一種比例可調、同步釋放兩種原型藥物的兩種小分子前藥的自組裝納米粒及製備方法與應用

2023-10-09 08:15:01 1

1.本發明屬於藥物傳遞技術領域，具體涉及一種比例可調、同步釋放兩種原型藥物的兩種小分子前藥的自組裝納米粒及製備方法與應用。


背景技術：

2.化療是臨床上治療中晚期惡性腫瘤的主要手段之一，腫瘤耐藥性是導致腫瘤化療失敗的主要原因。我國中藥材資源豐富，隨著天然藥物高通量篩選技術的快速發展，越來越多的中藥成分被發現具有增強腫瘤細胞敏感性及逆轉腫瘤細胞耐藥性的雙重作用，中藥活性成分聯合化療在體外和動物實驗研究中表現出良好效果[guow.,tanh.-y.,chenf.,etal.cancers,2020,12(2):404；石金鳳，羅堯堯，李佳鑫，等.中國中藥雜誌，2019，44(16)：3391-3398]。中藥活性成分具有高效、低毒、作用廣和靶點多等優勢，然而聯合化療應用臨床時中藥活性成分和化療藥物均存在生物利用度低、靶向性差和腫瘤遞送率低等問題，藥物間突破生理屏障能力的差異性又會導致腫瘤組織的差異化分布，使聯用藥物在腫瘤組織中分布比例難以控制，以上問題綜合導致聯用效果降低，甚至疊加了對正常組織的毒副反應[lud.,lut.,yarlan.s.,etal.reviewsonrecentclinicaltrials,2017,12(3):202-211]
[0003]
聯合給藥的傳遞系統中主要分為3種方式：
①
一種載體同時包載所有藥物；
②
不同藥物採用同種或者不同載體分開包載；
③
其中一種藥物經包載後與其他游離藥物聯合給藥；其中第1種同時共載方式更加有利於精準控制聯用藥物到達腫瘤組織中的最佳藥物比例。過去常採用納米製劑來共載聯用藥物，但常見納米製劑，如脂質體、聚合物膠束或納米粒、無機納米粒等，對不同理化性質的中藥成分和化療藥物的包封率和載藥量差異性較大，釋放行為和規律也不一致，疏水性成分一般易被包載但釋放慢，親水性成分一般難載且釋放快，因此不適合共載理化性質差異性較大的中藥活性成分和化療藥物[guoj.,yuz.,dasm.,etal.acsnano,2020,14(4):5075-5089]。
[0004]
小分子前藥自組裝納米粒是指小分子前體藥物在沒有其它輔料的幫助下能在水中自組裝形成納米粒。相比於載體依賴性傳遞系統，小分子前藥自組裝傳遞系統具有多種優勢：
①
極高的載藥量和包封率；
②
無載體誘導的生物毒性和免疫原性；
③
不同理化性質藥物的包封率相同，載藥比例易調控；
④
聯用藥物的釋放速率和釋藥量比例可控。由於腫瘤存在特殊微環境如還原環境、酸性環境等[luoc.,sunj.,liud.,etal.nanoletters,2016,16(9):5401-5408]，因此設計連接兩種藥物之間的中間體含有對腫瘤微環境敏感性的化學鍵(如雙硫鍵)，使小分子前藥在血液循環時保持穩定，而在腫瘤微環境中其化學連接鍵自動斷裂同時以相同比例釋放兩種藥物，可在腫瘤微環境下達到速率相同、釋藥量比例可控的精準釋放效果。
[0005]
目前應用於聯用藥物的載體無法同時滿足以下三個條件：
①
兩種藥物的載藥效率均保持較高水平且相近；
②
同時具備腫瘤環境感應性釋放特點；
③
控制兩種原型藥物以最
佳比例同時釋放。


技術實現要素：

[0006]
針對現有技術的不足，本發明提供了一種比例可調、同步釋放兩種原型藥物的兩種小分子前藥自組裝納米粒及製備方法與應用，該納米粒粒徑範圍在50-250 nm，具有穀胱甘肽感應性釋放特性，具有同步同比例釋放特性，可應用於共載協同作用於腫瘤的兩種藥物，尤其適合用於負載化學性質差異大的組分。
[0007]
為解決現有技術問題，本發明採取的技術方案為：
[0008]
一種比例可調、同步釋放兩種原型藥物的兩種小分子前藥的自組裝納米粒，通過二硫醇二羥基乙酸作為連接劑，將兩種藥物分別和小分子a形成兩種小分子前體藥物，通過納米沉澱法將兩種小分子前體藥物以任意比例形成自組裝納米粒；所述自組裝納米粒可同步、同比例釋放兩種原型藥物。
[0009]
作為改進的是所述的小分子a為亞油酸、油酸、維生素e、或亞麻酸；所述兩種原型藥物為可協同作用於同種疾病的藥物。
[0010]
進一步改進的是，所述原型藥物為蟾毒靈和紫杉醇。
[0011]
上述比例可調、同步釋放兩種小分子前藥的自組裝納米粒的組裝方法，包括下列步驟：
[0012]
步驟1，首先合成亞油酸乙二醇酯(la-ch
2-ch
2-oh)，再與二硫醇二羥基乙酸反應，製備得到亞油酸乙二醇二硫醇二羥基乙酸(la-ss-cooh)；最後分別與蟾毒靈和紫杉醇通過酯化反應合成得到亞油酸-乙二醇-二硫醇二羥基乙酸
‑ꢀ
蟾毒靈前藥(bfl-ss-la)和亞油酸-乙二醇-二硫醇二羥基乙酸-紫杉醇前藥 (ptx-ss-la)；
[0013]
步驟2，將亞油酸-乙二醇-二硫醇二羥基乙酸-蟾毒靈前藥和亞油酸-乙二醇
‑ꢀ
二硫醇二羥基乙酸-紫杉醇前藥按照任意比例混合，得到前藥總濃度為10 mg/ml～40mg/ml，，在攪拌條件下，慢慢滴加入到雙蒸水中，旋幹除去乙醇，自組裝得到兩種小分子前藥自組裝納米粒。
[0014]
作為改進的是，步驟1中合成亞油酸乙二醇酯的步驟為：將亞油酸和無水乙二醇按照摩爾比為1/2～2/1混合，加入無水二氯甲烷溶解，加入二環己基碳二亞胺和4-二甲氨基吡啶，所述二環己基碳二亞胺與亞油酸的摩爾比為1～1.5:1，所述4-二甲氨基吡啶與亞油酸酸的摩爾比為0.1～1:1，在密封條件下，連續攪拌反應2～14小時，採用矽膠柱純化，用體積比為石油醚︰乙酸乙酯︰乙酸＝10︰1 ︰1，收集目標產物亞油酸乙二醇酯(la-ch
2-ch
2-oh)。
[0015]
作為改進的是，步驟1中亞油酸乙二醇二硫醇二羥基乙酸的製備方法如下：稱稱取二硫醇二羥基乙酸再加乙酸酐，在30℃的密封條件下，連續攪拌反應2-4 小時，反應完成後，在反應液中分三次加入適量甲苯，利用旋轉蒸發儀加壓旋幹甲苯和乙酸酐，加入無水二氯甲烷溶解油狀液體，加入亞油酸乙二醇酯和dmap，所述亞油酸乙二醇酯與二硫醇二羥基乙酸的摩爾比為1:4～1:10，二甲氨基吡啶與二硫醇二羥基乙酸的摩爾比為0.1～1:1，連續攪拌反應2-4小時；採用矽膠柱純化，用正己烷︰乙酸乙酯︰乙酸體積比為10︰1︰1洗脫，收集目標產物亞油酸乙二醇二硫醇二羥基乙酸(la-ss-cooh)。
[0016]
作為改進的是，步驟1中亞油酸-乙二醇-二硫醇二羥基乙酸-蟾毒靈前藥或亞油酸-乙二醇-二硫醇二羥基乙酸-紫杉醇前藥的製備方法如下：稱取亞油酸乙二醇二硫醇二
羥基乙酸和蟾毒靈或者紫杉醇，加入無水二氯甲烷溶解後，再加入 dcc和dmap，所述亞油酸乙二醇二硫醇二羥基乙酸、蟾毒靈或者紫杉醇、dcc 和dmap的摩爾比為1︰0.8～1.2︰1～1.5︰0.1～1，常溫下連續攪拌反應2-24 小時，採用矽膠柱純化，用石油醚︰乙酸乙酯體積比為1︰4洗脫，收集目標產物亞油酸-乙二醇-二硫醇二羥基乙酸-蟾毒靈前藥(bfl-ss-la)或者亞油酸-乙二醇-二硫醇二羥基乙酸紫杉醇前藥(ptx-ss-la)。
[0017]
作為改進的是，步驟2中有機溶劑為無水乙醇、dmso、乙腈、丙酮中的一種或者多種混合；所述亞油酸-乙二醇-二硫醇二羥基乙酸-蟾毒靈前藥 (bfl-ss-la)和亞油酸-乙二醇-二硫醇二羥基乙酸-紫杉醇前藥(ptx-ss-la) 的摩爾比為1:1。
[0018]
作為改進的是，步驟2中混合時，還加入peg化輔料。
[0019]
其中，步驟2中所述的peg化輔料為二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇 (dspe2k)、維生素e聚乙二醇琥珀酸酯(ve-tpgs)、或亞油酸-聚乙二醇 (la-peg2k)
[0020]
上述兩種小分子前藥自組裝納米粒的粒徑範圍為50nm-250nm，zeta電位為-30—-40mv，透射電鏡觀察納米粒形態呈規則球形，分散均勻；體外釋放考察顯示出穀胱甘肽感應性釋放特性，具有同步同比例釋放特性。
[0021]
上述自組裝納米粒增強藥物在協同抗腫瘤上的應用。
[0022]
有益效果
[0023]
與現有技術相比，本發明一種比例可調、同步釋放的兩種小分子前藥自組裝納米粒及製備方法與應用，具有如下優勢：
[0024]
1、本發明自組裝納米粒具有穀胱甘肽感應性釋放特性，具備同步釋放兩種藥物的效果，當組合蟾毒靈前藥和紫杉醇前藥時，可顯著提高蟾毒靈和紫杉醇的協同作用，可開發應用於臨床治療；
[0025]
2、一種比例可調、同步釋放的蟾毒靈/紫杉醇雙前藥自組裝納米粒的表徵。動態光散射法測定納米粒的粒徑範圍為50nm-250nm之間，zeta電位為-30
‑ꢀ‑
40mv左右，透射電鏡觀察納米粒形態呈規則球形，分散性良好；
[0026]
3、自組裝納米粒的體外釋放特性研究，該納米粒在pbs(ph＝7.4)介質中兩種藥物同比例釋放，降解速率隨穀胱甘肽濃度的升高而提高，具有一定的gsh 感應性。
附圖說明
[0027]
圖1為亞油酸-乙二醇-二硫醇二羥基乙酸-蟾毒靈前藥(bfl-ss-la)的1h-nmr圖譜；
[0028]
圖2為亞油酸-乙二醇-二硫醇二羥基乙酸紫杉醇前藥(ptx-ss-la)的1h-nmr圖譜
[0029]
圖3為不同比例蟾毒靈/紫杉醇雙前藥納米粒的透射電鏡圖；
[0030]
圖4為體外釋放實驗：蟾毒靈/紫杉醇雙前藥納米粒(兩種前藥比例為1：1) 在含gsh的兩種介質(1mm和0μm gsh)中的bfl和ptx累計釋放率。
具體實施方式
[0031]
以下所列實施例有助於本領域技術人員更好地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
[0032]
實施例1.亞油酸-蟾毒靈前體藥物的製備
[0033]
稱取4.28mmol的亞油酸1.2g、32.3mmol的無水乙二醇2g、5.24mmol的 dcc 1.08g和1.11mmol的dmap 0.13g，再加入50ml的無水二氯甲烷，在密封條件下，連續攪拌反應24小時。經過矽膠純化得到亞油酸乙二醇酯 (la-ch
2-ch
2-oh)。
[0034]
稱取4.40mmol的二硫醇二羥基乙酸，再加入10ml的乙酸酐，在30℃的密封條件下連續攪拌反應2小時。加入適量甲苯旋蒸除去乙酸酐，得到油狀液體，加入10ml無水二氯甲烷溶解油狀液體，加入1.23mmol的la-ch
2-ch
2-oh 0.4 g和適量dmap，室溫密封條件下連續攪拌反應2小時。經過矽膠柱純化得產物 la-ss-cooh。
[0035]
稱取0.123mmol的la-ss-cooh和0.112mmol的bfl(購於寶雞市辰光生物科技有限公司)在圓底燒瓶中，再加入6ml的無水二氯甲烷溶解後，依次加入0.24mmol的dcc 48mg和0.26mmol的dmap 30mg，室溫密封條件下，連續攪拌反應2小時。經矽膠柱純化產物bfl-ss-la，收集目標產物後放冰箱冷凍保存。
[0036]
上述目標產物採用質譜和1h-nmr進行結構確證，1h-nmr如圖1所示。解析結果如下esi-ms(-)：m/z：901.4563[m+hcoo-]。1h-nmr(400mhz,cdcl3)：δh(400mhz,cdcl3)7.85(1h,dd,j＝9.7,2.6hz,h-22),7.25(1h,d,j＝1.7hz, h＝21),6.26(1h,d,j＝9.8hz,h-23),5.45-5.26(4h,m),5.15(1h,s,h-3),4.33(4h, d,j＝6.4hz,-och2ch2o-),3.61(2h,s,-ss-ch2co-bfl),3.59(2h,s,
ꢀ‑
ss-ch2co-la),0.96(3h,s,h-19),0.89(3h,t,la-ch3),0.71(3h,s,h-18).
[0037]
實施例2.亞油酸-紫杉醇前體藥物的製備
[0038]
稱取實施例1中的la-ss-cooh 0.123mmol和ptx(購於成都曼思特生物科技有限公司)0.112mmol，加入6ml的無水二氯甲烷溶解後，依次加入0.24 mmol的dcc和0.26mmol的dmap，室溫密封條件下，連續攪拌反應2小時。經矽膠柱純化產物ptx-ss-la，收集目標產物後放冰箱冷凍保存。
[0039]
上述目標產物採用質譜和1h-nmr進行結構確證，1h-nmr如圖2所示。解析結果如下esi-ms(+)：m/z：1346.5[m+na
+
]。1h-nmr(400mhz,cdcl3)：δh(400mhz,cdcl3)8.14(2h,d,j＝7.2hz),7.77(2h,d,8.8hz),7.61(1h,m),7.52 (3h,m),6.30(1h,s,10-h),6.25(1h,m,13-h),6.01(1h,dd,j＝9.2,3.4hz，3
』‑
h), 5.69(1h,d,j＝7.1hz，2-h),5.52(1h,d,j＝3.5hz,2
』‑
h),5.46
–
5.27(4h,m,
ꢀ‑
ch＝ch-),4.97(1h,d,j＝9.6hz,5-h),4.44(1h,q,7-h),4.31(1h,d,j＝8.8hz, 20α-h),4.27(4h,d,j＝6.4hz,-och2ch2o-),4.21(1h,d,j＝8.4hz,20β-h)，3.81 (1h,d,j＝7.0,3-h),3.64(2h,s,-ss-ch2co-ptx),3.49(2h,s,-ss-ch2co-la), 2.78(2h,t,-ch＝ch-ch
2-ch＝ch-),2.56(1h,m,6α-h)2.45(3h,s,4-coch3), 2.30(2h,t,-ch2co-),2.22(3h,s,10-coch3),2.05(4h,m,
ꢀ‑
ch2ch＝ch-ch2-ch＝ch-ch
2-),1.94(3h,m),1.68(3h,s,19-h),1.14(3h,s, 16-h),0.89(3h,t,-ch3).
[0040]
實施例3.不同比例的蟾毒靈/紫杉醇雙前藥自組裝納米粒的製備
[0041]
配製總濃度為20mg/ml的實施例2得到的bfl-ss-la和ptx-ss-la(摩爾比分別為10:1，2:1，1:1，1:2，1:10)無水乙醇溶液。在攪拌條件下，移液槍吸取400μl的上述無水乙醇溶液平穩緩緩滴加到4ml的雙蒸水中。旋轉蒸發除去乙醇，從而得不同比例的蟾毒靈/紫杉醇雙前藥自組裝納米粒。
[0042]
實施例4.不同比例的蟾毒靈/紫杉醇雙前藥自組裝納米粒的表徵
[0043]
①
採用納米粒度儀(馬爾文粒徑與zeta電位分析儀)利用動態光散射法原理測量
納米粒的粒徑與zeta電位。步驟流程：首先，將製備的bfl-ss-la-nps 用超純水稀釋至適宜濃度(0.2mg/ml)，放入納米粒度儀測量光強分布圖，測定結果如表1所示。
[0044]
表1：不同比例的蟾毒靈/紫杉醇雙前藥自組裝納米粒的粒徑大小、分散係數和電位值
[0045][0046]
②
採用透射電鏡儀觀察納米粒的大小和表面。步驟：在銅網上，滴加適量稀釋後的納米粒(0.1mg/ml)，紅外乾燥後，滴加一滴磷鎢酸負染液1分鐘，濾紙吸乾負染液。最後，待靜置乾燥後，將銅網放置在透射電鏡下仔細觀察其外觀形態並拍照，結果見圖4，所有納米粒形態規整，呈球形，分散均勻。
[0047]
實施例5.體外釋放
[0048]
取1ml實施例3中得到的蟾毒靈/紫杉醇雙前藥自組裝納米粒(摩爾比例為 1:1)樣品(濃度為1mg/ml)將其放入提前準備好的透析袋(型號為mw＝3000) 中，接下來放至體積為20ml的pbs(ph＝7.4)內，其中pbs含有gsh的濃度分別為(0μm、1mm)。完成上述操作後，置於水浴(37℃)中，以100rpm的速度進行震蕩，最後選擇如下：0.5h、1h、3h、6h、12h、24h這6個釋放時間點，取用1ml介質釋放，除上述操作外，還需補加1ml的新配介質。通過液相色譜儀進行bfl的含量測定，並根據得到的數據算出其對應的釋放率。
[0049]
結果如圖4所示，在gsh低濃度時(0μm)的釋放率明顯低於高濃度(1mm) 時，且蟾毒靈和紫杉醇的釋放行為相似，具有同步釋放特性。