基於減毒痘苗病毒天壇株為載體的禽流感疫苗的製作方法

2023-06-25 19:41:16

專利名稱：基於減毒痘苗病毒天壇株為載體的禽流感疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，更具體的說涉及基於高度減毒痘苗病毒天壇株 (CCTCC :V200416)為載體的禽流感疫苗及其製備方法和用途。
背景技術：
禽流感(Avian Influenza, Al)是由正粘病毒科流感病毒屬的A型流感病毒引起 的一類人畜禽共患傳染性疾病或疾病綜合症。1878年，Perroncito首次報導義大利雞群 暴發了禽流感，當時稱之為雞瘟。1901年，Centannic和Sarunozzi認為此病由「可濾過」 病原引起。直到1955年，才由Schafer證實雞瘟病毒實際上就是A型禽流感病毒。禽流感 病毒現已廣泛分布於世界範圍內的許多家禽(包括火雞、雞、珍珠雞、鵪鶉、鷓鴣、鴕鳥、雉、 鵝和鴨等)和野禽(野鴨、天鵝、燕鷗、鷺、海鳩、海鸚和海鷗等)。禽流感病毒可以感染人、 豬、馬、海洋哺乳動物及多種禽類，其中對火雞和雞的危害最為嚴重。該病是世界動物衛生 組織(OIE)規定的A類傳染病，我國也列為一類動物傳染病。研究發現，A型流感病毒所有 的H亞型和N亞型都存在於水禽及海鳥中，因此水禽和海鳥被稱為A型流感病毒的天然儲 存庫。已有的研究表明，所有哺乳動物流感病毒均來自於禽流感病毒。在20世紀的4次人 類流感大流行中(1918年西班牙流感，1957年亞洲流感，1968年香港流感和1977年的前蘇 聯流感)，所分離到的人流感病毒均具有禽流感病毒的遺傳學特性。根據致病性的不同，禽流感可分為高致病性禽流感(Highly Pathogenic Avian Influenza,HPAI)、低致病性禽、流感(Low Pathogenic Avian Influenza Virus,LPAI)禾口非 致病性禽流感(None-Pathogenic Avian Influenza Virus, NPAI)三大類。其中高致病性 禽流感引起的危害最大。近年來，頻繁暴發的H5W高致病性禽流感不但給世界養禽業帶來 了嚴重的經濟損失，而且對人的生命健康也造成了嚴重的威脅，高致病性禽流感病毒感染 人甚至致人死亡的病例時有發生。1997年，在我國香港特別行政區首次出現了禽流感病毒 直接感染人的病例，一名3歲男童被確診感染H5W亞型AIV，之後共18人感染髮病，6人死 亡。其後，人感染禽流感一直在亞洲地區零星爆發。自2003年12月開始，禽流感在東南亞 地區，主要在越南、泰國和印尼等國嚴重暴發，造成多名病人死亡，並迅速蔓延我國。目前， 禽流感已在世界上許多個國家暴發，截止至2009年8月31日(2003年始)，世界衛生組織 (WHO)報告高致病性人禽流感(H5N1)確診病例達440例(15個國家)，死亡262例，死亡率 達59. 5%。儘管目前還沒有證據表明，高致病性禽流感H5W病毒可以在人與人之間傳播， 但H5W病毒的宿主可變性與廣泛傳播的特點表明了該病毒通過重組導致在人群之間傳播 的巨大可能性。WHO認為該疾病可能是對人類潛在威脅最大的疾病之一，要求世界各國做好 應對流感大流行的防控準備。預防與控制流感可能大規模流行的最好辦法是疫苗。現行有效的預防流感的疫苗 主要分為兩種用雞胚培養的常規滅活疫苗及減毒流感疫苗。前者又分為整病毒，部分產 物亞單位表面抗原疫苗。整病毒疫苗因伴隨許多副作用，已很少採用，絕大部分疫苗為純化 疫苗，即用去垢劑處理純化的病毒，然後經過離心等步驟進一步純化血凝素及神經氨酸酶蛋白，製備表面抗原疫苗。將三種不同病毒株的抗原合併還可製成三聯疫苗。滅活疫苗安 全性和免疫原性都不錯，不存在毒力返強的危險。但是滅活疫苗也有一定的缺點。首先，流 感病毒的生產依賴於SPF雞胚，限制了其大批量生產；其次，用雞胚生產的滅活疫苗對部分 人群會有局部和全身的不良反應。此外，如果以高致病性流感病毒為疫苗株，還需要特定的 BSL-3生物安全生產車間，這樣更加限制了疫苗的生產。另外一種則為溫度敏感型減毒活疫 苗，將WHO當年推薦的流感病毒株的血凝素基因與神經氨酸酶基因與六種其它溫度敏感型 減毒株基因重組，通過雞胚培養，製成減毒活疫苗。減毒活疫苗接種後，在機體內具有有限 的繁殖能力，可使機體發生接近隱性感染或輕度感染的反應，但不產生顯著臨床症狀，免疫 效果強而持久，一般只需接種一次，且接種劑量小，具有刺激機體產生體液免疫和細胞免疫 保護。該疫苗的缺點就是有效期短，須在低溫條件下儲存和運輸，安全性存在隱患，而且最 大的缺點就是可能會因發生基因突變而在人體內恢復毒力。由於H5m的強毒性，難於在雞胚中生長和由高致病帶來的安全與規則方面的問 題，限制了使用常規方法來研製生產H5m疫苗。為了克服這一因難，目前研製有效的H5m 疫苗主要策略是1.選用抗原類似的非致病性流感病毒株。自1997年香港H5m暴發以來，已在人群中試用兩種疫苗。使用非致病流感株A/ duck/Singapore/3/97製備的H5W亞單位疫苗臨床試驗表明，該疫苗雖然經過多次免疫僅 產生很弱的抗體反應。雖然使用MF59佐劑可改善該備選疫苗的免疫原性，但其保護性有待 進一步證明(Stephenson I, et al, The Journal of Infectious Diseases, 2005 (191) 1210-1215)。2.使用昆蟲表達系統表達H5m表面抗原。使用高效表達蛋白的昆蟲系統表達H5血凝素，可保護雞抵抗H5W致死劑量的 攻擊。臨床試驗結果則顯示非常弱的免疫原性。即使經過兩次90ug高劑量的免疫，只 有52%的試驗顯示產生中和抗體。昆蟲系統表達的H5血凝素弱的免疫原性可能由不同 的糖基化所致，或H5蛋白在人體的弱免疫原性(Treanor JJ, et al, Vaccine, 2001 (19) 1732-1737)。3.使用反向遺傳法構建減毒流感病毒。反向遺傳基本原理是使用常規流感減毒株Hmi除血凝素外的所有編碼蛋白質粒 加上來自高致病H5m經突變的表達H5血凝素的質粒共轉染細胞，獲得新的重組流感病毒。 該病毒由突變H5蛋白加上減毒Hmi其他組份組成。該減毒疫苗經雞胚培養放大之後，可 按常規流感病毒疫苗辦法製備抗H5m的人用疫苗。雖然反向遺傳改造的流感減毒株在動 物試驗中顯示出有效的保護作用。但能否在人體試驗也具有良好的免疫保護效果尚不得而 知。一種很大的可能是與H5表達蛋白一樣，減毒株的弱免疫原性，難於在人體內刺激產生 有效的中和抗體。另外，反向遺傳技術難以在短時間內提供大量的疫苗。因此，目前的疫苗 研究在近期內製出在人類有效的抗H5m疫苗不容樂觀。必須使用新的研究方法解決發生 H5N1在人類大規模流的威脅。活病毒載體疫苗是將編碼病毒蛋白的基因插入其他病毒基因組中並用之感染動 物或人體，產生對基因產物及載體的免疫反應。這種基於重組有機體的疫苗具有潛在的免 疫原性，而無原病毒引起的病理反應。因此成為HIV、SARS等疫苗的重要研究領域。其中以痘苗病毒載體的活載體疫苗研究的最為深入和廣泛，目前已成功表達了多種來源於動物和 人類病毒的基因，如牛流行熱病毒的G蛋白基因，B型肝炎病毒SSl蛋白基因，麻疹病毒HA 與F蛋白基因，狂犬病毒G蛋白和N蛋白基因，獲得性免疫缺陷綜合症病毒的GAG和POL蛋 白基因等。鑑於當前禽流感疫苗研製存在的困難，本發明將H5m高致病性禽流感病毒的HA 基因插入痘苗病毒天壇株基因組中，製備了基於減毒痘苗病毒天壇株為載體的禽流感疫 苗。它具有以下優點痘苗病毒天壇株是中國特有的痘苗病毒毒株，曾作為預防天花流行 的疫苗株在我國大量人群中長期使用過，具有相對毒力較弱、使用安全的特點，是研製適用 於中國應用的基因工程活病毒載體疫苗的理想毒株；痘苗病毒在感染宿主細胞的胞漿中復 制，無致癌性；插入外源基因容量大，可發展聯合疫苗；能準確表達外源蛋白，並對其加工 提呈、刺激機體產生細胞免疫和體液免疫、特別是能夠誘導產生特異性CTL應答；比滅活的 禽流感病毒疫苗更加安全，比反向遺傳技術生產的疫苗更適合工業生產。因此將能及時為 疫苗的交叉保護作用研究提供不同來源的疫苗。

發明內容
本發明的目的之一是克服現有技術的不足，提供一種禽流感減毒痘苗病毒重組毒 株(CGMCC 3429)，由該毒株製備的減毒活疫苗具有良好的安全性和免疫原性。本發明提供了 一種表達AIV抗原的活病毒載體禽流感疫苗，其包含痘苗病毒天壇 株作為載體，其中所述痘苗病毒基因組的血凝素基因插入了至少一種編碼H5m亞型AIV抗 原(如血凝素)的多核苷酸。在本發明的禽流感疫苗中，所述至少一種編碼H5m亞型AIV抗原的多核苷酸來源 於H5m亞型禽流感病毒青海分離株(A/Bar-headed Goose/Qinghai/1/05)。本發明的目的通過以下方法來實現從H5m亞型禽流感病毒青海分離株中克隆 具有良好生物學性狀和免疫效果的HA基因，將AIV HA基因亞克隆入痘苗病毒天壇株轉移 載體中，構建能夠將AIV HA基因轉入重組痘苗病毒同一區域高效表達的重組質粒，將該重 組質粒與痘苗病毒天壇株重組，通過對重組病毒進行篩選，純化，獲得能夠高效，穩定表達 H5N1亞型禽流感病毒HA基因的安全，有效的重組痘苗病毒疫苗毒株。更具體地，本發明提供以下各項1. 一種表達H5W亞型禽流感病毒抗原的重組痘苗病毒，其以減毒痘苗病毒作為 載體，其中在所述減毒痘苗病毒的基因組中插入了至少一種編碼H5m亞型禽流感病毒抗 原的基因。2.根據以上1所述的重組痘苗病毒，其中所述H5m亞型禽流感病毒抗原是禽流感 病毒H5m亞型血凝素(HA)蛋白，優選所述HA蛋白的胺基酸序列如SEQ ID N0:2所示(參 見後附序列表)。3.根據以上2所述的重組痘苗病毒，其中在所述痘苗病毒基因組的血凝素(HA)基 因編碼區中插入所述禽流感病毒H5m亞型血凝素(HA)蛋白的編碼基因，優選所述HA蛋白 的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示(參見後附序列表)。4.根據以上2所述的重組痘苗病毒，其中編碼所述禽流感病毒H5W亞型血凝 素(HA)蛋白的基因來源於H5W亞型禽流感病毒青海分離株(A/Bar-headed Goose/Qinghai/1/05)。5.根據以上1-4中任一項所述的重組痘苗病毒，其中作為載體的所述減毒痘苗病 毒是痘苗病毒天壇株(CCTCC :V200416)。6.根據以上5所述的重組痘苗病毒，其保藏號為CGMCC No. 3似9。7.根據以上1-6中任何一項的重組痘苗病毒在製備禽流感疫苗中的應用。8.根據以上7所述的應用，其中所述禽流感疫苗是通過肌肉注射、滴鼻、或口服施 用的。9.禽流感疫苗試劑盒，其包含以上1-6中任何一項的重組痘苗病毒。


圖 1 :pZCxz (圖 1 (A))禾Π pZCxz-HA (圖 1 (B))的質粒圖譜；圖2 :rVTT-HA的構建過程；圖3 重組痘苗病毒rVTT-HA的螢光鑑定(A.感染rVTT_HA的細胞；B.對照)；圖4 重組痘苗病毒rVTT-HA的免疫染色試驗(A.感染rVTT_HA的細胞；B.對照)；圖5 攻毒後四個不同組別的小鼠體重變化情況(PBS表示對照；i. m.表示為肌肉 注射；i.n.表示為滴鼻；ρ. ο表示為口服)；圖6 攻毒後四個不同組別的小鼠存活情況(PBS表示對照；i.m.表示為肌肉注 射；i.n.表示為滴鼻；P. ο表示為口服)；圖7 :H5N1亞型禽流感病毒A/Bar-headed Goose/Qinghai/1/05株攻毒後免疫及 對照組小鼠每天的存活率(PBS表示對照；i.m.表示為肌肉注射；i.n.表示為滴鼻；p. ο表 示為口服)；圖8 :Η5Ν1亞型禽流感病毒A/Vietnam/1194/04株攻毒後免疫及對照組小鼠每天 的存活率(PBS表示對照；i. m.表示為肌肉注射；i. η.表示為滴鼻；p. ο表示為口服)。
具體實施例方式下文將參考實施例詳細描述本發明，所述實施例僅是意圖舉例說明本發明，而不 是意圖限制本發明的範圍。本發明的範圍由後附的權利要求具體限定。實施例1 表達禽流感病毒HA基因的重組痘苗病毒轉移載體的構建以 Η5Ν1 亞型禽流感病毒 A/Bar-headed Goose/Qinghai/1/05 株 (Jinhua Liu#, et al. Highly pathogenic H5N1 influenza virus infection in migra-tory birds. Science, 2005, 309 :1206)的 RNA 為模板，運用合成引物(引物 1: 5 『 TTGGATCCATGGAGAAAATAGTGCT3，；引物 2 5 『 GGCTCGAGTTAAATGCAAATTCTGC3，；其中引物 1 序列5 『端加入BamH I酶切位點，引物2序列5 『端加入XhoI酶切位點)，通過RT-PCR進 行HA基因擴增，擴增的HA基因包括HA基因的完整閱讀框架。將擴增的HA基因通過BamH I和Xho I酶切位點亞克隆入同樣用BamH I和Xho I 酶切的 PZCxz 穿梭載體中(Huang，X.，B. Lu, W. Yu, Q. Fang，L. Liu, K. Zhuang，T. Shen，H. Wang, P. Tian, L. Zhang, and Z. Chen. 2009. A novel replication-competent vaccinia vector MVTT is superior to MVA for inducing high levels of neutralizing antibody via mucosal vaccination. PLoS ONE 4 :e4180)，該載體含有痘苗病毒特異的雙向啟動子pSYN和pH5，可對外源基因進行高效表達。我們插入的流感病毒HA基因置於痘苗病毒早/晚期 啟動子pSYN下遊，由該啟動子啟動表達。而篩選標記基因綠色螢光蛋白(GFP)則由痘苗病 毒早/晚期啟動子PH5啟動子控制表達。插入的外源基因和GFP基因表達盒的兩側為痘苗 病毒HA基因ORF的編碼序列，將得到得痘苗病毒重組轉移質粒載體命名為PZCxz-HA (質粒 圖譜見圖1(B))。實施例2 表達禽流感病毒HA基因的重組痘苗病毒的構建用製備好的雞胚成纖維細胞接種六孔板，待細胞80%長滿單層後，接種痘苗病毒 天壇株(CCTCC :V200416)，每孔接種量為0. 5M0I。37°C感作2小時，倒掉感染液，用無抗生 素和犢牛血清的DMEM培養液漂洗細胞三次；然後根據脂質體Lipofectamin 2000 (購自 ^witrogen公司)說明書，使用脂質體法將4yg純化的重組轉移質粒PZCxz-HA轉染已感 染痘苗病毒天壇株的雞胚成纖維細胞，37°C感作1小時，倒掉轉染液，加入含5%犢牛血清 的DMEM培養液(DMEM和犢牛血清均購自hvitrogen公司)，37°C，5% CO2溫箱培養48小 時，待細胞出現典型病變，收穫該細胞培養物反覆凍融三次作為轉染種毒。將上述轉染種毒按IO-1UO-2UO-3稀釋度接種80%長滿單層的雞胚成纖維細胞。 37°C感作2小時，倒掉感染液，洗滌細胞，覆蓋含低熔點瓊脂糖的DMEM營養瓊脂培養至 蝕斑出現。挑取綠色螢光蝕斑，放入DMEM培養液中反覆凍融三次，進行新一輪的重組病毒 蝕斑篩選純化。如此重複篩選6次後，即得到純化的重組痘苗病毒rVTT-HA(構建過程見圖 2)。根據布達佩斯條約，該重組痘苗病毒rVTT-HA於2009年11月10日保藏在中國北京的 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國北京市朝陽區北辰西路1號 院3號，郵政編碼100101)，保藏號為CGMCC No. 3429 取篩選純化的重組病毒rVTT-HA接種雞胚成纖維細胞，37°C,5% CO2溫箱培養48 小時，待出現典型病變後，置螢光顯微鏡下觀察，可見感染病毒的細胞發出綠色螢光，而未 接種重組病毒的細胞看不到綠色螢光(見圖幻。為了檢測HA的表達情況，將篩選純化的重 組病毒rVTT-HA接種雞胚成纖維細胞，370C ,5% CO2溫箱培養48小時。待出現典型病變後， 倒掉培養液，用DMEM將細胞清洗三次，然後加入1 1的甲醇/丙酮溶液對細胞進行固定。 五分鐘後棄去固定液，漂洗後加入PBS稀釋的H5特異性單克隆抗體(購自Santa公司)，室 溫孵育1小時，漂洗後加入1 5000稀釋的辣根過氧化物酶標記的抗鼠二抗(購自北京中 杉生物技術有限公司)室溫孵育1小時，漂洗後加入底物溶液進行顯色。結果表明，HA在 感染細胞中得到了較好的表達並且表達產物具有較好的免疫原性(見圖4)。實施例3 重組天壇痘苗病毒禽流感疫苗在動物體內誘導AIV特異性免疫的效力1.疫苗不同免疫途徑的保護性研究1)疫苗產生抗體水平測定以肌注、滴鼻和口服的方式對6周齡SPF Balb/c小鼠(購自北京實驗動物中心) 進行免疫，劑量為每隻3. OX IO6PFU (plaque forming unit，蝕斑形成單位)，共免疫兩次， 間隔為31天。分別於首次免疫後的0天、觀天和45天採血，根據世界動物衛生組織推薦的 方法測定血清中抗H5W病毒的血凝抑制抗體(HI)水平和微量中和抗體水平(http://WWW. oie. int/Eng/Normes/Mmanual/A_00037. htm)。結果發現小鼠的本底血清(即免疫前0天 採集的血清)HI和中和抗體均為陰性。首免(首次免疫)後28天，肌注和滴鼻疫苗免疫組 H5的抗體水平增高，且很均一；而口服疫苗組抗體水平也有升高，但不均一，有2隻小鼠HI抗體為0。在首免後45天及二免後14天，肌注和滴鼻疫苗組H5抗體水平增高，HI的平均 值均達到了 27，中和抗體的平均值分別為623. 25和1112. 5，而口服組HI則在0_28之間，中 和抗體在0-1778之間(見表1)。表1.首免後不同時段HI抗體和中和抗體水平的檢測結果
權利要求
1.一種表達H5m亞型禽流感病毒抗原的重組痘苗病毒，其以減毒痘苗病毒作為載體， 其中在所述減毒痘苗病毒的基因組中插入了至少一種編碼H5m亞型禽流感病毒抗原的基 因。
2.根據權利要求1所述的重組痘苗病毒，其中所述H5m亞型禽流感病毒抗原是禽流感 病毒H5m亞型血凝素(HA)蛋白，優選所述HA蛋白的胺基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.根據權利要求2所述的重組痘苗病毒，其中在所述痘苗病毒基因組的血凝素(HA)基 因編碼區中插入所述禽流感病毒H5m亞型血凝素(HA)蛋白的編碼基因，優選所述HA蛋白 的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
4.根據權利要求3所述的重組痘苗病毒，其中所述禽流感病毒H5W亞型血凝素(HA) 蛋白的編碼基因是通過同源重組插入到痘苗病毒基因組的血凝素(HA)基因編碼區中。
5.根據權利要求2所述的重組痘苗病毒，其中編碼所述禽流感病毒H5W亞型血 凝素(HA)蛋白的基因來源於H5W亞型禽流感病毒青海分離株(A/Bar-headed Goose/ Qinghai/1/05)。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的重組痘苗病毒，其中作為載體的所述減毒痘苗病 毒是痘苗病毒天壇株(CCTCC :V200416)。
7.根據權利要求6所述的重組痘苗病毒，其為重組痘苗病毒rVTT-HA，保藏號為CGMCC 3429。
8.根據權利要求1-7中任何一項的重組痘苗病毒在製備禽流感疫苗中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其中所述禽流感疫苗是通過肌肉注射、滴鼻、或口服施 用的。
10.禽流感疫苗試劑盒，其包含根據權利要求1-7中任何一項的重組痘苗病毒。
全文摘要
本發明涉及一種表達禽流感病毒H5N1亞型血凝素(HA)蛋白的重組痘苗病毒，其可用作禽流感疫苗。具體地，所述禽流感疫苗基於減毒痘苗病毒天壇株(CCTCCV200416)而構建。本發明提供了用於構建所述禽流感疫苗的載體。本發明還涉及使用所述禽流感疫苗的免疫接種方案。
文檔編號A61K39/145GK102140441SQ20101053546
公開日2011年8月3日 申請日期2010年11月4日 優先權日2010年11月4日
發明者陳志偉, 高福 申請人:港大科橋有限公司, 高福