一種電泳用聚丙烯醯胺預製凝膠的緩衝系統的製作方法

2023-12-09 11:36:41 1

專利名稱：：一種電泳用聚丙烯醯胺預製凝膠的緩衝系統的製作方法
技術領域：
：本發明屬於凝膠電泳
技術領域：
，具體涉及用於預製膠電泳的聚丙烯醯胺凝膠的緩衝系統。
背景技術：
：聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)是以聚丙烯醯胺凝膠作為支持介質的電泳方法。在這種支持介質上可根據被分離物質分子大小和分子電荷多少來分離。由於聚丙烯醯胺凝膠是一種人工合成的物質，在聚合前可調節單體的濃度比，形成不同程度交鏈結構，其空隙度可在一個較廣的範圍內變化，可以根據要分離物質分子的大小，選擇合適的凝膠成分及濃度，使之具有比較好的解析度。聚丙烯醯胺凝膠電泳是一種最常用的蛋白質分離和鑑定的電泳方法，被廣泛應用於生物化學、分子生物學、免疫學、臨床化學、藥學等學科的研究。聚丙烯醯胺凝膠是由丙烯醯胺和N，N'甲叉雙丙烯醯胺聚合而成的大分子。凝膠具有由醯胺側鏈的碳-碳聚合物形成的網狀格子，沒有或很少帶有側基離子，因而電滲作用比較小，不易和樣品相互作用。由於這種分子篩作用，在電泳過程中凝膠並不僅是單純的支持物。丙烯醯胺稱單體，甲撐雙丙烯醯胺稱交聯劑，在水溶液中，單體和交聯劑通過自由基引發的聚合反應形成凝膠。在聚丙烯醯胺凝膠形成的反應過程中，需要有催化劑參加，催化劑包括引發劑和加速劑兩部分。引發劑在凝膠形成中提供始自由基，通過自由基的傳遞，使丙烯醯胺成為自由基，發動聚合反應，加速劑則可加快引發劑釋放自由基的速度。凝膠形成的孔徑與總濃度有關，總濃度愈大，孔徑相應變小，機械強度增強，當總濃度不變時，甲叉雙丙烯醯胺(Bis)的濃度在5%(w/v)時孔徑最小，高於或低於此值時，聚合體孔徑都相對變大，凝膠孔徑在凝膠電泳中是一個重要的參數，它往往決定了電泳的分離效果。常用的聚丙烯醯胺凝膠電泳為不連續的電泳系統，採用了兩種或兩種以上的緩衝液，PH值和凝膠網孔，不連續電泳能使稀的樣品在電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨能力。例如Laemmli緩衝系統((1970)Nature227，680-686)，在分離凝膠中含有0.375mol/L三羥基甲基氨基甲烷(Tris)，用HCl滴定pH至8.8。濃縮凝膠含有0.125mol/L三羥基甲基氨基甲烷，用HCl滴定pH至6.8。陽極和陰極電泳緩衝液中含有0.024mol/L三羥基甲基氨基甲烷和0.192mol/L甘氨酸。Tris的作用是維持溶液的電中性及pH。HCl在一定PH條件下易解離出Cl-，它在電場中遷移率大，走在最前面，故稱為快離子或前導離子。電極緩衝液中的甘氨酸在PH8.3的緩衝液中解離度很小，僅為0.1-1%，因而在電場中遷移率很小，稱為慢離子或尾隨離子。大多數蛋白質Pl在5.0左右，在pH8.8或6.8時均帶負電荷，在電場中均移向正極，其有效遷移率介於快慢離子之間，於是蛋白質就在快慢離子間形成的界面處，被濃縮成極窄的區帶。當進入PH8.8的分離膠時，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質，因此氯離子和甘氨酸離子沿著離子界面繼續前進。蛋白質分子由於分子量大，被留在後面，由於其分子的大小不同而被分離成多個區帶。蛋白質在聚丙烯醯胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決於三個主要因素凝膠孔隙度的大小、它所帶淨電荷以及分子的大小和形狀。如果加入一種試劑使電荷因素消除，那麼電泳遷移率就取決於分子的大小，就可以用電泳技術測定蛋白質的分子量。目前常用的陰離子去汙劑十二烷基硫酸鈉(SDS)具有這種作用。當向蛋白質溶液中加入足夠量SDS和巰基乙醇，巰基乙醇可使蛋白質分子中的二硫鍵還原。十二烷基硫酸根帶負電，使各種蛋白質-SDS複合物都帶上相同密度的負電荷，由於它的量大大超過了蛋白質分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質間原有的電荷差別，SDS與蛋白質結合後，還可引起構象改變，蛋白質-SDS複合物形成近似「雪茄菸」形的長橢圓棒，不同蛋白質的SDS複合物的短軸長度都不一樣，這樣的蛋白質-SDS複合物，在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質原有的電荷和形狀的影響，而取決於分子量的大小，因而SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)可以用於測定蛋白質的分子量。為蛋白質分離和鑑定最常用的的電泳方法。雖然聚丙烯醯胺凝膠電泳已經成為實驗室的最常規實驗方法，但其製備過程複雜而且耗時。需要準備的試劑多，工序繁瑣，準備時間也長，而且每一次跑出來結果可能都不一樣，造成實驗效率低。因為丙烯醯胺具有神經毒性，且易造成環境汙染及危害實驗人員的健康。目前一些國外公司推出了多種電泳預製膠，預製膠因為是大規模生產的，所以膠與膠之間重複性好，不像手工灌膠那樣結果差異大。且即開即用，不用再配製多種溶液、灌膠、等膠凝固，節省了寶貴的時間。預製電泳凝膠都是由供應商製成成品，然後運輸到實驗室進行電泳。因此預製膠必須具有較長時間的保質期，能夠在整個運輸和儲存過程中保持其性能。由高PH凝膠緩衝液系統製備的凝膠，由於丙烯醯胺水解，膠易降解，所以只能保存12周。另外，未聚合的丙烯醯胺在電泳過程中可能與蛋白質發生反應，進而可能干擾隨後的蛋白質分析，如多肽測序等。
發明內容本發明目的是為了克服上述現有技術十實驗室配製時工序繁瑣，耗時長，易造成汙染，實驗效率低，以及現有預製電泳凝膠保質期不能滿足長時間運輸的缺陷，提供一種製造成本低廉、凝膠統一、快捷、儲存12各月以上蛋白質分離能力和凝膠形狀保持穩定的預製凝膠的緩衝系統統。本發明解決其技術問題所採用的技術方案是一種電泳用聚丙烯醯胺預製凝膠的緩衝系統，包括陽極電泳槽緩衝液、陰極電泳槽緩衝液、分離凝膠和濃縮凝膠，其特徵在於所述濃縮凝膠和分離凝膠含有100300mmol/L三羥基甲基氨基甲烷和0.10.4%(w/v)十二烷基硫酸鈉，並以檸檬酸滴定pH至6.56.9；所述陽極電泳槽緩衝液和陰極電泳槽緩衝液中含有80120mmol/L三羥基甲基氨基甲烷-N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸和0.10.4%(w/v)十二烷基硫酸鈉，pH值調至7.58。進一步一，所述濃縮凝膠和分離凝膠含有200mmol/L三羥基甲基氨基甲烷及0.2%(w/v)十二烷基硫酸鈉，以檸檬酸(Citrate)滴定pH至6.8；所述陽極電泳槽緩衝液和陰極電泳槽緩衝液中含有lOOmmol/L三羥基甲基氨基甲烷-N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸和0.2%(w/v)十二烷基硫酸鈉，pH值調至7.8。本發明另一目的是提供一種製備電泳用聚丙烯醯胺預製凝膠的緩衝系統的方法，其特徵在於(1)、將30%ACr-O.8%Bis凝膠貯液與三羥基甲基氨基甲烷-檸檬酸緩衝液，pH6.8，10%(w/v)十二烷基硫酸鈉及10%過硫酸銨混勻，將N，N，N』，N』-四甲基乙二胺入混合液，混勻；分離膠含有8%(ν/ν)凝膠貯液、200mmol/L三羥基甲基氨基甲烷、0.2%(w/v)十二烷基硫酸鈉，0.05%(w/v)過硫酸銨及0.01%(v/v)TEMED；濃縮膠分別4%(ν/ν)凝膠貯液、200mmol/L三羥基甲基氨基甲烷、0.2%(w/v)十二烷基硫酸鈉，0.05%(w/v)過硫酸銨及0.01%(v/v)TEMED；(2)、將配置好的分離膠溶液緩慢加入制膠板之間，其上覆蓋厚度為0.4-0.8cm的正丁醇層至凝膠完全聚合。(3)、分離膠聚合後，倒除正丁醇，用蒸餾水衝洗分離膠膠面兩次，用濾紙吸去殘液，用滴管將濃縮膠溶液加在分離膠面上，充滿制膠板，插入樣品梳；(4)、配陽極電泳槽緩衝液和陰極電泳槽緩衝液，向槽中加注電極緩衝液，陽極和陰極電泳槽緩衝液中含有lOOmmol/L三羥基甲基氨基甲烷-HEPES和0.2%(w/v)十二烷基硫酸鈉，PH7.8。本發明相比現有技術，本發明凝膠分離緩衝系統在中性pH值條件下，蛋白質保持完整。蛋白質中的胺基酸不太容易與未聚合的丙烯醯胺或其他相關的阻斷劑發生反應。此夕卜，相對於較高PH值環境，巰基基團不易被氧化，聚丙烯醯胺本身也不易被水解。該凝膠體系增加了凝膠基質和緩衝液的穩定。由於丙烯醯胺水解比較緩慢，根據這一系統製備的凝膠可以在冰箱中儲存一年多而不降低其性能。此外，減少了蛋白的修飾，改善了Westernblot的分析結果。本發明配置方法採用相同的緩衝系統配製的分離凝膠和濃縮凝膠，解析度更高，且電泳速度更快。具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步描述。實施例1一種電泳用聚丙烯醯胺預製凝膠的緩衝系統，包括陽極電泳槽緩衝液、陰極電泳槽緩衝液、分離凝膠和濃縮凝膠。濃縮凝膠和分離凝膠含有200mmol/L三羥基甲基氨基甲烷及0.2%(w/v)十二烷基硫酸鈉，以檸檬酸(Citrate)滴定pH至6.8；陽極電泳槽緩衝液和陰極電泳槽緩衝液中含有lOOmmol/L三羥基甲基氨基甲烷-N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸和0.2%(w/v)十二烷基硫酸鈉，pH值調至7.8。實施例2電泳用聚丙烯醯胺預製凝膠的緩衝系統的組成凝膠貯液丙烯醯胺(Acr)28.38g，雙丙烯醯胺(Bir)1.62g.ddH20,定容至100ml過濾後於4°C避光保存。縮凝膠，8%的凝膠貯液，lOOmmol/L三羥基甲基氨基甲烷、0.1%(w/v)十二烷基硫酸鈉，並以檸檬酸滴定PH至6.5；分離膠，4%的凝膠貯液，lOOmmol/L三羥基甲基氨基甲烷、0.1%(w/v)十二烷基硫酸鈉，並以檸檬酸滴定PH至6.5；陽極電泳槽緩衝液lmol/LH3P04，67mlH3PO4用ddH20，定容至1L，加80mmol/LTris-HEPES和0.1%(w/v)十二烷基硫酸鈉；陰極電泳槽緩衝液lmol/LNaOH,40gNaOH用ddH20,定容至1L，加80mmol/LTris-HEPES和0.1%(w/v)十二烷基硫酸鈉；PH值調至7.5。實施例3濃縮凝膠和分離凝膠含有300mmol/L三羥基甲基氨基甲烷和0.4%(w/v)十二烷基硫酸鈉，並以檸檬酸滴定PH至6.9；陽極電泳槽緩衝液和陰極電泳槽緩衝液中含有120mmol/L三羥基甲基氨基甲烷-N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸和0.4%(w/v)十二烷基硫酸鈉，pH值調至8。本發明可以應用於市售的電泳槽或電泳儀中，更為優異的是使用於一次性的預製的即用型整體電泳裝置中。實施例41、凝膠板的準備(1)洗板將洗潔精用溫水稀釋後，用它浸透海綿擦洗玻璃板，然後用自來水洗淨，再用酒精將板擦乾。(2)安裝制膠板制膠前將玻璃板與塑料嵌條和凹型陶瓷板的邊緣對齊，用塑料夾子夾好，注意要確保密封，安放在固定架上。2、制分離膠配製分離膠和濃縮膠前，先將凝膠貯液(30%ACr-O.8%Bis,BioRadl61-0158)與三羥基甲基氨基甲烷(Tris)-檸檬酸(Citrate)緩衝液(pH6.8),10%(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)及10%過硫酸銨(AP)混勻，然後加TEMED(N，N，N』，N』-四甲基乙二胺)入混合液，混勻。分離膠和濃縮膠分別含有8%(ν/ν)和4%(ν/ν)凝膠貯液，以及200mmol/L三羥基甲基氨基甲烷(Tris),0.2%(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS),0.05%(w/v)過硫酸銨及0.01%(v/v)TEMED0將制膠板垂直放好，插上與相應厚度的樣品梳，在梳子下緣線Icm處做標記，卸下樣品梳。將新配好的分離膠溶液緩慢加入制膠板之間，直至液面達到標記處。用滴管貼近膠液界面小心而又緩慢地覆蓋厚度約0.5cm的正丁醇層，以防止溶液蒸發並保證膠面平整。約30至60分鐘凝膠完全聚合。3、制濃縮膠分離膠聚合後，倒去正丁醇，用蒸餾水衝洗分離膠膠面兩次，用濾紙吸去殘液。用滴管將新配好的濃縮膠溶液加在分離膠面上，充滿制膠板，插入樣品梳。4、安裝電泳槽濃縮膠聚合後，除去梳子以及夾子。將制膠扳、電泳糟內芯、另一對制膠板依次放入槽內。兩制膠板的凹型陶瓷板均應與電泳槽內芯接觸。然後插入楔型板以固定兩套制膠板。如果每次電泳只用一塊膠板，必須用提供的有機玻璃板代替另一套制膠板。5、加樣在內外水槽加注電極緩衝液，使內外槽的水位均超過凹形板的缺口但低於玻璃板的上沿。陽極和陰極電泳槽緩衝液中含有lOOmmol/L三羥基甲基氨基甲烷(Tris)-HEPES和0.2%(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)，pH7.8。用微量加樣器在梳井內加樣。6、電泳蓋好上蓋，將電泳儀的正極與下槽連接，負極與上槽連接，在150V的電壓下電泳約45分鐘至丨小時，至溴酚藍指示的電泳前沿到達制膠板的下緣止，關掉電源。然後拔掉楔形板，取下制膠扳。7，染色、脫色用刀片或薄板將白塑料板與陶瓷板輕輕撬開，用刀片沿分離膠與濃縮膠的交接處，將分離膠切下，在兩側溴酚藍染料區帶中心，插入細銅絲作為前沿標記。然後手戴橡膠手套將分離膠小心移入染色器皿中。在染色器皿中加入IOOmL考馬氏亮藍染液(含0.25%(w/v)考馬氏亮藍R_250，30%(ν/ν)乙醇，10%(ν/ν)乙酸的水溶液)，加蓋，在搖床上染色2h。再用脫色液脫色，直至蛋白質區帶清晰，即可計算相對遷移率。8、結果量出加樣端距細銅絲間的距離(cm)以及各蛋白質樣品區帶中心與加樣端的距離(cm)，按下式計算相對遷移率mR相對遷移率mR=蛋白質樣品距加樣端遷移距離(cm)/溴酚藍區帶中心距加樣端距離(cm)tableseeoriginaldocumentpage7因此，本發明中的中性pH值的電泳緩衝溶液可用於保存12個月以上的可作為蛋白質分析用的聚丙烯醯胺凝膠。權利要求一種電泳用聚丙烯醯胺預製凝膠的緩衝系統，包括陽極電泳槽緩衝液、陰極電泳槽緩衝液、分離凝膠和濃縮凝膠，其特徵在於所述濃縮凝膠和分離凝膠含有100～300mmol/L三羥基甲基氨基甲烷和0.1～0.4％(w/v)十二烷基硫酸鈉，並以檸檬酸滴定pH至6.5～6.9；所述陽極電泳槽緩衝液和陰極電泳槽緩衝液中含有80～120mmol/L三羥基甲基氨基甲烷-N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸和0.1～0.4％(w/v)十二烷基硫酸鈉，pH值調至7.5～8。2.如權利要求1所述電泳用聚丙烯醯胺預製凝膠的緩衝系統，其特徵在於所述濃縮凝膠和分離凝膠含有200mmol/L三羥基甲基氨基甲烷及0.2%(w/v)十二烷基硫酸鈉，以檸檬酸(Citrate)滴定pH至6.8；所述陽極電泳槽緩衝液和陰極電泳槽緩衝液中含有lOOmmol/L三羥基甲基氨基甲烷-N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸和0.2%(w/v)十二烷基硫酸鈉，pH值調至7.8。3.一種製備電泳用聚丙烯醯胺預製凝膠的緩衝系統的方法，其特徵在於(1)、將30%ACr-O.8%Bis凝膠貯液與三羥基甲基氨基甲烷-檸檬酸緩衝液，pH6.8，10%(w/v)十二烷基硫酸鈉及10%過硫酸銨混勻，將N，N，N』，N』_四甲基乙二胺入混合液，混勻；分離膠含有8%(ν/ν)凝膠貯液、200mmol/L三羥基甲基氨基甲烷、0.2%(w/v)十二烷基硫酸鈉，0.05%(w/v)過硫酸銨及0.01%(v/v)TEMED；濃縮膠分別4%(ν/ν)凝膠貯液、200mmol/L三羥基甲基氨基甲烷、0.2%(w/v)十二烷基硫酸鈉，0.05%(w/v)過硫酸銨及0.01%(v/v)TEMED；(2)、將配置好的分離膠溶液緩慢加入制膠板之間，其上覆蓋厚度為0.4-0.8cm的正丁醇層至凝膠完全聚合。(3)、分離膠聚合後，倒除正丁醇，用蒸餾水衝洗分離膠膠面兩次，用濾紙吸去殘液，用滴管將濃縮膠溶液加在分離膠面上，充滿制膠板，插入樣品梳；(4)、配陽極電泳槽緩衝液和陰極電泳槽緩衝液，向槽中加注電極緩衝液，陽極和陰極電泳槽緩衝液中含有lOOmmol/L三羥基甲基氨基甲烷-HEPES和0.2%(w/v)十二烷基硫酸鈉，pH7.8。全文摘要一種電泳用聚丙烯醯胺預製凝膠的緩衝系統，屬於凝膠電泳
技術領域：
包括陽極電泳槽緩衝液、陰極電泳槽緩衝液、分離凝膠和濃縮凝膠，其特徵在於所述濃縮凝膠和分離凝膠含有100～300mmol/L三羥基甲基氨基甲烷和0.1～0.4％(w/v)十二烷基硫酸鈉，並以檸檬酸滴定pH至6.5～6.9；所述陽極電泳槽緩衝液和陰極電泳槽緩衝液中含有80～120mmol/L三羥基甲基氨基甲烷-N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸和0.1～0.4％(w/v)十二烷基硫酸鈉，pH值調至7.5～8本發明增加凝膠基質和緩衝液的穩定。在冰箱中儲存一年多而不降低其性能。改善了Westernblot的分析結果。文檔編號B01D57/02GK101825606SQ20091015318公開日2010年9月8日申請日期2009年9月24日優先權日2009年9月24日發明者汪弋申請人:杭州吉來生物技術有限公司