免疫組化二抗試劑盒的製作方法
2023-04-22 18:17:06
專利名稱：免疫組化二抗試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種免疫組化二抗試劑盒，特別涉及一種包括三聚氯氰活化辣根過氧化物酶標記免疫球蛋白的免疫組 化二抗試劑盒。
背景技術：
19世紀40年代，Coons首先建立了免疫組織化學法，隨後被廣泛應用到生物學的多個領域，包括細胞功能研究、腫瘤形成過程的研究，以及感染性疾病的檢測等。近幾年來，隨著雜交技術及單克隆抗體技術的發展，使製備的診斷抗體具有更高的特異性和敏感性。免疫組化技術藉助這些新技術的發展，在臨床病理學、免疫學、微生物學診斷中發揮了巨大的實用價值。酶標抗體技術是通過共價鍵經適當方法將酶連接在抗體上，製成酶標抗體，再借酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，於光鏡或電鏡下進行細胞表面及細胞內各種抗原成分的定位。酶標記抗體的質量主要取決於純度好、活性強及親和力高的酶親和抗體，其次要有良好的製備方法。辣根過氧化物酶是最常用的一種酶。抗體與酶連接的方法很多，目前較為常用的主要是戊二醛法和改良的過碘酸鈉法。戊二醛是一種同型雙功能偶聯劑，其兩個醛基可以與鹼性胺基酸的氨基形成希夫鹼或麥可加成複合物，也可以與胱氨酸的巰基、酪氨酸和組氨酸的苯環和咪唑環發生交聯。抗體和辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶都是富含上述基團的生物分子，所以可以通戊二醛將兩者連接起來。根據偶聯反應中酶與抗體的反應的順序，戊二醛法可以分為一步法和兩步法。戊二醛一步法將偶聯劑戊二醛、抗體和酶進行反應，該方法簡單、省時、有效和重複性好等；缺點是交聯反應速率不同，抗體蛋白的胺基酸數遠較HRP為多，與戊二醛反應快，不易控制，易形成較大的聚合體，而與酶蛋白分子間的交聯相應減少，影響酶的標記；結合效率非常低，約為1%_5%，很難獲得理想的酶標抗體。戊二醛二步法首先將偶聯劑戊二醛與抗體或酶進行反應，待除去多餘的偶聯劑後，再與另一種物質反應；該比較簡單，重複性好，能夠減少自身聚合物的產生，缺點仍然是酶的利用率低，一般只有2 4%的酶與蛋白質結合。綜上所述，戊二醛法HRP的活性效率和與IgG結合的效率都非常低，反應可控性差。簡易過碘酸鈉法是以NaIO4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，經氧化形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連形成希夫鹼，後者可進一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩定的酶標記抗體。該方法所獲酶標記抗體的產率高，將近70%的HRP和Ig結合，90%的IgG與酶結合，是目前最常用的方法。本法標記步驟比較簡單，重複性好。缺點是過碘酸鈉將HRP發揮主要功能的糖環打開，HRP活性降低；反應中需要NaBH4 (有毒)的參與，危險性
增加，切雜質不易去除。反應式如下
權利要求
1.一種免疫組化二抗試劑盒，其特徵在於包括三聚氯氰活化的辣根過氧化物酶標記免疫球蛋白，即CC-HRP-Ig; 所述CC-HRP-Ig由以下方法製得 (1)活化三聚氯氰與辣根過氧化物酶或免疫球蛋白反應，得活化的辣根過氧化物酶或活化的免疫球蛋白； (2)偶聯所述活化的辣根過氧化物酶與免疫球蛋白偶聯反應得CC-HRP-Ig，或所述活化的免疫球蛋白與辣根過氧化物酶偶聯反應得CC-HRP-Ig ； 反應式如下
2.根據權利要求I所述的一種免疫組化二抗試劑盒，其特徵在於所述免疫球蛋白為免疫球蛋白G、單價免疫球蛋白片段Fab、雙價免疫球蛋白片段F (ab) 2或免疫球蛋白M,所述三聚氯氰、辣根過氧化物酶與免疫球蛋白的質量比為I :(0. 1-10) (0. 1-10)。
3.根據權利要求I所述的一種免疫組化二抗試劑盒，其特徵在於步驟(I)中，所述反應溫度為0°C -8°C，反應時間為2-8h。
4.根據權利要求I所述的一種免疫組化二抗試劑盒，其特徵在於步驟(2)中，所述反應溫度為25°C -40°C，反應時間12h-24h。
5.根據權利要求I所述的一種免疫組化二抗試劑盒，其特徵在於所述CC-HRP-Ig存在於溶液中，所述溶液包括如下組分6-18mg/L CC-HRP-Ig，5-20g/L牛血清白蛋白，0.05-0. lg/L 硫柳汞和 pH 7. 0-7. 4 的 0. 01-0. lmol/L 磷酸鹽緩衝液。
6.根據權利要求I所述的一種免疫組化二抗試劑盒，其特徵在於試劑盒還包括山羊血清溶液，所述山羊血清溶液包括體積百分濃度為1-10%的山羊血清，0. 05-0. lg/L硫柳汞和pH 7. 0-7. 4的0. 01-0. lmol/L磷酸鹽緩衝液。
7.根據權利要求I所述的一種免疫組化二抗試劑盒，其特徵在於試劑盒還包括體積百分濃度為3-10%的雙氧水水溶液。
8.根據權利要求I所述的一種免疫組化二抗試劑盒，其特徵在於試劑盒還包括二氨基聯苯胺固體或二氨基聯苯胺濃縮液，所述二氨基聯苯胺濃縮液的濃度為30-100g/L。
9.根據權利要求I所述的一種免疫組化二抗試劑盒，其特徵在於試劑盒還包括二氨基聯苯胺反應底物，所述二氨基聯苯胺反應底物為體積百分濃度為1-10%雙氧水水溶液。
10.權利要求I所述的免疫組化二抗試劑盒的製備方法，其特徵在於包括以下步驟 (1)活化三聚氯氰與辣根過氧化物酶或免疫球蛋白反應，得活化的辣根過氧化物酶或活化的免疫球蛋白； (2)偶聯所述活化的辣根過氧化物酶與免疫球蛋白偶聯反應得CC-HRP-Ig，或所述活化的免疫球蛋白與辣根過氧化物酶偶聯反應得CC-HRP-Ig ； (3)免疫組化二抗試劑盒的製備利用所述CC-HRP-Ig製備免疫組化二抗試劑盒；反應式如下
全文摘要
本發明提供了一種免疫組化二抗試劑盒，包括三聚氯氰活化的辣根過氧化物酶標記免疫球蛋白溶液，即CC-HRP-Ig。所述CC-HRP-Ig由以下方法製得步驟一活化，三聚氯氰與辣根過氧化物酶或免疫球蛋白反應，得活化的辣根過氧化物酶或活化的免疫球蛋白；步驟二偶聯所述活化的辣根過氧化物酶與免疫球蛋白偶聯反應，或所述活化的免疫球蛋白與辣根過氧化物酶偶聯反應得CC-HRP-Ig。該免疫組化二抗試劑盒抗體效價高，靈敏度高，成本低。
文檔編號G01N33/68GK102707069SQ20121018136
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月4日 優先權日2012年6月4日
發明者馮展波, 劉冬, 周軍 申請人:南京巴傲得生物科技有限公司