一種誘發水稻抗氯磺隆體細胞突變體的方法

2023-09-19 01:49:20

專利名稱：一種誘發水稻抗氯磺隆體細胞突變體的方法
技術領域：
本發明涉及一種提高水稻抗除草劑育種效率，更具體涉及一種誘發水稻抗氯磺隆體細胞突變體的方法，是一種利用化學誘變技術與組織培養相結合的方法選育水稻抗除草劑新品種途徑的植物細胞工程實用方法。
背景技術：
隨著農業除草劑迅速發展，除草劑的使用安全性問題日趨突出，已引起人們的普遍關注，從除草劑改良入手，不斷推出高效、低毒、低殘留除草劑新品種，不失為解決良好的途徑，但需要巨額投資，其研究周期長；另外水稻對氯磺隆除草劑極敏感，土壤中氯磺隆含量為0.1-0.2×10-9時就抑制水稻植株生長，使植株發僵，根呈雞爪狀；氯磺隆處理過的麥田，不宜作水稻秧田、直播田和小苗插秧田，因此嚴重製約了氯磺隆除草劑在長江中下遊麥稻輪作區的使用。

發明內容
本發明的目的在於提供一種誘變水稻抗氯磺隆體細胞突變體的方法，採用化學誘變劑誘導與氯磺隆除草劑複合組配篩選，並能有效地為應用於培育水稻抗除草劑新品種提供相關的實驗依據，避免育種盲目性，該方法操作簡便，效果好，適應廣，培育一個水稻抗除草劑新品種至少比常規育種方法提前3-4年完成。
為了實現上述目的，本發明採用以下技術措施首先採用成熟的體細胞培養技術，建立了一套最佳誘變劑濃度誘導愈傷組織與氯磺隆除草劑複合組配篩選方法。該方法利用化學誘變技術、與組織培養相結合，採用了離體誘導、繼代、篩選、分化(不含氯磺隆)、再分化(含氯磺隆)培養程序。
本發明的技術內容誘發水稻抗除草劑體細胞突變體的方法由最佳操作程序和最適宜的誘變、篩選培養基配方組成。A、配製培養基，誘導培養基NB培養基加入2mg/L二氯苯氧乙酸和20-30mg/L5-溴尿嘧啶；繼代培養基NB培養基中加入2mg/L 2，4-D和0.2mg/L6-苄基氨基嘌呤；篩選培養基NB培養基中加入2mg/L2，4-D和0.2mg/L6-BA及25-50mg/L氯磺隆；分化培養基MS培養基中加入2mg/6-BA和0.5mg/L萘乙酸；再分化培養基MS培養基中加入2mg/L6-BA和0.5mg/LNAA及50-60mg/L氯磺隆；B、培養時間誘導、繼代、篩選培養，將已消毒的成熟胚材料接於誘導培養基上，置於黑暗條件下進行誘導愈傷組織培養，並加入5-溴尿嘧啶誘變劑培養18-20天；繼代培養將誘導培養基上的愈傷組織轉入繼代培養基上培養18-20天，擴大愈傷組織抗氯磺隆細胞群體；篩選培養將繼代培養獲得的愈傷組織切割成直徑為1.5-2.0毫米，轉入篩選培養基上培養18-20天；C、分化、再分化培養時間在光照條件下愈傷組織進行再分化綠苗培養，12-14小時的光周期，分化培養，將篩選培養基上已成活的愈傷組織轉入分化培養基上培養15-16天分化綠苗塊；15-16天後進入再分化培養，將已分化的愈傷綠塊轉入再分化培養基上培養15-16天，篩選抗氯磺隆除草劑再生植株苗；D、誘導、繼代、篩選、分化培養溫度控制在26-27℃。
五種培養基操作程序及培養方法(1)誘導培養首先選取水稻健康的種子去殼，然後成熟胚置於70％乙醇中浸泡，用0.1％氯化汞溶液浸泡15-20分鐘，用無菌水衝洗4次後方能接入誘導培養基上，將接好的成熟胚置於黑暗條件下培養18-20天。(2)繼代培養誘導培養獲得的愈傷組織，再轉入愈傷繼代培養基上置於黑暗條件下培養18-20天。(3)篩選培養用繼代培養獲得的愈傷組織，用刀片切割愈傷組織直徑為1.5-2.0mm，再轉入篩選培養基上置於黑暗條件下培養18-20天。(4)分化培養用篩選培養獲得的愈傷組織，再轉入分化培養基上光照條件下分化培養15-16天。(5)再分化培養分化培養基上已分化的愈傷綠塊，再轉入分化培養基上並含氯磺隆50-60mg/L光照條件下培養15-16天。其次是誘導、繼代、篩選培養過程，是將已接種的成熟胚和已轉培的愈傷組織及愈傷篩選培養材料放在生化箱黑暗條件下進行培養；分化、再分化培養是在光照條件下進行愈傷組織分化及再分化植株苗篩選培養；培養溫度均控制在26-27℃。
本發明具有以下優點1.利用化學劑適宜濃度處理可提高愈傷組織誘發突變頻率10-100倍，而植物體細胞離體自發突變頻率極低，約為10-6-10-7。因此本方法可大大提高水稻抗除草劑細胞突變體的選擇效率。
2.採用了最佳劑量誘導愈傷組織和抗氯磺隆複合組配篩選程序，既可以在較小的空間內篩選數額巨大的抗氯磺隆除草劑細胞系群體，又可以節約大量的人力、物力資源；比常規育種程序簡便、實用、效果更佳。
3.通過體細胞培養獲得的變異的再生植株在育種中具有穩定快的優點，便於大田抗除草劑育種優良性狀的選擇。
4.適應性廣，可廣泛適合於農業科研單位從事水稻抗逆境育種研究，應用化學誘變技術與植物細胞工程技術相結合的方法創造水稻抗除草劑新的種質材料。
具體實施例方式
1.培養基的配製。誘導培養基基本培養基(NB)中加入2mg/L二氯苯氧乙酸(2，4-D)和20-30mg/L5-溴嘧啶(5-Bu)；繼代培養基(NB)中加入2mg/L2，4-D和0.2mg/L6-苄基氨基嘌(6-BA)；篩選培養基(NB)中加入2mg/L2，4-D和0.2mg/L6-BA及25-50mg/L氯磺隆；分化培養基(MS)中加入2mg/L6-BA和0.4-0.5mg/L萘乙酸(NAA)；再分化培養基(MS)中加入2mg/L6-BA和0.5mg/LNAA及50-60mg/L氯磺隆。
2.誘導、繼代、篩選培養時間已接種的成熟胚和已轉的愈傷篩選材料置於生化培養箱中，必須在黑暗下培養誘導、篩選愈傷組織，培養溫度均控制在26-27℃，否則，誘導出來的愈傷組織生長質量較差；(1)誘導培養將成熟種子去殼，用0.1％氯化汞(HgCI2)溶液浸泡15分鐘，用無菌水衝洗4次後，將已消毒的成熟胚接種在誘導培養基上並加入20-30mg/L5-溴尿嘧啶化學誘變劑培養19天誘導愈傷組織；(2)繼代培養將誘導培養獲得的愈傷組織轉入繼代培養基上培養20天，擴大愈傷組織抗氯磺隆細胞群體；(3)篩選培養將繼代培養獲得的愈傷組織轉入篩選培養基上並加入氯磺隆除草劑25-50mg/L培養18天，篩選抗氯磺隆細胞系。
3.分化、再分化培養必須在光照下培養，才能誘導出再生植株，光照強度為2000Lx，12小時光周期；否則分化出來的綠苗為黃苗或白化苗。(1)分化培養將篩選培養19-20天後已成活的愈傷組織轉入分化培養基上，置於光照培養箱中培養15天，讓其分化綠苗；(2)再分化培養將分化培養15天後已分化的愈傷綠塊轉入再分化培養基上加入氯磺隆除草劑50-60mg/L，篩選抗氯磺隆再生苗培養15天以上。培養溫度控制在26-27℃。
NB培養基N6大量元素、鐵鹽，B5微量元素、有機成分；N6大量元素為硝酸鉀、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣；鐵鹽為硫酸亞鐵、乙二胺四乙酸二鈉；B5微量元素為硫酸錳、硼酸、硫酸鋅、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈷、碘化鉀；有機成份鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、肌-肌醇(植物細胞工程實驗技術、科學出版社、1995年、P403-408)。
MS培養基大量元素、鐵鹽、微量元素、有機成分；大量元素為硝酸銨、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣；鐵鹽為硫酸亞鐵、乙二胺四乙酸二鈉；微量元素為硫酸錳、硫酸鋅、硼酸、碘化鉀、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈷；有機成分為甘氨酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、肌-肌醇(植物細胞工程實驗技術、科學出版社、1995年、P403-408)。
權利要求
1.一種誘發水稻抗氯磺隆體細胞突變體的方法，它包括下列步驟A、配製培養基，誘導培養基基本培養基中加入2mg/L二氯苯氧乙酸和20-30mg/L5-溴尿嘧啶；繼代培養基培養基中加入2mg/L2，4-D和0.2mg/L6-苄基氨基嘌呤；篩選培養基培養基中加入2mg/L2，4-D和0.2mg/L6-BA及25-50mg/L氯磺隆；分化培養基培養基中加入2mg/6-BA和0.5mg/L萘乙酸；再分化培養基培養基中加入2mg/L6-BA和0.5mg/LNAA及50-60mg/L氯磺隆；B、培養時間誘導、繼代、篩選培養，將已消毒的成熟胚材料接於誘導培養基上，置於黑暗條件下進行誘導愈傷組織培養，並加入5-溴尿嘧啶誘變劑培養18-20天；繼代培養將誘導培養基上的愈傷組織轉入繼代培養基上培養18-20天，擴大愈傷組織抗氯磺隆細胞群體；篩選培養將繼代培養獲得的愈傷組織切割成直徑為1.5-2.0毫米，轉入篩選培養基上培養18-20天；C、分化、再分化培養時間在光照條件下愈傷組織進行再分化綠苗培養，12-14小時的光周期，分化培養，將篩選培養基上已成活的愈傷組織轉入分化培養基上培養15-16天分化綠塊；15-16天後進入再分化培養，將已分化的愈傷綠塊轉入再分化培養基上培養15-16天，篩選抗氯磺隆除草劑再生植株苗；D、誘導、繼代、篩選、分化培養溫度控制在26-27℃。
全文摘要
本發明公開了一種誘發水稻抗除草劑體細胞突變體的方法。它由誘導培養、繼代培養、篩選培養、分化培養、再分化培養組成。操作者先將健康成熟種子去殼，再在無菌條件下，將成熟胚置於乙醇中浸泡，用氯化汞溶液浸泡，用無菌水衝洗，將已消毒的成熟胚接種在誘導培養基上加入5－溴尿嘧啶誘變劑黑暗培養；誘導培養的愈傷組織轉入繼代培養基上黑暗培養；愈傷組織再轉入篩選培養基上加入氯磺隆黑暗培養；篩選培養後，將已成活的愈傷組織轉入分化培養基上光照培養，再將已分化的愈傷綠塊轉入再分化培養基上並加入氯磺隆除草劑，在光照下篩選培養。本發明操作簡便，效果好，適應性廣，培育一個抗除草劑新品種比常規育種方法提前3－4年完成。
文檔編號A01H3/00GK1582639SQ20041001321
公開日2005年2月23日 申請日期2004年5月26日 優先權日2004年5月26日
發明者馮雙華, 肖國櫻 申請人:中國科學院亞熱帶農業生態研究所