高活力華根黴脂肪酶突變體的製作方法

2023-12-10 02:32:51 4

專利名稱：高活力華根黴脂肪酶突變體的製作方法
技術領域：
本發明屬於酶的基因工程技術領域，具體地說涉及酶活力提高的華根黴脂肪酶突變體。
背景技術：
脂肪酶(EC 3. I. I. 3)不僅能催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合成、轉酯化、 酸解等反應，被廣泛地應用於化學，食品，製藥和洗滌劑或生物能源工業中。微生物是脂肪酶的一個重要來源，而根黴又是微生物脂肪酶的重要生產菌。如今，已有超過30種根黴脂肪酶實現了商品化生產。根黴脂肪酶大都具有高度1，3-位置選擇性，因此常用於油脂加工中。此外，根黴脂肪酶還具有穩定性佳，轉化效率高等優點，被廣泛應用於芳香酯、生物柴油、手性化合物的生產中。目前為止，國內外已報導了多個根黴脂肪酶的基因序列。日本、德國對米根黴脂肪酶(TPAizozw1S oryzae lipase, / )的基因序列和表達做了比較深入的研究，並先後用大腸桿菌、釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母成功表達了脂肪酶基因(Minning S et al. J Biotechnol, 1998, 66 : 147-156; Beer HD et al. Biochim Biophys Acta, 1998, 1399 :173-180; Ueda M et al. J Mol Catal B: Enzym, 2002，17 : 113-124)。發明人在前期研究中成功從釀造濃香型大麯酒的酒麴中篩選到一株高產脂肪酶的華根黴(熱辦印狀 chinensis CCTCC M 201021)菌株，並從該菌株中克隆得到脂肪酶基因序列(Genbank登錄號EF405962)，並實現該脂肪酶在巴斯德畢赤酵母(/YcAia中的高水平分泌表達 (Yu Xiao-ffei et al. J Mol Catal B: Enzym, 2009, 57:304-311)。定向進化屬於非理性設計，是指通過在實驗室中模擬達爾文自然進化過程，針對某一蛋白質酶的基因，通過改進的誘變技術改造的酶的基因，然後根據特定的改造目的，篩選有價值的天然酶。近10年來，定向進化技術已經在酯酶和脂肪酶性質改造領域取得巨大的成功，主要集中於提高酶的催化反應活性，改進底物特異性，提高熱穩定性，對映立體選擇性等方面(Johannes Tff et al. Curr. Opin. Microbiol, 2006, 9: 261-267)。酶活力的提高可以用酶的動力學參數尤&值來表示。尤at又稱轉化數，指每分子酶或每個酶活性中心在單位時間內能催化的底物分子數(TN)，也稱為催化常數。因此，尤^值的提聞即代表了酶活的提聞。

發明內容
本發明解決的技術問題是提供酶活力提高的華根黴脂肪酶。本發明的技術方案通過定向進化構建的活力提高的脂肪酶突變體，由華根黴 iRhizopus chinensis) CCTCC M 201021 脂肪酶基因(Genbank 登錄號 EF405962)，運用易錯PCR方法，通過多輪重組和定點突變，經定向進化而獲得的脂肪酶突變體，在突變體的胺基酸序列中，包含胺基酸突變 Alal29Ser、Lysl61Arg、Thrl95Tyr、Ala230Thr、Val261Gly> Lys322Arg、Ser373Asn以及上述胺基酸兩個、三個或四個突變的組合；以轉換數尤at表示， 脂肪酶突變體的酶活較出發菌株得到了提高；突變體的測序結果及其尤at提高的倍數為
權利要求
1.高活力華根黴脂肪酶突變體，其特徵是由華根黴chinensis^ CCTCC M 201021脂肪酶基因，其Genbank登錄號EF405962，運用易錯PCR方法，通過多輪重組和定點突變，經定向進化而獲得的脂肪酶突變體，在突變體的胺基酸序列中，包含胺基酸突變 Alal29Ser ;以轉換數尤at表示，脂肪酶突變體的酶活較出發菌株得到了提高；突變體的測序結果及其尤at提高的倍數為
全文摘要
高活力華根黴脂肪酶突變體，屬於酶的基因工程技術領域。本發明公開了一種由華根黴(Rhizopuschinensis)CCTCCM201021脂肪酶基因經定向進化而獲得的一系列脂肪酶突變體。在各突變體的胺基酸序列中，涉及到的胺基酸突變為Ala129Ser、Lys161Arg、Thr195Tyr、Ala230Thr、Val261Gly、Lys322Arg、Ser373Asn以及上述胺基酸兩個、三個或四個突變的組合。以轉換數Kcat表示，這些突變體的酶活較出發菌株得到了提高。
文檔編號C12R1/845GK102604911SQ20121008391
公開日2012年7月25日 申請日期2009年11月11日 優先權日2009年11月11日
發明者喻曉蔚, 徐巖, 王睿 申請人:江南大學