一種新的化合物及其應用的製作方法

2023-09-13 03:57:50

專利名稱：一種新的化合物及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體地說，涉及一種新的化合物及其應用。
背景技術：
萬古黴素是由1956年印度尼西亞土壤中分離的東方擬無枝酸菌 (Amycolatopsis orientalis)發酵得到的，是臨床治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)感染的首選藥物。但隨著萬古黴 素的不斷使用，金黃色葡萄球菌對萬古黴素的敏感性有所下降，這將對臨床抗感染治療產 生嚴重威脅，因此，尋找能夠對耐藥菌株改善活力的第二代糖肽類抗生素迫在眉睫，同時， 製備可發酵生產對耐藥菌株改善活力的第二代糖肽類抗生素的重組菌株也成為一個重要 的研究課題，也具有同樣的緊迫性。

發明內容
本申請的發明人通過對萬古黴素產生菌A. orientalis HCCB10007中糖基轉移酶 基因進行的異源置換操作，獲得了一株新的東方擬無枝酸菌菌株，並在該株東方擬無枝酸 菌的發酵液中，提取到了一種新的化合物。因此，本發明的第一個目的，提供一種新的化合物。本發明的第二個目的，提供所述化合物的製備方法。本發明的第三個目的，提供所述化合物的應用。本發明的第四個目的，提供一種所述化合物的產生菌。本發明的提供的化合物，具有以下式⑴所示的結構
其中肽骨架六位胺基酸的苄羥基上糖基的四位羥基(-0H，如結構式中1所示)
為直立鍵。根據本發明的一個實施例，所述式(I)所示的化合物通過發酵菌株CGMCCNo. 3053獲得。根據本發明的一個優選實施例，所述式(I)所示的化合物的製備方法還包括對發 酵液進行分離純化的步驟，具體地，所述分離純化步驟如下以大孔弱極性樹脂對濾液進行動態吸附，以含0. 01%鹽酸的乙醇_水溶液進行梯 度洗脫，並收集乙醇水為8 2的洗脫液，然後以活性炭脫色、濃縮後進行中壓液相色譜 層析，再以含有0. 2 % NH4H2P04緩衝鹽的甲醇-水溶液梯度洗脫，收集主要洗脫液濃縮，最 後將中壓液相色譜製備得到的洗脫濃縮液用大孔弱極性樹脂吸附，用含0. 001%鹽酸的甲 醇-水溶液梯度洗脫，收集甲醇水為8 2的洗脫液，脫鹽。根據本發明，對發酵液進行分離純化前還包括對發酵液進行預處理的步驟，具體 地，所述預處理步驟如下發酵液用HC1調pH3 4，過濾除去菌絲體。本發明提供的式(I)所示的化合物具有良好的抗菌活性，因而可用於製備抗菌藥 物。本發明提供的式(I)所示的化合物的產生菌，其保藏號為CGMCC No. 3053。本發明提供了一種新的化合物及其產生菌，鑑於該化合物具有良好的抗菌活性， 因此對於新的抗菌藥物的開發具有非常重要的意義。


圖 1 是 LYV07ww01 的 MS 圖譜。圖2是LYV07ww01的屮核磁共振波譜圖。圖3是LYV07ww01的13C核磁共振波譜圖。
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圖4是LYV07ww01的Cosy核磁共振波譜圖。圖5是LYV07ww01的Noesy核磁共振波譜圖。圖6是LYV07ww01的Tocsy核磁共振波譜圖。圖7是LYV07ww01的Hsqc核磁共振波譜圖。圖8是LYV07ww01的Hmbc核磁共振波譜圖。圖9是LYV07ww01的化學結構式。本發明所獲得的工程菌已於2009年5月6日提交位於北京的中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏號為CGMCC No. 3053。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用於說明本 發明而非用於限定本發明的範圍。實施例1、菌株製備發明人通過對萬古黴素產生菌A.orientalis HCCB10007中糖基轉移酶基因進行 的異源置換操作，即從Amycolatopsis balhimyceticus NRRL B-24207中釣取其糖基轉移 酶基因並通過接合轉移的方法置換了萬古黴素的糖基轉移酶基因，從而獲得了一株新菌 株。該菌株已於2009年5月6日提交位於北京的中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏號為CGMCC No. 3053。實施例2、發酵培養將CGMCC NO. 3053接入種子培養基中，於28°C，220rpm培養40-48h。然後，在 無菌條件下，將培養好的種子液以8%的接種量轉入發酵搖瓶中，於28°C，220rpm培養 115-120h，收穫發酵液。實施例3、發酵產物的分離純化3. 1、發酵液預處理將實施例2中獲得的發酵液用HC1調pH至3 4，過濾除去菌絲體，收集濾液。3. 2、分離純化參考專利US5843437中提供的分離純化方法，分離純化發酵液，具體分離純化過 程如下以大孔弱極性樹脂HP-20對步驟3. 1中獲得的濾液進行動態吸附，以含0.01% 鹽酸的乙醇-水溶液進行梯度洗脫，收集乙醇-水溶液(8 2)洗脫液，然後以活性炭脫 色、濃縮後進行中壓液相色譜層析，再以含有0. 2% NH4H2P04緩衝鹽的甲醇-水溶液梯度洗 脫，收集主要洗脫液濃縮，最後將中壓液相色譜製備得到的洗脫濃縮液用HP-20吸附，用含 0.001%鹽酸的的甲醇-水溶液梯度洗脫，收集甲醇水為8 2的洗脫液，脫鹽，乾燥。將獲得的產物命名為LYV07ww01。實施例4、LYV07ww01結構確定將LYV07ww01進行質譜檢測，結果如圖1所示，根據圖1所示的MS圖譜，LYV07ww01 的分子量為1590。通過對LYV07ww01 —維核磁共振波譜(圖2 3)和二維核磁共振波譜(圖4 8)進行解析，確定各碳原子和氫原子信號的化學歸屬，證實其結構與Chloroeremomycin相 似，僅在四位外側糖基及六位糖基構型上略有差異。上述兩個糖殘基上四位氫原子的化學 位移分別為3. 29,3. 30ppm,皆表現為單峰，偶合常數小於4Hz，因相鄰五位氫原子為直立 鍵，則四位氫原子只能是平伏鍵，四位羥基是直立鍵。亦即LYV07w01的四位外側糖基及六 位糖基皆為萬古糖胺基，而Chloroeremomycin的兩個糖基皆為表萬古糖胺基。根據解析結果，獲得LYV07ww01的化學結構式，具體如圖9所示，其中，LYV07ww01 的肽骨架六位胺基酸的苄羥基上糖基的四位羥基(-0H，如結構式中1所示)為直立鍵。經檢索，在現有技術中未見有該化合物的報導，即LYV07ww01為一種新的化合物。實施例5、LYV07ww01抗菌活性測定參考《中華人民共和國藥典》(2005年版)中提供的方法，檢測LYV07ww01的抗菌 活性，其中，使用的菌株及LYV07w01對所述菌株的抗菌劑量如表1所示。表1、檢測用菌株及LYV07ww01的抗菌活性
#測試用菌株性質LYV07ww01 (MIC 值)1耐萬古黴素腸球菌128μ g/ml2耐萬古黴素腸球菌32 μ g/ml3腸球菌0. 5 μ g/ml4MRSA0. 5 μ g/ml5MRSA0.5 μ g/ml6MRSA0. 5 μ g/ml7MRSA1 μ g/ml8MRSA0. 5 μ g/ml9MRSA0.5 μ g/ml10MRSA0. 5 μ g/ml11MRSA0.5 μ g/ml12MRSA0. 5 μ g/ml13MRSA0.5 μ g/ml
6 根據表1的結果，本發明的提供的化合物LYV07w01對於多種臨床致病菌都具有 良好的抗菌活性。綜上所述，本發明提供的新的化合物LYV07w01對於多種臨床致病菌都具有良好 的抗菌活性，因此可用於製備抗菌藥物，具有廣闊的開發應用前景。
權利要求
一種化合物，其特徵在於，所述化合物的結構如式(I)所示其中所述化合物的肽骨架六位胺基酸的苄羥基上糖基的四位羥基為直立鍵。F2009100539069C0000011.tif
2.如權利要求1所述的化合物的製備方法，其特徵在於，所述化合物通過CGMCC No. 3053發酵獲得。
3.如權利要求2所述的製備方法，其特徵在於，所述方法還包括對發酵液進行分離純 化的步驟。
4.如權利要求3所述的製備方法，其特徵在於，所述分離純化步驟如下以大孔弱極性樹脂對濾液進行動態吸附，以含0. 01%鹽酸的乙醇-水溶液進行梯度洗 脫，並收集乙醇水為8 2的洗脫液，然後以活性炭脫色、濃縮後進行中壓液相色譜層析， 再以含有0. 2 % NH4H2PO4緩衝鹽的甲醇-水溶液梯度洗脫，收集主要洗脫液濃縮，最後將中 壓液相色譜製備得到的洗脫濃縮液用大孔弱極性樹脂吸附，用含0. 001%鹽酸的甲醇-7K 溶液梯度洗脫，收集甲醇水為8 2的洗脫液，脫鹽。
5.如權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，所述大孔弱極性樹脂為HP-20。
6.如權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，所述脫鹽步驟後還包括乾燥步驟。
7.如權利要求2所述的製備方法，其特徵在於，在對發酵液進行分離純化前還包括對 發酵液進行預處理的步驟。
8.如權利要求7所述的製備方法，其特徵在於，所述預處理步驟如下發酵液用HCl調pH3 4，過濾除去菌絲體。
9.如權利要求1所述的化合物用於製備抗菌藥物的應用。
10.一種權利要求1所述的結構式(I)的化合物的產生菌，其特徵在於所述菌株的保 藏號為 CGMCC No. 3053。
全文摘要
本發明提供了一種新的化合物及其製備方法和應用。本發明提供的化合物，其結構如式(I)所示。該化合物的肽骨架六位胺基酸的苄羥基上糖基的四位羥基為直立鍵，該化合物通過CGMCC No.3053發酵獲得。本發明提供的化合物具有良好的抗菌活性，因此對於新的抗菌藥物的開發具有非常重要的意義。
文檔編號C07K7/06GK101928331SQ20091005390
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月26日 優先權日2009年6月26日
發明者夏興, 姜衛紅, 戈梅, 朱麗, 李秋爽, 楊天, 楊志鈞, 楊晟, 殷瑜, 王天嬌, 羅敏玉, 金文翔, 阮林高, 陳代傑, 魏維, 黃鶴 申請人:上海來益生物藥物研究開發中心有限責任公司;浙江醫藥股份有限公司新昌製藥廠;中國科學院上海生命科學研究院