一種高產耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌及其應用的製作方法

2023-05-30 23:55:21

一種高產耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌及其應用的製作方法
【專利摘要】一種高產耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌及其應用，分類命名為球狀賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillussphaericus)Xyn-1，已於2014年5月5日保藏於中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號為CCTCCM2014183。採用Plackett-Burman設計與響應面分析法確定了篩選菌株搖瓶最佳發酵產酶條件，該條件下的發酵水平可達5678.5IU/mL。利用該菌株發酵所產酶應用於植物半纖維素的降解，經過酶解半纖維素的木二糖收率可達60%以上。
【專利說明】一種高產耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種高產耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌及其應用，屬於應用微生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]木聚糖酶(Xylanase E.C3.2.1.8)是一種主要的木聚糖降解酶類，其通過內切方式降解木聚糖中的β_1，4木糖苷鍵，水解產物大多為低聚木糖，並伴有少量的木糖和阿拉伯糖。木聚糖酶具有廣泛的應用前景，在造紙工業方面:木聚糖酶可作為生物漂白劑替代傳統的化學漂白，從而大量降低氯的用量，減輕造紙對環境的汙染，木聚糖酶作為「製漿酶」已廣泛應用於西方發達國家，帶來了良好的經濟和社會效益；木聚糖酶在食品行業被廣泛用於麵製品、果汁等食品製作以及木寡糖的製備生產；發酵產業中，木聚糖酶被廣泛用於小麥等發酵原料的糖化處理上；飼料行業作為一類飼料添加酶，可有效提高飼料營養。木聚糖酶已經成為酶製劑生產行業中的一個重要產品，市場對於其需求量也呈現與日俱增的趨勢。
[0003]此外，通過對目前市場上應用木聚糖酶的整體環境分析可以發現，木聚糖酶劑的應用環境大多處於高溫條件，例如造紙過程，需要高溫操作以除去木質素等；食品生產過程一般需要高溫滅菌等操作。研究發現，木聚糖酶的最適反應溫度一般低於45°C，因此木聚糖酶在上述過程中投入使用前需要提前降溫以提高酶的催化活性，這些操作不僅耗能也極大地阻礙木聚糖酶的應用發展。因此，獲得高 產耐熱木聚糖酶菌株並將其投入於實際發酵生產具有廣闊的研究和應用前景。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種高產耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌及其在發酵產耐高溫木聚糖酶中的應用，具有很大的推廣價值。
[0005]高產耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌，分類命名為球狀賴氨酸芽孢桿菌Xyn-1 (Lysinibacillus sphaericus Xyn-1),已在中國典型培養物保藏中心保藏,保藏編號為:CCTCCM2014183，保藏日期為2014年5月5日，地址:中國武漢武漢大學。
[0006]本發明菌株的篩選方法如下:
[0007]篩選培養基配方:蛋白腖1g,酵母膏3g, NaC15g,木聚糖4g,瓊脂粉15g,蒸懼水100mL, ρΗ8.0，滅菌 121°C，20min。
[0008]採集位於南京工業大學生物甲烷生產車間周圍的農用秸杆堆肥不同位置若干份樣品接種到上述篩選培養基中，55°C培養24~48h，用0.1 %剛果紅溶液處理30min，再用lmol/L NaCl溶液脫色，然後選取培養基上透明圈較大且水解圈明顯的菌株作為初篩菌株；隨後，對初篩菌株的發酵產酶能力進行驗證，以木聚糖為底物，基於DNS法測定酶活，選取產量最高的一株菌株Xyn-1，其初始發酵水平為3245.5IU/mL。
[0009]生理生化特徵:菌株Xyn-1的生長以0D_的吸光度值表示，通過細菌對數時期單位內數量的增長計算生長代時為3.0h。菌株的分子生物學鑑定表明，菌株Xyn-1的16S rRNA基因序列在GenBank的註冊號為KJ755851,與其最相近種屬Lysinibacillus sphaericus的相似性為91%，為一新種屬細菌，命名為球狀賴氨酸芽孢桿菌Xyn-1 (Lysinibacillussphaericus Xyn-1)。該菌株已於2013年5月5日保藏於中國典型培養物保藏中心,保藏編號分別為:CCTCCM2014183。
[0010]所述的高產耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌在發酵產木聚糖酶的應用。
[0011]所述的高產耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌在降解秸杆半纖維素中的應用。
[0012]應用的具體步驟如下:
[0013]I)將菌株進行斜面培養，置於37°C下，培養48~72h，採用牛肉膏蛋白腖培養基，具體配方:牛肉膏3.0g，蛋白腖10.0g, NaC15.0g，瓊脂20g，溶解在100mL蒸餾水中，PH7.4-7.6。將上述斜面培養的菌株劃線接種滅菌的LB培養基中(蛋白腖10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解在100mL蒸餾水中，pH7.0~7.2)，37°C條件下200~250r/min培養12h，利用細胞計數板測定菌液濃度，並將其稀釋至菌懸液濃度5 X 16個/mL。
[0014]2)將步驟I)得到的菌液接種至發酵培養基中，接種量為4% (v/v)，培養基用量為25mL/250mL錐形瓶，培養溫度45°C，搖瓶轉速200r/min，發酵時間為72h。所述發酵培養基為:木聚糖 10.7g，酵母粉 5.6g，蛋白腖 2g，NH4N034g, (NH4)2S046g, KH2PO40.9g，MgSO4.7H201g, NaC15g，蒸餾水 100mL0
[0015]3)發酵制 備木聚糖酶用於小麥秸杆半纖維素的酶解:將步驟2)獲得的發酵液在5500r/min, 4°C條件下離心5min。收集上清液即得到發酵所產耐高溫木聚糖酶液,並將其應用於玉米秸杆半纖維素的酶解。酶解過程以100~150IU/g半纖維素的比例加入木聚糖酶液，在55°C條件下反應72h。反應結束後，過濾收集酶解液，利用HPLC法測定酶解液中各還原糖含量，並以此計算該過程的酶解效率。
[0016]有益效果
[0017]本發明提供了一株高產耐高溫木聚糖酶菌株Xyn-Ι，其培養條件相對溫和，篩選菌株通過鑑定屬於球狀賴氨酸芽孢桿菌，此前對於該菌株的木聚糖酶研究尚未進行過報導，本發明進一步豐富了該種屬菌系的相關研究內容。
[0018]篩選得到的菌株Xyn-1產耐高溫木聚糖酶的發酵水平達到5678.5IU/mL,比較發現該菌株的木聚糖酶生產能力較高，同時發酵獲得的耐高溫木聚糖酶具有很好的熱穩定性，可以廣泛應用於造紙、食品等行業。
[0019]採用統計學方法對菌株Xyn-1的生產發酵過程進行優化研究，獲得了最佳的培養方案，菌株的木聚糖酶發酵水平有了顯著的提高，由初始發酵3245.5IU/mL提高到5678.5IU/mL。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1球狀賴氨酸芽孢桿菌Xyn-1平板菌落形態圖。
【具體實施方式】
[0021]實施例1高產耐高溫木聚糖酶菌株的篩選及培養
[0022]富集培養基=NaNO30.5g、K2HPO4I g、MgSO4.7Η200.5g、KC10.5g、FeSO4.7H200.005g、蒸懼水 100mL, pH 自然，滅菌 121°C,20min。[0023]篩選培養基:蛋白腖10g，酵母膏3g，NaC15g，木聚糖4g，瓊脂粉15g，
[0024]蒸餾水lOOOmL，ρΗ8.0，滅菌 121°C，20min。
[0025]發酵培養基:蛋白腖1g,酵母膏3g, NaC15g,木聚糖4g,蒸懼水100mL, pH自然，滅菌 121°C，20min。
[0026]LB培養基:蛋白腖10g，酵母提取物5g，NaCllOg，瓊脂20g，溶解在100mL蒸餾水中，ρΗ7.0 ~7.2，滅菌 121°C，20min。
[0027]採集位於南京工業大學生物甲烷生產車間周圍的秸杆堆肥不同位置若干份樣品5g,將其分別置於250mL錐形瓶中，加入50mL無菌水，37°C、180r/min培養Ih製備懸液，取5mL懸液加入到盛有50mL富集培養基的三角瓶中，振蕩培養5~7d後，取培養液分別稀釋ΙΟ—1~10_6，並分別將其均勻塗布到篩選培養基上，55°C培養24~48h，用0.1 %剛果紅溶液處理30min，再用lmol/L NaCl溶液脫色。觀察菌落周圍的透明圈情況，根據透明圈與菌落尺寸的大小可以比較出菌株產木聚糖酶活力的高低，並以此作為指標進行菌株的初篩。初篩完成後，對若干初篩菌株的菌液稀釋10—1~10_6，分別接種到新鮮的發酵培養基中35°C培養72h，以發酵液中木聚糖酶產量作為直接標準進行菌株復篩。如此繼代培養，淘汰發酵水平較弱的培養物，最終得到一株保持較高木聚糖酶產酶能力且穩定的菌株，利用LB培養基對其進行菌株純化保藏，同時利用甘油培養方式對純化菌株進行凍藏處理。
[0028]實施例2篩選菌株的生物學鑑定
[0029]1.菌株的形態學鑑定 [0030]將分離純化菌株接種到固體LB培養基上，在37°C條件下培養24h觀察菌種的平板菌落形態。如圖1，菌株Xyn-1，在固體LB培養基生長後，菌落直徑0.6cm，形狀呈規則的突起物，可形成內生芽孢，呈圓形，培養基上呈白色不透明菌落，表面光滑，菌落邊緣規則。
[0031]2.菌株的分子學鑑定
[0032]對篩選細菌進行菌種鑑定，菌種鑑定基於NCBI資料庫的細菌16S rDNA序列庫。利用細菌基因組提取試劑盒提取菌株的DNA，並利用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增，弓丨物序列為:27F(5』-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3』)、1492R(5』-GGYTACCTTGTTACGACT-3』)。PCR反應體系為(25 μ L):模板0嫩10叩，10\?0?緩衝液2.5 4 1^，25臟01/1]\%(:121.5 4 1^ dNTP1^叉2.5 4 1^，引物各0.25 4 1^，5~4 1^1^&9聚合酶0.125 μ L0 PCR反應程序為:94°C預變性5min,隨後35個循環(94°C變性30s，55°C退火lmin，72°C延伸2min)，最後72°C反應lOmin。將純化後的PCR擴增片段送檢測序，並將測序結果通過NCBI中Genbank的BLAST程序進行相似性比對。
[0033]分子學鑑定結果:篩選菌株Xyn-1的16S rDNA區序列如SEQ ID NO:1所示，該序列已提交至Genbank,註冊號為KJ755851,與其最相近種屬Lysinibacillus sphaericus的相似性為91 %，為一新種屬細菌，命名為球狀賴氨酸芽孢桿菌Xyn-1。
[0034]實施例3發酵培養條件的優化
[0035]採用單因素分析法對菌株Xyn-1培養條件進行優化，確定最佳的培養條件:培養基用量25mL/250mL錐形瓶，培養溫度45°C，搖瓶轉速200r/min，菌懸液濃度為5 X 16個/mL,每瓶接種量為1.0mL,初始pH7.0，發酵時間為72小時。培養基組成的優化:
[0036]通過單因素分析法確定與Xyn-1產酶的培養基相關9因素。採用Plackett-Burman設計篩選產酶重要影響因子，選用試驗次數N = 12的設計，對培養基中的乳糖、麥芽糖、木聚糖、酵母粉、蛋白腖、氯化鈉、硫酸鎂、硫酸銨和磷酸二氫鉀)等9個因素進行考察，結果見表1~2，對產酶影響的順序為:木聚糖 > 酵母粉 > 磷酸二氫鉀 > 蛋白腖。
[0037]表1菌株Xyn-1培養因素Plackett-Burman設計試驗
[0038]
【權利要求】
1.一株高產耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌，其分類命名為球狀賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sphaericus) Xyn-1,已於2014年5月5日保藏於中國典型培養物保藏中心 CCTCC，保藏編號為 CCTCCM 2014183。
2.權利要求1所述的高產耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌在發酵產木聚糖酶的應用。
3.權利要求1所述的高產耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌在降解秸杆半纖維素中的應用。
4.根據權利要求2所述的高產耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌在發酵產木聚糖酶的應用，其特徵在於包括如下步驟: 1)斜面培養:將球狀賴氨酸芽孢桿菌Xyn-1接種至斜面培養基上，37°C下，培養48~72h ； 2)種子培養:挑取步驟I)斜面上的單菌落於LB培養基中，在37°C條件下置於200-250r/min的搖床中，培養12 h，獲得種子液； 3)發酵產酶:將步驟2)中的種子液接種至發酵培養基中，接種量為I~10%(v/v)，45°C下發酵72 h製備含耐高溫木聚糖酶的發酵液。
5.根據權利要求4所述的高產耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌在發酵產木聚糖酶的應用，其特徵在於:步驟I)所述斜面培養基為:牛肉膏3.0 g，蛋白腖10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20 g，溶解在1000 mL蒸餾水中，pH 7.4-7.6。
6.根據權利要求4所述的高產耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌在發酵產木聚糖酶的應用，其特徵在於:步驟2)所述LB培養基為:蛋白腖10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂20 g，溶解在1000 mL蒸餾水中，pH 7.0~7.2。
7.根據權利要求4所述的高產耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌在發酵產木聚糖酶的應用，其特徵在於:步驟3)所述發酵培養基為:木聚糖10.7 g，酵母粉5.6 g，蛋白腖2 g，NH4NO3 4 g, (NH4)2SO4 6 g, KH2PO4 0.9 g, MgSO4.7H20 I g, NaCl 5 g,蒸餾水 1000 mL, pH 自然。
8.根據權利要求3所述的高產耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌在降解秸杆半纖維素中的應用，其特徵在於:將球狀賴氨酸芽孢桿菌Xyn-1發酵得到含耐高溫木聚糖酶的發酵液，以10(T150 IU/g半纖維素的酶解比例加入含耐高溫木聚糖酶的發酵液，在55°C條件下酶解72h。
【文檔編號】C12P19/14GK104031860SQ201410228680
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月27日 優先權日:2014年5月27日
【發明者】賈紅華, 鍾超, 王春明, 王鳳學, 韋萍 申請人:南京工業大學