鼠灰鏈黴菌amp脫氨酶基因的畢赤酵母真核表達方法
2023-05-30 17:56:36 1
鼠灰鏈黴菌amp脫氨酶基因的畢赤酵母真核表達方法
【專利摘要】本發明公開一種鼠灰鏈黴菌AMP脫氨酶基因的畢赤酵母真核表達方法。該方法以鼠灰鏈黴菌基因組為模板，設計特異性引物擴增AMP脫氨酶基因序列，在其兩端加入酶切位點和組氨酸標籤，並亞克隆至組成型表達載體pGAP9K以構建重組質粒，酶切線性化後電轉化畢赤酵母，篩選陽性克隆轉化子，接種至發酵培養基進行液體發酵培養，取發酵液上清，即得AMP脫氨酶表達產物。本發明首次在畢赤酵母中成功表達了鼠灰鏈黴菌來源的AMP脫氨酶，實驗結顯示該重組酶具有較高的酶活，且酶活性穩定，易於純化，可應用於食品、醫藥等領域，為AMP脫氨酶的工業化生產奠定了基礎。
【專利說明】鼠灰鏈黴菌AMP脫氨酶基因的畢赤酵母真核表達方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及AMP脫氨酶基因的真核表達，具體涉及一種鼠灰鏈黴菌來源的AMP脫氨酶基因的真核表達方法及其表達產物的應用，屬於分子生物學【技術領域】。
【背景技術】
[0002]AMP脫氨酶,英文名為AMP deaminase,簡寫為AMPD,是一種氨基水解酶,其可催化AMP使其脫去氨基生成肌苷酸(MP)和NH3, MP在食品以及製藥等領域中有重要應用。另外，AMP脫氨酶是嘌呤核苷酸代謝循環中的三種主要酶類之一，對於維持機體免疫力和腺苷酸能荷具有重要作用。因此，AMP脫氨酶是工業生產中一種重要的酶。
[0003]AMP脫氨酶廣泛存在於各種生物體內。其最早由鼠骨骼肌製備，隨後又由人紅血細胞製備，目前工業化生產中通常由酵母、黴菌等微生物發酵產AMP脫氨酶，但是在酶的提取純化、酶活性以及穩定性等方面存在諸多問題。因此，利用DNA重組技術，將微生物來源的AMP脫氨酶基因在特定宿主中進行重組表達，可以有效改善上述問題。現在國內關於AMP脫氨酶基因重組表達的研究從未報導過，國外關於該酶的重組表達的研究較少，僅在申請號為CN200580013789.3的專利「放線菌來源的AMP脫氨酶及其應用」( 申請人::天野酶株式會社)中報導過一次。
【發明內容】
[0004]針對現有技術存在的不足，本 申請人:經過研究改進，提供一種鼠灰鏈黴菌AMP脫氨酶基因的真核表達方法。本發明首次在畢赤酵母中成功表達了鼠灰鏈黴菌來源的AMP脫氨酶，實驗結顯示該重組酶具有較高的酶活，且酶活性穩定。
[0005]本發明的技術方案如下:
[0006]鼠灰鏈黴菌AMP脫氨酶基因的畢赤酵母真核表達方法，其特徵在於:以鼠灰鏈黴菌基因組為模板，設計特異性引物擴增AMP脫氨酶基因序列，在其兩端加入酶切位點和組氨酸標籤，並亞克隆至組成型表達載體PGAP9K以構建重組質粒，酶切線性化後電轉化畢赤酵母，篩選陽性克隆轉化子，接種至發酵培養基進行液體發酵培養，取發酵液上清，即得AMP脫氨酶表達產物。
[0007]具體地，所述方法步驟如下:
[0008]( 1)鼠灰鏈黴菌AMP脫氨酶基因的克隆
[0009]以鼠灰鏈黴菌基因組為模板，以序列為SEQ ID NO:1和SEQ ID Ν0:2的引物對通過PCR特異性擴增AMP脫氨酶基因，在其兩端均加入EcoRI酶切位點和組氨酸標籤，純化回收PCR產物；
[0010](2)重組表達載體的構建
[0011 ] 將組成型表達載體pGAP9K和步驟(1)所得PCR產物分別用EcoRI酶切純化，連接所得酶切產物並轉化Ε.coli JM109，篩選陽性克隆菌株；
[0012](3)線性化重組質粒對畢赤酵母的電轉以及陽性克隆轉化子的篩選[0013]提取步驟(2)所得陽性克隆菌株質粒,經SacI線性化後電轉化Pichia pastorisGS115，使用步驟(1)所述引物對篩選陽性克隆轉化子；
[0014](4)重組菌的搖瓶發酵培養
[0015]將步驟(2)所得陽性克隆轉化子接種至YPD培養基進行種子培養，取對數生長期24h的種子液以體積比3%的接種量接種至液體發酵培養基，於30°C、200r/min搖瓶發酵培養96h，取發酵液上清，即得AMP脫氨酶表達產物；所述液體發酵培養基成分如下:甘油2wt%，蛋白腖 2wt%、酵母膏 lwt%、KH2PO4 0.5wt%, MgSO4.7H20 0.05wt%, pH 值為 6.0。
[0016]優選地，步驟(1)所述鼠灰鏈黴菌選自鼠灰鏈黴菌(Streptomyces murinus)MCCCN0.1A01641。
[0017]本發明還提供了上述鼠灰鏈黴菌AMP脫氨酶基因的畢赤酵母真核表達方法製備得到的AMP脫氨酶表達產物在食品及醫藥領域的應用。
[0018]本發明的有益技術效果在於:
[0019]本發明首次以鼠灰鏈黴菌AMP脫氨酶基因組為模板，通過重組表達載體PGAP9K-AMPD的構建、轉化與陽性克隆轉化子的篩選、重組菌瓶搖發酵培養條件(包括培養基碳源、氮源、種子液接種齡、接種量、培養基PH值、發酵時間)的精心優化和篩選，在畢赤酵母(Pichia pastoris GS115)中成功表達了鼠灰鏈黴菌來源的AMP脫氨酶；試驗結果顯示:本發明製備的重組AMP脫氨酶表達產物具有較高的酶活，酶活性穩定，在培養基碳源添加量為2wt%、培養基pH為6.0，接種齡為24h，發酵時間96h的發酵條件下，重組菌GSl 15酶活可達到2230±60U/ml，且重組酶帶組氨酸標籤，易於純化，可應用於食品、醫藥等領域，為AMP脫氨酶的工業化生產奠定了基礎。`【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1為實施例2重組表達質粒pGAP9K-AMPD酶切驗證電泳圖。
[0021]圖2為實施例4不同碳源對GS115重組菌產酶影響的示意圖。
[0022]圖3為實施例4碳源添加量對GS115重組菌產酶影響的示意圖。
[0023]圖4為實施例4不同氮源對GS115重組菌產酶影響的示意圖。
[0024]圖5為實施例4接種齡對GS115重組菌產酶影響的示意圖。
[0025]圖6為實施例4接種量對GS115重組菌產酶影響的示意圖。
[0026]圖7為實施例4發酵培養基pH對GSl 15重組菌產酶影響的示意圖。
[0027]圖8為實施例4不同發酵時間對GS115重組菌產酶影響的示意圖。
【具體實施方式】
[0028]以下結合附圖，並通過實施例對本發明進行具體說明。
[0029]以下實施例所涉及實驗材料如下:
[0030]菌株:鼠灰鏈黴菌(Streptomyces murinus)購自中國海洋微生物菌種保藏管理中心(MCCC)，保藏編號MCCC N0.1A01641,以下簡稱鼠灰鏈黴菌MCCC 1A01641 ；E.coliJM109購自大連寶生物工程有限公司；所述畢赤酵母Pichia pastoris GS115表達系統購自 Invitrogen 公司。
[0031 ] 所涉及其他試劑及試劑盒均為國產或進口商品。[0032]實施例1鼠灰鏈黴菌AMP脫氨酶基因的克隆
[0033]以鼠灰鏈黴菌MCCC 1A01641基因組為模板，設計引物對AMPDF2/AMPDR2特異性擴增鼠灰鏈黴菌AMP脫氨酶基因，在其兩端均加入EcoRI酶切位點(下劃線表示)和組氨酸標籤(雙下劃線表示)，引物對AMPDF2/AMPDR2序列如下:
[0034]AMPDF2:
[0035]5，-GCGGAATTC CATCATCATCATCATCAT GCGCCGCCGCCCCGGCAG-3，(SEQ IDNO:1)；
[0036]AMPDR2:
[0037]5，-GCCGAATTCTCA ATGATGATGATGATGATG CCCCCGGGCGTGCGCCC-3，(SEQID NO:2)；
[0038]用膠純化試劑盒純化所得PCR產物。
[0039]實施例2重組表達載體pGAP9K-AMPD的構建
[0040]將組成型表達載體pGAP9K和步驟(1)所得PCR產物分別用EcoRI酶切純化，於16°C連接過夜，連接產物轉化E.coli JM109，提取pGAP9K-AMPD-JM109菌株質粒，酶切驗證，篩選出pGAP9K-AMPD-JM109陽性菌株。重組表達質粒pGAP9K_AMPD酶切驗證電泳圖如圖1所示。
[0041]實施例3線性化重組質粒pGAP9K-AMPD對GS115的電轉化以及轉化子的篩選
`[0042]提取實施例2所得pGAP9K-AMPD-JM109陽性菌株質粒，經SacI線性化後電轉化Pichia pastoris GSl 15,塗布MD平板,3~5天後挑取單菌落,通過蝸牛酶法提取重組質粒，使用實施例1所述特異性引物對AMPDF2/AMPDR2進行PCR驗證，篩選得到陽性克隆轉化子。將陽性克隆轉化子接種至YPD培養基進行種子培養。
[0043]實施例4重組菌瓶搖發酵培養條件的優化
[0044]4.1考察不同碳源對重組菌產酶的影響
[0045]以2wt%蛋白腖為氮源，分別以2wt%甘油、乳糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性澱粉以及葡萄糖為碳源對重組菌進行搖瓶發酵，結果如圖2所示。結果表明:各種碳源對重組菌的生長和酶活影響差別較大，其中以甘油為碳源時，不僅菌體量達到最高，而且AMP脫氨酶的酶活也最高；以葡萄糖作為碳源時，菌體量和酶活也較好，僅次於甘油；但分別以乳糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性澱粉為碳源時，不僅菌體生長不好，而且酶活很低，因此，選擇甘油作為碳源。在以甘油為碳源時，繼續考察甘油的添加量對重組菌生長和產酶的影響。分別配製含有0.5wt%、lwt%、2wt%、3wt%、4wt%、5wt%甘油的發酵培養基，對重組菌進行搖瓶培養，72h後取樣測菌體濃度和酶活，如圖3所示。結果表明，當甘油濃度20g/L時，隨著甘油濃度的不斷上升菌體量不再增加，而酶活在逐漸降低，這可能是由於過高的甘油濃度對重組酶的表達有抑制作用。因此，選擇2被％的甘油為碳源。
[0046]4.2考察不同氮源對重組菌產酶的影響
[0047]以2wt%甘油為碳源，分別以2wt%(NH4)2SO4 (A)、KNO3 (B)、麩皮(C)、棉籽粉(D)、玉米漿(E)、蛋白腖(F)、酵母膏(H)、牛肉膏(I)單一氮源以及蛋白腖+酵母膏(2:1) (J)、蛋白腖+牛肉膏(2:1) (K)複合氮源為氮源進行搖瓶發酵，72h後測菌體濃度和酶活，結果如圖4所示。結果表明:無機氮源產酶能力較低且菌體生長相對較差；有機氮源更有利於促進產酶且有利於菌體的生長，其中，以蛋白腖+酵母膏(2:1)為氮源時酶活最大。因此，選取蛋白腖+酵母膏(2:1)作為氮源。
[0048]4.3考察接種齡對重組菌產酶的影響
[0049]分別取處於對數生長期12、16、20、24、28、32、36h的種子液以2%接種量轉接至50ml發酵培養基(甘油2wt%，蛋白腖2wt%，酵母膏lwt%，KH2PO4 0.5wt%, MgSO4.7Η20
0.05wt%, pH 6.0。)中，搖瓶培養72h後，取樣測菌體濃度和酶活，結果如圖5所示。結果表明:對數期內，菌體濃度隨著菌齡的增大而增加，而酶活在對數期20h達到最大，之後逐漸降低。因此，最適接種齡為20h。
[0050]4.4考察接種量對重組菌產酶的影響
[0051]將種齡為20h的種子液分別以體積比1%、2%、3%、4%、5%的接種量接到50ml
發酵培養基(同上)中，72h後取樣測菌體濃度和酶活，結果如圖6所示。結果顯示:在1%~5%範圍內，重組菌的菌體濃度與接種量成正相關。酶活測定結果顯示在接種量為3%時酶活最大，高於或低於3%接種量時酶活均有所降低。因此，最佳接種量為3%。
[0052]4.5考察培養基pH對重組菌產酶的影響
[0053]配製pH 值分別為 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 的 50ml 發
酵培養基(同上)，按20h種齡、體積比3%接種量接入種子液，72h後測菌體濃度和酶活，結果如圖7所示。結果顯示:pH值為4.0~6.0時菌體量逐漸增大，pH值為6.0-7.5時菌體量變化不大；pH值為4.0時沒有酶活，pH為6.0時重組酶活性最大，當pH大於6.0時，隨著pH值增大酶活逐漸降低。因此,培養基最適pH確定為6.0。
[0054]4.6考察發酵時間對重組菌產酶的影響
[0055]配製pH值為6.0的50ml發酵培養基(同上)，按20h種齡、3%接種量接入種子液，30°C、200r/min 搖瓶培養，分別培養 48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h 後，取樣測酶活，結果如圖8所示。結果顯示:培養96h時重組酶活性最大。
[0056]實施例5正交試驗
[0057]根據正交設計原理以及實施例4發酵培養條件單因素試驗結果，設計了四因素三水平正交試驗方案，正交試驗因素參見表1。
[0058]表1正交試驗因素表
[0059]
【權利要求】
1.鼠灰鏈黴菌AMP脫氨酶基因的畢赤酵母真核表達方法，其特徵在於:以鼠灰鏈黴菌基因組為模板，設計特異性引物擴增AMP脫氨酶基因序列，在其兩端加入酶切位點和組氨酸標籤，並亞克隆至組成型表達載體PGAP9K以構建重組質粒，酶切線性化後電轉化畢赤酵母，篩選陽性克隆轉化子，接種至發酵培養基進行液體發酵培養，取發酵液上清，即得AMP脫氨酶表達產物。
2.根據權利要求1所述鼠灰鏈黴菌AMP脫氨酶基因的畢赤酵母真核表達方法，其特徵在於具體步驟如下: (1)鼠灰鏈黴菌AMP脫氨酶基因的克隆 以鼠灰鏈黴菌基因組為模板，以序列為SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2的引物對通過PCR特異性擴增AMP脫氨酶基因，在其兩端均加入EcoRI酶切位點和組氨酸標籤，純化回收PCR產物； (2)重組表達載體的構建 將組成型表達載體PGAP9K和步驟(1)所得PCR產物分別用EcoRI酶切純化，連接所得酶切產物並轉化E.coli JM109，篩選陽性克隆菌株； (3)線性化重組質粒對畢赤酵母的電轉化以及陽性克隆轉化子的篩選 提取步驟(2)所得陽性克隆菌株質粒，經SacI線性化後電轉化Pichia pastorisGS115，使用步驟(1)所述引物對篩選陽性克隆轉化子； (4)重組菌的搖瓶發酵培養 將步驟(2)所得陽性 克隆轉化子接種至YPD培養基進行種子培養，取對數生長期24h的種子液以體積比3%的接種量接種至液體發酵培養基，於30°C、200r/min搖瓶發酵培養96h，取發酵液上清，即得AMP脫氨酶表達產物；所述液體發酵培養基成分如下:甘油2wt%，蛋白腖 2wt%、酵母膏 lwt%、KH2PO40.5wt%, MgSO4.7H20 0.05wt%, pH 值為 6.0。
3.根據權利要求2所述鼠灰鏈黴菌AMP脫氨酶基因的畢赤酵母真核表達方法，其特徵在於:步驟(1)所述鼠灰鏈黴菌選自鼠灰鏈黴菌(Streptomyces murinus) MCCCN0.1A01641。
4.權利要求1~3任一項所述鼠灰鏈黴菌AMP脫氨酶基因的畢赤酵母真核表達方法製備得到的AMP脫氨酶表達產物在食品及醫藥領域的應用。
【文檔編號】C12R1/84GK103805629SQ201410042060
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月28日 優先權日:2014年1月28日
【發明者】張梁, 石貴陽, 方煒, 丁重陽, 顧正華 申請人:江南大學