鹽芥COR15a基因啟動子及其應用的製作方法

2023-05-03 14:12:21

專利名稱：鹽芥COR15a基因啟動子及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學、基因工程技術領域，具體地說，涉及一種鹽芥CORlfe基因啟動子及其應用。
背景技術：
鹽芥(Thellungiella halophila)具有很強的抗凍能力。據報導，在4 5°C低溫條件下，鹽芥種子可以萌發，並且鹽芥可以生長發育。鹽芥的抗凍能力比擬南芥要強，表現在擬南芥在經過過冷處理之後才能夠忍受零度以下低溫，如忍受-10 -13°C的低溫，而鹽芥不僅在經過過冷處理後能夠忍受低溫，其本身就具有更強的抗凍能力。越來越多的研究表明，植物抗凍過程中發生的生理生化變化是由低溫誘導的特定基因表達而引發的，一些潛在的基因受低溫調控而表達，進而誘導許多抗凍蛋白的合成。 Iliomashow等(1990)最早從擬南芥中分離鑑定得到抗凍響應的COR基因(cold regulated gene)。C-r印eat/DRE (c-r印eat/drought responsive element)調節元件是 COR 基因啟動子序列中的關鍵順式作用元件(Yamaguchi-Siinozaki等，1994 ；Baker等，1994)。所有 COR基因啟動子序列中都有此調節元件存在。研究證明，C-repeat/DRE調節元件除了可響應低溫誘導外，還可對乾旱和高鹽等作出響應而使COR基因表達。CORlfe基因啟動子是植物體內低溫調節的信號轉導途徑及轉錄調控網絡中的重要組成部分。本發明首次克隆得到鹽芥CORlfe基因啟動子的序列，為進一步研究植物的抗凍分子機制奠定基礎。

發明內容
本發明的目的是提供鹽芥CORlfe基因啟動子及其應用。為了實現本發明目的，本發明的鹽芥CORlfe基因啟動子，其具有i)SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列，該序列中含有2個低溫應答特異性元件C-r印eat/DRE ；或ii)SEQ ID No. 1所示核苷酸序列經取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸且同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。如在不改變啟動子功能的情況下，將第12位的A缺失，將第177位的A取代為G，在第211位後增加T。本發明還提供含有上述啟動子的載體以及含有該載體的宿主細胞。本發明還提供含有上述啟動子的轉化植物細胞。本發明還提供鹽芥CORlfe基因啟動子在調控下遊基因表達中的應用，優選下遊基因為GFP基因。 本發明還提供鹽芥CORlfe基因啟動子在提高植物抗逆性中的應用。其中，所述的植物抗逆性是指植物的抗凍、抗旱和抗鹽等抗逆境脅迫的能力，特別是指植物的抗凍能力。
本發明從克隆鹽芥CORlfe基因啟動子入手，通過對鹽芥CORlfe基因啟動子結構和功能序列的分析，驗證了鹽芥CORlfe基因啟動子的低溫誘導性。從鹽芥中獲得的該低溫誘導型啟動子，為植物抗逆基因工程研究提供了新的逆境脅迫誘導型啟動子元件，也為下一步植物抗凍轉基因研究奠定基礎。


圖1為鹽芥和擬南芥CORlfe啟動子中調節元件的分布圖。其中，中間部分表示鹽芥和擬南芥CORlfe啟動子共有的調節元件；左環表示鹽芥CORlfe啟動子含有的元件；右環表示擬南芥CORlfe啟動子含有的元件。圖2為鹽芥和擬南芥的CORlfe啟動子下遊序列的比對。圖3為鹽芥CORlfe基因啟動子表達載體、缺失載體及對照載體的構建。其中， +1示轉錄起始位點(TSQ ；ATG示翻譯起始密碼子；A示ABRE ；B示TC_rich repeats ；C示 GARE-motif ；Control為以擬南芥CORlfe基因啟動子構建的表達載體作為對照；以GFP為報告基因的載體為PCAMBIA1300。圖4為不同溫度處理下洋蔥表皮細胞中不同啟動子啟動的GFP基因瞬時表達情況、其中，A、D、G是轉化了 35S啟動子的洋蔥表皮細胞分別在30°C、20°C和4°C條件下處理後，35S啟動子啟動的GFP瞬時表達情況；B、E、H是轉化了擬南芥CORlfe基因啟動子At的洋蔥表皮細胞分別在30°C、20°C和4°C條件下處理後，At啟動子啟動的GFP瞬時表達情況； C、F、I是轉化了鹽芥CORlfe基因啟動子Th的洋蔥表皮細胞分別在30°C、20°C和4°C條件下處理後，Th啟動子啟動的GFP瞬時表達情況。其中35S啟動子樣品和擬南芥CORlfe啟動子At樣品均為對照。Bar 10 μ m。圖5為4°C條件處理下洋蔥表皮細胞中缺失啟動子啟動的GFP基因瞬時表達情況。 圖中從左至右依次為轉化了 35S啟動子、鹽芥CORlfe基因啟動子Th、鹽芥CORlfe基因缺失啟動子Th2的洋蔥表皮細胞在4°C條件下處理後，3種啟動子啟動的GFP基因瞬時表達情況。其中，35S啟動子樣品為對照。BardOym。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。以下實例中未註明具體的實驗方法，均可按照常規方法進行或按照製造生產廠商的使用說明。實施例1鹽芥CORlfe基因啟動子的克隆1材料和方法1. 1 材料1.1.1 植物材料 Shandong 生態型鹽芥(Thellungiella halophila)；哥倫比亞野生型擬南芥(Arabidopsis Columbia)。1. 1. 2菌株和載體大腸桿菌菌株E. coli DH5 α、農桿菌GV3101均為市售商品； 載體pMD 18-T Vector,pMD 18-T simple Vector購自 TaKaRa公司；表達載體pCAMBIA1300 購自CAMBIA公司。1.1. 3 酶和化學試劑限制性內切酶 BamHI、HindIII、SmaI、PstI、T4 DNA Ligase 購自TaKaRa公司；DNA Marker購自廣州東盛生物公司；抗生素購自Sigma公司。1. 2 方法
1. 2. 1鹽芥CORlfe基因啟動子的克隆用TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取鹽芥基因組並進行DNA濃度及純度的檢測。登錄NCBI生物信息資料庫，檢索獲得鹽芥(Thellimgiella salsuginea) CORlfe基因的cds全長序列(518bp)。以此cds片段為依據，設計三個特異性引物 SP1 (5 『 -TCTGCAAACTCAGCCGCTTTGTTTC-3 『 )、SP2 (5 『 -CCATCTTTCAACGCCTCCTTTGTC T-3')和 SP3(5' -AGCGACAACGACGAGCTCAGTTTTC-3『)。用 TaKaRa Genome Walking Kit 進行第一次巢式PCR反應。以第一次染色體步移後測序得到的擴增序列為已知序列，設計三個特異性引物 SPl' (5' -GTCGGCCATCAAAGTTGTGGTTTAC-3『 ) ,SP2' (5' -GCCAACAAGT TGGGCTATTATCGCC-3 『)和 SP3 『 (5 『 -GGCAACTCCTCCACCTTCTCTATGA-3 『)，仍採用 iTaKafci Genome Walking Kit繼續擴增鹽芥CORlfe基因啟動子序列。1. 2. 2鹽芥CORlfe基因啟動子的生物信息學分析及同源比對用 PLANTCARE(http//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plant-care/ html/)對啟動子的順式作用元件進行預測和分析。利用DNAMAN軟體比對鹽芥和擬南芥 CORlfe基因啟動子序列。1. 2. 3鹽芥CORlfe基因啟動子及缺失啟動子的重組載體的構建為研究鹽芥CORlfe基因啟動子中的順式作用元件的功能，根據PLANTCARE對啟動子的順式作用元件的預測，將克隆出來的鹽芥CORlfe基因啟動子序列分為4個(Th、Th2、 ThUThO)不同長度的片段，並以擬南芥CORlfe基因啟動子片段為對照，和上述4個不同啟動子片段分別插入到質粒PCAMBIA1300的CaMV 35S啟動子位置，構建成由鹽芥(擬南芥) C0R15a不同長度啟動子片段啟動的GFP基因表達載體。1. 2. 4鹽芥CORlfe基因啟動子的活性分析利用北京維格拉斯質粒大量提取試劑盒進行提取並檢測。製備基因槍轉化法所需的微載體，DNA分子包埋微載體，裝彈轟擊洋蔥表皮細胞。轟擊結束後，在裝有洋蔥樣品的培養皿中加入MS液體培養基。將轉化了不同質粒載體的洋蔥樣品分別放在不同的溫度條件G°C、20°C、3(TC)下進行暗培養。暗培養24h後製片，使用蔡司(kiss)正置螢光顯微鏡及成像系統對洋蔥表皮細胞樣片進行觀察，使用Axio Vision Rel. 4. 6軟體進行照相。2 結果2. 1鹽芥CORlfe基因啟動子的克隆第一次染色體步移共擴增得到930bp長的啟動子序列，利用NCBI Blast 2 Sequences將測序結果與鹽芥C0R15a cds序列(518bp)比對後發現，測序結果的3『端的 125bp序列與cds序列5，端的125bp序列完全重合。第二次染色體步移共擴增得到55;3bp 長的啟動子序列。將兩次染色體步移的達到的結果進行拼接，最後得到1313bp長的核苷酸序列(SEQ ID NO. 1)。2. 2鹽芥CORlfe基因啟動子的生物信息學分析及同源比對2.2. 1啟動子的順式作用元件分析將已克隆得到的鹽芥CORlfe基因啟動子全長序歹丨J (1313bp)輸入至Ij PLANTCARE (http://bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/ plantcare/html/) Wkarch for CARE中對啟動子的順式作用元件進行預測和分析，預測該序列中存在大量調控元件，如核心啟動子元件TATA-box;多個啟動子和增強子區常見元件CAAT-box ；多個激素應答元件ABRE、GARE ；多種光響應元件ACE_motif、G_box、Spl-motif、MRE-motif。該序列中還存在多個脅迫應答元件，如C_r印eat/DRE、MBS、TC_rich repeats,,此外，該序列中還存在一個高水平轉錄調控因子5UTR Py-rich stretch。該序列的主要調控元件見表1。在這些調控元件中，脅迫應答元件，尤其是2個C-repeat/DRE元件在植物低溫及乾旱誘導過程中起重要作用。
表1鹽芥CORlfe基因啟動子序列中主要的調控元件
權利要求
1.鹽芥CORlfe基因啟動子，其特徵在於，其具有i)SEQID NO. 1所示的核苷酸序列；或ii)SEQID No. 1所示核苷酸序列經取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸且同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。
2.含有權利要求1所述啟動子的載體。
3.含有權利要求2所述載體的宿主細胞。
4.含有權利要求1所述啟動子的轉化植物細胞。
5.權利要求1所述的啟動子在調控下遊基因表達中的應用。
6.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於，下遊基因為GFP基因。
7.權利要求1所述的啟動子在提高植物抗逆性中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特徵在於，所述的植物抗逆性是指植物的抗凍、抗旱和抗鹽能力。
9.根據權利要求8所述的應用，其特徵在於，所述的植物抗逆性是指植物的抗凍能力。
全文摘要
本發明涉及鹽芥COR15a基因啟動子及其應用，該啟動子具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或該序列經取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸且同等功能的由其衍生的核苷酸序列。本發明特別涉及該啟動子序列中的2個低溫應答特異性元件C-repeat/DRE。本發明從克隆鹽芥COR15a基因啟動子入手，通過對鹽芥COR15a基因啟動子結構和功能序列的分析，驗證了鹽芥COR15a基因啟動子的低溫誘導性。從鹽芥中獲得的該低溫誘導型啟動子，為植物抗逆基因工程研究提供了新的逆境脅迫誘導型啟動子元件，也為下一步植物抗凍轉基因研究奠定基礎。
文檔編號C12N15/113GK102250900SQ20111017994
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月29日 優先權日2011年6月29日
發明者張根發 申請人:北京師範大學