源於板慄堅果的微生物及其應用和微生物菌劑的製備方法
2023-09-14 04:48:25 2
源於板慄堅果的微生物及其應用和微生物菌劑的製備方法
【專利摘要】本發明涉及微生物領域，具體而言，涉及源於板慄堅果的微生物及其應用和微生物菌劑的製備方法。其中，源於板慄堅果的微生物，2013年11月12日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC?M2013568，保藏名稱為解澱粉芽孢桿菌亞種CMN1308。該微生物為板慄的一種內生菌，其在抑制由慄疫菌、腐皮鐮刀菌、黑葡萄穗黴、擴展青黴和炭疽菌中的至少一種真菌引起的板慄實腐病的防治，以及作為飼料添加劑，促進動物生長提高免疫能力等方面具有良好的作用。與現有技術中用化學農藥防治實腐病相比，不會造成對人類健康的危害，以及對環境的汙染等問題，具有重要的環保意義。
【專利說明】源於板慄堅果的微生物及其應用和微生物菌劑的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物領域，具體而言，涉及源於板慄堅果的微生物及其應用和微生物菌劑的製備方法。
【背景技術】
[0002]板慄(Castanea millissima.BL.)屬山毛櫸科慄屬植物,素有「千果之王」的美稱，是我國的重要經濟樹種之一。板慄含水率高，貯藏和運輸過程中很容易發生變色、變味甚至腐爛，學術上稱為「實腐病」。實腐病的發病率很高，一般可達20%~30%，嚴重者達70%，造成巨大的經濟損失，嚴重製約了板慄產業的發展。
[0003]相關技術中，主要使用化學農藥來防治板慄的實腐病。
[0004]但是化學農藥在使用過程中，存在對人類健康的危害以及對環境的汙染等問題。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在於提供一種源於板慄堅果的微生物及其應用和微生物菌劑的製備方法，以解決上述的問題。
[0006]在本發明的實施例中第一方面提供了一種源於板慄堅果的微生物，2013年11月12日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC M2013568，保藏名稱為解澱粉芽孢桿菌亞種CMNl308。
[0007]在本發明的實施例中第二方面提供了上述微生物在抑制引起板慄實腐病的微生物中的應用。
[0008]在本發明的實施例中第三方面提供了上述微生物作為促進家畜生長，提高免疫力的飼料添加劑的應用。
[0009]在本發明的實施例中第四方面提供了利用上述微生物製備發酵液的方法。
[0010]在本發明的實施例中第五方面提供了上述微生物的固態菌劑。
[0011]本發明實施例提供的源於板慄堅果的微生物及其應用和微生物菌劑的製備方法，其通過篩選獲得的微生物:2013年11月12日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC M2013568，保藏名稱為解澱粉芽孢桿菌亞種CMN1308，為板慄的一種內生菌，其在抑制由慄疫菌、腐皮鐮刀菌、黑葡萄穗黴、擴展青黴和炭疽菌中的至少一種真菌引起的板慄實腐病的防治，以及作為飼料添加劑，促進動物生長提高免疫能力等方面具有良好的作用。與現有技術中用化學農藥防治實腐病相比，本發明實施例提供的微生物在防治實腐病時，不會造成對人類健康的危害，以及對環境的汙染等問題，具有重要的環保意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1示出了本發明實施例提供的解澱粉芽孢桿菌革蘭氏染色的顯微觀察結果；
[0013]圖2示出了本發明實施例提供的解澱粉芽孢桿菌與相關種的16S rDNA序列系統發育分析示意圖；[0014]圖3示出了本發明實施例提供的解澱粉芽孢桿菌對引起實腐病的真菌的抑菌效果示意圖。
【具體實施方式】
[0015]下面通過具體的實施例並結合附圖對本發明做進一步的詳細描述。
[0016]板慄實腐病主要是由一些致病真菌引起的，其中常見的有:匍枝根黴(Rhizopusstolonifer)、腐皮鍵刀菌(Fusarium solani)、黑葡萄穗黴(Stachybotrys chartarum)、慄疫菌(Cryphonectria parasitica)、可可毛色二抱菌(Lasiodiplodia theobromae)、擴展青黴(Penicillium expansum)、黑麴黴(Aspergillus niger)、膠胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)、淺黃隱球酵母(Cryptococcus luteolus)、白假絲酵母(Candida albicans)等。
[0017]本發明實施例為了解決在防治板慄實腐病中儘量少用化學農藥，以避免化學農藥的使用帶來的對人類的危害以及對環境的汙染等問題，從板慄中篩選內生菌。內生菌(endophyte)是指在其生活史的一定階段或全部階段生活於健康植物的各種組織和器官內部的微生物。內生菌生活在植物組織中，長期以來與宿主形成密切關係，兩者之間互相進行物質、能量及遺傳信息交流，在長期協同進化過程中，彼此構成了穩定的生態關係。部分內生菌能夠抑制引起實腐病的致病真菌，提高宿主植物的抗病能力，其提高植物抗病性的機制主要包括:(I)產生拮抗微生物的低分子量的化學物質，如:植物保護素、多聚物、木質素、富含經葡氨酸的糖蛋白；(2)誘導一些氧化酶類和水解酶類，如幾丁質酶、葡聚糖酶和過氧化物酶；(3)誘導病程相關蛋白的產生。
[0018]因此，經過分離篩選獲得能夠抑制引起實腐病的致病真菌的內生菌，對防治板慄實腐病、減少化學農藥的使用具有重要的意義。
[0019]本發明實施例獲得了·一種源於板慄堅果的微生物，並將該微生物(以下簡稱「本微生物」)進行保藏，保藏號為CCTCC M2013568 ;保藏名稱為:解澱粉芽孢桿菌亞種CMN1308(Bacillus amy1liquefaciens subsp.Plantarum CMN1308);保藏單位為:中國典型培養物保藏中心；保藏日期為:2013年11月12日；保藏地址為:中國，武漢，武漢大學。
[0020]本發明實施例優選採用一級母液、二級母液和發酵的三級發酵方式製備本微生物的發酵液，通過優化二級母液和發酵培養基配方和培養條件，使得到的發酵液的活菌含量達到了 10~30X 108cfu/mL。其活菌量高，在用於防治板慄實腐病和作為飼料添加劑時的活性更高，效果更好。
[0021]其中,優選二級母液的培養基配方為:鹿糖25g/L、葡萄糖25g/L、酵母粉15g/L、蛋白粉10g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、硫酸錳0.05g/L ;優選的二級母液的培養條件為:將一級母液接入二級母液的培養基中，其中，接種量為I~5% (V/V)，培養條件為:通氣比1:1，攪拌轉速為150~200r/min，培養溫度為35~37°C，罐壓為0.01MPa,培養時間為20~22h ;製得所述微生物的二級母液。
[0022]優選發酵培養基配方為:澱粉50g/L、葡萄糖50g/L、酵母粉20g/L、蛋白粉10g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、硫酸錳0.05g/L ;優化的培養條件為:將二級母液接入發酵培養基中，接種量為I~5% (V/V)，培養條件為:通氣比為1:1，攪拌轉速為150~200r/min，培養溫度35~37°C，罐壓0.01MPa，培養時間為46~48h，製得所述微生物的發酵液。[0023]此外，本發明實施例提供的本微生物的發酵液的製備方法，優選在製備一級母液之前，對保藏的本微生物進行活化的步驟。經過活化的微生物，與保藏中的微生物相比，具有更高的代謝活性，用其製備一級母液時，其活性更高，在製備一級母液的培養基中適應能力更強，繁殖速度更快。有利於一級母液的製備。
[0024]本發明實施例提供的本微生物的固態菌劑，優選採用玉米澱粉為載體。如本領域技術人員可以想到的，製備固態菌劑用的可接受的載體有多種，如玉米澱粉，馬鈴薯澱粉，土豆澱粉等；其中，玉米澱粉來源豐富且價格低廉，有利於降低固體菌劑的成本。
[0025]本發明實施例中，微生物的幹菌粉的製備方法優選為:將微生物的菌懸液離心收集菌泥，再冷凍乾燥製成幹菌粉。其中，通過冷凍乾燥的方法製備幹菌粉，由於通過升華的方法，使細胞中的水分直接去除，不會破壞細胞中的蛋白質和核酸等物質，因此可以避免微生物細胞的死亡，導致幹菌粉中的活菌數的下降，進而降低固態菌劑的微生物活性。
[0026]本發明實施例中，本微生物的菌懸液的培養條件為:在LB液體培養基中，37°C培養16~20小時，培養基成本低，原料豐富易得，培養溫度適中，且培養時間短，而且，得到的菌懸液的活菌數高，達到了 108cfu/g，則用其製備成固態菌劑時，固態菌劑中的活菌數能夠達到 108cfu/go
[0027]本發明實施例中，優選將活菌數為108cfu/g微生物的幹菌粉和載體按重量比為I: 4進行混合，得到微生物的固態菌劑。
[0028]由於載體和幹菌粉的重量比例適當，且幹菌粉中的活菌數高，則將上述固態菌劑用於防治板慄實腐病和作為飼料添加劑時的活性更高，效果更好。
[0029]如本領域技術人員可以想到的，本發明實施例中，本微生物作為家畜飼料添加劑的應用中，家畜包括雞、鴨、鵝、豬等。
[0030]實施例一，本微生物的篩選
[0031]本發明實施例提供的微生物通過以下方法進行篩選獲得:
[0032]從湖北省黃R市羅田縣勝利鎮玫瑰紅板慄園中採集板慄堅果，進行常溫氣調貯藏。取未發生明顯板慄實腐病的堅果種皮和內部種仁，按照本領域的常用方法進行內生細菌的分離和培養，得到5種內生細菌，分別編號為CMN1301，CMNl302，CMNl304，CMNl305,CMN1308。分別以引起板慄貯藏期發生實腐病的致病菌:慄疫菌、腐皮鐮刀菌、黑葡萄穗黴、擴展青黴、炭疽菌作為指示菌株，按照本領域的常用方法，採取平板對峙培養法和抑菌圈法篩選抑菌能力強的內生細菌。篩選結果如表1所示。
[0033]表1.板慄慄仁內生菌株對病原菌的抑制效果
[0034]
【權利要求】
1.一種源於板慄堅果的微生物，其特徵在於，2013年11月12日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC M2013568，保藏名稱為解澱粉芽孢桿菌亞種CMN1308。
2.權利要求1所述的微生物在抑制引起板慄實腐病的微生物中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於，所述引起板慄實腐病的微生物包括慄疫菌、腐皮鐮刀菌、黑葡萄穗黴、擴展青黴和炭疽菌中的至少一種。
4.權利要求1所述的微生物作為促進家畜生長，提高免疫力的飼料添加劑的應用。
5.利用權利要求1所述的微生物製備發酵液的方法，其特徵在於，包括: 製備一級母液:挑取所述微生物接種於液體培養基中，在37°C，100~120r/min的條件下培養22~24h，製得所述微生物的一級母液； 製備二級母液:將上述一級母液接入二級母液的培養基中，其中，接種量為I~5% (V/V)，培養條件為:通氣比1:1，攪拌轉速為150~200r/min，培養溫度為35~37°C，罐壓為0.01MPa，培養時間為20~22h ;製得所述微生物的二級母液； 製備發酵液:將上述二級母液接入發酵培養基中，接種量為I~5%(V/V)，培養條件為:通氣比為1:1，攪拌轉速為150~200r/min，培養溫度35~37°C，罐壓0.01MPa，培養時間為46~48h，製得所述微生物的發酵液。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於， 所述一級母液的培養基為LB液體培養基； 和/或` 所述二級母液的培養基配方為:鹿糖25g/L、葡萄糖25g/L、酵母粉15g/L、蛋白粉IOg/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、硫酸錳0.05g/L ； 和/或 所述發酵培養基配方為:澱粉50g/L、葡萄糖50g/L、酵母粉20g/L、蛋白粉10g/L、磷酸二氫鉀 0.5g/L、硫酸錳 0.05g/L。
7.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，在所述製備一級母液的步驟之前還包括活化的步驟。
8.權利要求1所述的微生物的固態菌劑，其特徵在於，包括所述微生物的幹菌粉和固態菌劑中可接受的載體，所述微生物的幹菌粉和所述載體的重量比為1:4 ;所述微生物的幹菌粉的活菌數為108cfu/g。
9.根據權利要求8所述的微生物的固態菌劑，其特徵在於，所述載體為玉米澱粉。
10.根據權利要求8所述的微生物的固態菌劑，其特徵在於，所述微生物的幹菌粉的製備方法為:將所述微生物的菌懸液離心收集菌泥，冷凍乾燥製成幹菌粉。
【文檔編號】C12N1/20GK103667142SQ201310672539
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月11日 優先權日:2013年12月11日
【發明者】李琳玲, 程水源, 程華, 華娟, 袁紅慧, 張雪花 申請人:黃岡師範學院