、加入Iml的70%乙醇清洗沉澱，4°C、12，000rpm離心5分鐘，小心除去上清溶液；(10)、乾燥沉澱；離心管中沒有乙醇氣味即可；(11)、用10-50μ1的TE緩衝液(IOmM Tris-HCl (三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩衝液)，ImMEDTA (乙二胺四乙酸)，pH=8.0)溶解沉澱。
4. 一種權利要求1所述快速檢測犬的巴貝西蟲PCR方法在檢測犬巴貝西蟲上的應用。
全文摘要
本發明介紹了一種快速檢測犬的巴貝西蟲PCR方法及應用，使用Taq酶1U、Taq酶自帶10×PCRBuffer2.5μl、Taq酶自帶25mmol·L-1Mg2＋鹽3.0μl、10mmol·L-1mixdNTP0.5μl、 10pmol·μl-1犬的巴貝西蟲特異性PCR上下遊引物各0.5μl、待測DNA樣品4.0μl，加水至25.0μl，95℃預變性5min，變性、退火、延伸進行35個循環，72℃延伸7min，冷卻結束反應。本方法檢測速度快，2小時可得結果，樣品稀釋1000倍仍能檢測，選擇性強不與其他DNA反應。
文檔編號C12Q1/68GK102230008SQ20111015724
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月13日 優先權日2011年6月13日
發明者何萬領, 尚澤松, 張才, 朱重偉, 李小康, 楊自軍, 王亞壘, 王雪瑩 申請人:河南科技大學