氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸基因編碼螢光探針及其製備方法和應用的製作方法

2023-04-27 09:46:11

氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸基因編碼螢光探針及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及煙醯胺腺嘌呤二核苷酸基因編碼螢光探針及其製備方法和應用。一方面，本發明涉及煙醯胺腺嘌呤二核苷酸的檢測探針，具體涉及煙醯胺腺嘌呤二核苷酸的重組螢光融合蛋白檢測探針。在一個具體方面，本發明涉及氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的重組螢光融合蛋白檢測探針。本發明也涉及上述檢測探針的製備方法及其分別在檢測NAD+中的應用。
【專利說明】氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸基因編碼螢光探針及其製備 方法和應用
[0001] 本申請是申請號201110288807.6,申請日為2011年9月26日，名為"煙醯胺腺嘌 呤二核苷酸基因編碼螢光探針及其製備方法和應用"的發明專利申請的分案申請。母案的 全部內容在此通過引用全文納入本文用於所有目的。

【技術領域】
[0002] 本發明涉及煙醯胺腺嘌呤二核苷酸的檢測探針，具體涉及煙醯胺腺嘌呤二核苷酸 的重組螢光融合蛋白檢測探針。在一個具體方面，本發明涉及還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷 酸（NADH)的重組螢光融合蛋白檢測探針；在另一個具體方面，本發明涉及氧化型煙醯胺腺 嘌呤二核苷酸（NAD+)的重組螢光融合蛋白檢測探針；在又一方面，本發明涉及還原型和氧 化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸比率的重組螢光融合蛋白檢測探針。本發明也涉及上述檢測探 針的製備方法及其分別在檢測NADH、NAD+和NADH/NAD+比率中的應用。

【背景技術】
[0003] NAD+及NADH作為輔酶，是呼吸鏈的重要組成部分，它參與了呼吸鏈中的電子傳遞 過程（Rich, P. R?等，Biochem Soc Trans. 2003, V. 31 (6)，pp. 1095-1105)。在呼吸鏈的氧 化還原反應中，NAD+作為質子的載體，當其接受了其他分子傳遞過來的一個電子後，由最初 的氧化態轉變為還原態，該反應的最終產物為NADH，而NADH可以作為還原劑向其他分子 提供電子（Belenky, P?等，Trends in Biochemical Sciences. 2007, V. 32(1)，pp. 12-19)。 近來的研究表明，NAD(H)不僅參與能量代謝、物質合成以及抗氧化作用，還涉及到體內的 鈣穩態、基因表達、免疫作用以及細胞衰老與死亡等等，而NAD(H)在其中均有著至關重要 的作用，因此NAD(H)本身及其代謝所涉及的眾多酶類也成為了藥物設計的靶標（Sauve，A. A?等，J Pharmacol Exp Ther. 2008, V. 324(3)，pp. 883-893)。
[0004] 但是，大多數活細胞內的NAD⑶的總量大約為KT6M?10_3M，而且NAD+/NADH的 比例也隨著細胞內狀態不同而不盡相同（Lin, S.J.等，Current Opinion in Cell Biolo gy. 2003, V. 15(2)，pp. 241-246)，因此這給NAD (H)的測定帶來了極大的不便。較早的檢測 方法主要是利用NADH在340nm紫外光區有特徵吸收，由此建立了紫外分光光度法，該方法 存在兩個主要的缺陷：1、有效靈敏度受儀器精密度所限，約為KT 7M ;2、在複雜體系中，不能 有效地區分NADH與NADPH。隨後，根據NAD+作為輔酶，在電子傳遞過程中接受電子轉變為 NADH的特性，發展出了一系列酶學檢測方法。其他如HPLC分析、電化學法、毛細管電泳、熒 光成像等方法也常見諸於各種文獻報導中。然而，大部分的方法或者對單個細胞中靶標分 子的靈敏度不足，或者不能進行亞細胞器定位。特別需要指出的是，這些現有方法均存在 一個主要的缺陷，即需要對樣品進行裂解、分離、純化等操作，而NADH本身又極易氧化，在 一系列繁瑣的操作中極易將誤差引入，導致最終顯示的結果與實際存在出入。另外，這些 現有方法不能應用於活體動物或細胞，不能進行實時地檢測，這限制了這些方法在臨床疾 病診斷及藥物前體研究等鄰域的應用。目前在活體或細胞上只能採用NADH自發螢光來檢 測（Zhang, Q. H?等，Science. 2002, V. 295(5561)，pp. 1895-1897)，而這種傳統方法存在以 下嚴重缺陷：首先，已知細胞對NAD+/NADH和NADP+/NADPH的調控是相對獨立的，正常狀態 下NAD+/NADH的比例大約在700:1，而NADP+/NADPH的比例在1:200 ;其次，它們的氧化還原 勢存在著巨大的區別，這反映出NADH與NADPH分別在能量代謝與合成代謝中扮演截然不同 的角色；第三，NADH與NADPH自發螢光完全不可區分，利用自發螢光進行成像測量獲得的結 果是NADH與NADPH之和，鑑於NADH含量很低且大部分以蛋白質結合形式存在，所以NADH 自發螢光數據實質反映的是蛋白質結合的NADPH的濃度（Zhang，Q.H.等，Science. 2002， V. 295 (5561)，pp. 1895-1897);第四，由於NADH激發波長位於紫外區（340nm)且自發螢光較 弱，需要複雜昂貴的儀器如用於臨床監測的儀器CritiView，再加上紫外光對組織的穿透力 很弱並會造成細胞損傷，這些光學特性嚴重製約了自發螢光監測的應用。
[0005] 因此，本領域亟需發展一種特異性NADH檢測技術，特別是一種適合生理水平和亞 細胞水平的特異性NADH檢測技術。
[0006] 而相對於傳統的小分子染料檢測技術以及迅速發展的量子點檢測技術，螢光蛋白 檢測技術在大多數的活體細胞成像方面具有獨一無二的壓倒性優勢，它能夠通過遺傳導入 至細胞、組織乃至整個器官中，因此螢光蛋白能夠作為一個全細胞標記物或基因啟動激活 的指示器。
[0007] 綠色突光蛋白最初是從維多利亞多管發光水母（Aequorea victoria)中提取，野 生型的AvGFP由238個胺基酸構成，分子量約為26kD。當前的研究確認，天然GFP蛋白中第 65?67位的三個胺基酸Ser-Tyr-Gly能夠自發形成一個突光生色基團：對-輕基苯亞甲 基咪唑啉酮（p-hydroxybenzylideneimidazolinone)，是其主要的發光位置。野生型AvGFP 的光譜特徵十分複雜，其螢光激發的主峰在395nm處，而在475nm處另有一個附峰，後者振 幅強度約為前者的1/3。在標準的溶液條件下，395nm處的激發可產生508nm處的發射， 而475nm處的激發產生的最大發射波長位於503nm(Heim，R?等，Proc Natl Acad Sci U S A. 1994, V. 91(26)，pp.12501-12504)。
[0008] 隨著對GFP蛋白突變的研究日漸深入，利用分子生物學技術，目前已經發展出多 種表現突出的GFP衍生物，通過在野生型GFP基礎上進行不同的單點突變或者組合，可獲得 諸如增強型GFP(S65T，F64L)、YFP(T203Y)、CFP(Y66W)等。而藉助對GFP蛋白序列的重新 排列，將原第145-238位胺基酸部分作為新蛋白的N端，原第1-144位胺基酸作為新蛋白的 C端，兩片段間通過一小段具有柔性的短肽鏈連接，形成一個對空間變化敏感的環狀排列熒 光蛋白（circular permutation fluorescent protein)，在此基礎上對原蛋白 T203Y進行 的點突變就形成了環狀排列的黃色螢光蛋白cpYFP(Nagai，T.等，Proc Natl Acad Sci U S A. 2001，V. 98 (6)，pp. 3197-3202)。
[0009] 由於對螢光蛋白研究日益深入，相關的一些基於螢光的分析檢測技術也獲得了進 一步的發展。例如當前常用的螢光共振能量轉移（FRET)技術，該技術主要原理是當兩個熒 光發色基團在足夠靠近時，當供體分子吸收一定頻率的光子後被激發到更高的電子能態， 在該電子回到基態前，通過偶極子相互作用，實現了能量向鄰近的受體分子轉移（即發生 能量共振轉移）。FRET是一種非輻射能量躍遷，通過分子間的電偶極相互作用，將供體激發 態能量轉移到受體激發態的過程，使供體螢光強度降低，而受體可以發射更強於本身的特 徵螢光（敏化螢光），也可以不發螢光（螢光猝滅）。當前對綠色螢光蛋白的進一步研究發 現，衍生自綠色螢光蛋白突變體的青色螢光蛋白（CFP)和黃色螢光蛋白（YFP)是一對表現 出色的供體/受體對。CFP的發射光譜與YFP的吸收光譜有相當的重疊，當它們足夠接近 時，用CFP的吸收波長激發，CFP的發色基團將會把能量高效率地共振轉移至YFP的發色基 團上，所以CFP的發射螢光將減弱或消失，主要發射將是YFP的螢光。兩個發色基團之間的 能量轉換效率與它們之間的空間距離的6次方成反比，對空間位置的改變非常靈敏。因此 現有研究報導利用基因工程重組手段將期望研究的蛋白基因兩端分別與CFP與YFP融合表 達出一個全新的融合蛋白，該蛋白與其專一性的靶標分子的結合所產生的空間變化即通過 螢光的變化所直觀地顯現。
[0010] 因此，本文所用的螢光蛋白序列可以來自於維多利亞多管發光水母（Aequorea victoria)的螢光蛋白及其衍生物，包括但不局限於這些突變體：黃色螢光蛋白（YFP)、綠 色螢光蛋白（GFP)、青色螢光蛋白（CFP)等的序列，其中優選黃色螢光蛋白YFP的序列，更優 選環狀排列的黃色螢光蛋白cpYFP的序列。
[0011] 本技術中所涉及的另一蛋白，YdiH蛋白（又稱為Rex蛋白）是一種本領域已知的 細菌轉錄抑制蛋白，分子量為23 kDa，它能調控發酵和厭氧呼吸。常見的YdiH蛋白來自嗜 熱水生菌（Thermus aquaticus)(SEQ ID NO:I NCBI GenBank :AF061257.1)、天藍色鏈黴 菌（Streptomyces coelicolor) (SEQ ID NO :2 NCBI GenBank :AL939116. 1)或枯草芽抱杆 菌（Bacillus subtilis)(SEQ ID NO :3 NCBI GenBank :AL009126. 3)，YdiH 蛋白首次獲得 鑑定是Brekasis和Paget等人於2003年在天藍色鏈黴菌（Streptomyces coelicolor)中 發現的，這是一種廣泛存在於革蘭氏陽性菌中的一種對氧化還原敏感的調控蛋白。對於天 藍色鏈黴菌（S. coelicolor) YdiH(Rex)蛋白的研究顯示，這是一種典型的含有Rossmann結 構域的NAD(H)結合蛋白。其中關鍵的Rossmann結構域是一種主要存在於核苷酸結合蛋 白中的蛋白質超二級結構，是典型的輔因子NAD(H)結合結構域，以各類輔因子NAD結合蛋 白為代表。該結構主要由6個0摺疊通過2對a螺旋以有序的形式組 成。因為每個Rossmann結構域只能結合一個核苷酸分子，因此類似NAD這類的二核苷酸結 合蛋白的結構域中存在兩個成對的Rossmann部分。當前研究顯示天藍色鏈黴菌YdiH(Rex) 蛋白能夠直接感應胞質NADH/NAD+比率的變化，而在有氧環境下，當細胞內NADH/NAD+比率 處於低水平時，YdiH(Rex)蛋白可抑制其祀基因（cydABC、nuoA_D和rexhemAO))的轉錄， 而NADH/NAD+比率的升高能夠使Rex從其操縱子位點解離，在這一動態過程中YdiH(Rex) 蛋白的空間構象會隨著環境的變化而發生改變（Brekasis，D.等，EMBO J. 2003, V. 22(18)， pp. 4856-4865)。因此Rex蛋白是一個很好的細胞內NADH檢測探針的候選者。同時，最近 Wang等人對枯草芽孢桿菌YdiH(Rex)蛋白進行結晶並對其作用機理和功能進行了部分研 究，結果顯示源自枯草芽孢桿菌的YdiH(Rex)蛋白是一個同源二聚體蛋白，由兩個功能結 構域構成，其中N端結構域（1-85位殘基）是一個DNA結合域，而C端結構域（86-215位 殘基）是一個典型的Rossmann摺疊，它能夠結合NADH(Wang, E.等，Mol Microbiol. 2008， V. 69(2), pp. 466-478) 〇
[0012] 雖然YdiH(Rex)蛋白本身對環境內的氧化還原狀態敏感，但是其自身發生的變化 並不能直觀的顯示出並被外界所捕獲，而藉助於螢光蛋白這一工具，我們可以很好地通過 將兩者進行融合表達，獲得一個全新的基因編碼的螢光探針，利用YdiH(Rex)蛋白感受環 境內氧化還原狀態的變化並將這一變化傳遞至螢光蛋白，通過螢光蛋白產生螢光與否以及 螢光的強弱，對環境中氧化還原狀態改變進行實時且直觀地描述。
[0013] 綜上所述，我們認為，利用包含YdiH蛋白的重組螢光融合蛋白能夠滿足在生理水 平和亞細胞水平上檢測NADH的迫切需要。
[0014] 不應認為對本文所述參考文獻的引用或討論意味著承認這些參考文獻是本發明 的現有技術。


【發明內容】

[0015] 下文以及本申請權利要求中提及具體序列信息時，各"SEQ ID No"後所列編號均 為母案：中國專利申請201110288807. 6中的序列編號。由於內容刪減，相關序列在本申請 所提受的序列表中的編號有所調整，具體對應關係如下表。
[0016]

【權利要求】
1. 一種遺傳編碼的氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸NAD+螢光探針，其內含有 (1) 對環境內NAD+敏感的多肽，和 (2) 通過光譜性質的改變對環境內NAD+進行表現的部分，該部分是螢光蛋白序列或其 衍生物。
2. 如權利要求1所述的NAD+螢光探針，所述螢光探針的胺基酸序列選自序列表中的序 列 31-40,即中國專利申請 201110288807. 6 中 SEQ ID NO :129 和 141-149 中的一種。
3. -種核酸序列，其核苷酸序列編碼權利要求1或2所述的螢光探針。
4. 一種核酸序列，所述核酸序列與權利要求3所述的核酸序列互補。
5. -種表達載體，其包含與表達控制序列操作性連接的如權利要求3所述的核酸序 列。
6. -種宿主細胞，其包含權利要求3所述的核酸序列或權利要求5所述的表達載體。
7. -種製備權利要求1或2所述螢光探針的方法，包括以下步驟： (1) 將權利要求5所述的表達載體轉移到宿主細胞中， (2) 在適合所述宿主細胞表達的條件下培養所述宿主細胞，和 (3) 由所述宿主細胞分離所述螢光探針或融合蛋白。
8. 權利要求1或2所述的螢光探針或權利要求7所述方法製備的螢光探針在檢測氧化 型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸中的應用。
9. 一種檢測試劑盒，其包含權利要求權利要求1或2所述的螢光探針或權利要求7所 述方法製備的螢光探針。
【文檔編號】C12N15/62GK104277120SQ201410499267
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2011年9月26日 優先權日:2011年9月26日
【發明者】楊弋, 趙玉政, 呼慶勳 申請人:華東理工大學