肝細胞生長因子在製備治療多發性硬化症的藥物中的應用的製作方法

2023-06-08 00:19:51 1

專利名稱：肝細胞生長因子在製備治療多發性硬化症的藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫藥 領域，涉及肝細胞生長因子在製藥領域中的新用途。
背景技術：
多發性硬化症(multiple sclerosis, MS)是一種中樞神經系統脫髓鞘疾病，主要危害風華正茂和年富力強的青、中年人群(20-50歲)。全球有超過2，500，000名MS患者，我國MS患者在2004年約65，000例，近幾年呈較快增長趨勢。MS的確切病因至今未明，目前認為與自身免疫相關，其臨床表現為極度疲勞、復視、性功能喪失、肢體麻木、行走困難、癱瘓等，與其它神經疾病的最大區別在於最初臨床症狀反覆「復發-緩解」，頻繁促進更多的功能喪失。目前醫學上對MS尚無根治手段，能夠延緩MS進展的大多數治療藥品均依賴進口，價格昂貴且沒有被醫療保險所覆蓋，從而導致我國MS患者的發病率雖然低於歐美國家，但致殘率卻高於歐美國家。因此，研究開發高效、安全且有自主智慧財產權的MS治療藥物，具有重要意義。當前治療MS的多數方法都是直接抑制免疫反應，但長效的功能恢復很可能取決於中樞神經系統自身的恢復能力，包括更換丟失的少突膠質細胞及修復疾病所致的髓鞘損壞等。最近的研究表明，幹細胞療法是很有發展前途的治療脫髓鞘疾病例如MS的方法，其提供了促進髓鞘有效再生，並在病程中協同免疫攻擊調節的可能性。骨髓間充質幹細胞(Mesenchymal stem cell, MSC)因治療有效、易於獲取、易於擴增以及含有豐富的營養因子等已被用於一系列神經損傷疾病的治療。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是公認的研究人類MS的動物模型。既往研究表明，MSC在EAE模型中可以促進疾病功能改善，減少病變負荷，但其作用機制尚不清楚。肝細胞生長因子(HGF)是一種由細胞間質起源的多效細胞因子，最初被稱為肝細胞的主要促分裂原，隨後被確定存在於多個組織包括中樞神經系統中。在中樞神經系統中，HGF表達於發育過程中，也作為神經營養因子表達於成人。既往研究顯示，HGF可以促進血管生成和細胞存活，能夠提高腎臟和肝臟再生以及防止腎功能衰竭，還能延長心臟移植的存活率和改善心肌梗塞後心肌的功能。但目前關於HGF與MS之間的關係尚未見文獻報導。

發明內容
有鑑於此，本發明的目的在於闡明MSC促進EAE模型疾病功能改善的作用機制以及HGF在其中所起的作用，進而考察HGF是否能夠用於製備MS治療藥物。研究結果顯示，在髓鞘少突膠質細胞糖蛋白35-55多肽片段(M0G35-55)誘導的MS動物模型EAE中，給予含有人MSC旁分泌物質的條件培養液(MSC-CM)能夠降低EAE功能缺陷，並在功能性細胞損傷時促進少突膠質細胞和神經元的發育，其中發揮主要作用的是MSC釋放的HGF ;單獨給予HGF的作用與MSC-CM相似，同樣可以刺激少突膠質細胞和神經元的發育及遷移，增強髓鞘修復能力，減少MS動物模型EAE的病變負荷，促進疾病功能恢復，且給予EAE模型短暫的HGF治療即能持續地引導疾病功能改善。因此，HGF及含有HGF的MSC-CM都可以用於製備治療MS (包括EAE)的藥物，用於MS的臨床治療。本發明的有益效果在於本發明提供了 HGF和含有HGF的MSC-CM在製備治療MS的藥物中的應用，不僅拓寬了 HGF和MSC-CM的應用範圍，而且為MS的臨床治療提供了一種有效藥物，同時有助於新型高效MS治療藥物的進一步深入開發。


為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一步的詳細描述，其中
圖I為神經幹細胞分別在對照培養基(control)和MSC-CM中的培養分化情況，其中A為不同培養條件下各種神經細胞的免疫螢光染色分析圖，B為不同培養條件下各種神經細胞佔細胞總數的比例分析圖。圖2為分別給予PBS和MSC-CM治療的EAE模型小鼠的臨床評分比較，圖中箭頭表示MSC-CM的首次給藥日。圖3為分別給予PBS和MSC-CM治療的EAE模型小鼠的脊髓切片觀察(LFB染色)。圖4為各種神經細胞分別在MSC-CMicm、MSC-CM_、MSC-CM_和MSC-CMiqcm中的培養和從神經幹細胞分化情況。圖5為分別給予對照培養基(control )、MSC-CM50kll和MSC-CMiwkll治療的EAE模型小鼠的臨床評分比較，圖中箭頭表示MSC-CM5_和MSC-CMiwkll的首次給藥日。圖6為分別給予對照培養基(control)和MSC-CMicicm治療的EAE模型小鼠脊髓單核細胞產生細胞因子水平分析。圖7 為 Western Blot 檢測 MSC-CM1Q_ 中的 HGF，其中 Ctl 為無 MSC 但按照 MSC-CM的製備方法製得的對照培養液，Mkr為蛋白分子量標準，#1、#2、#3為3個MSC-CM1^d樣本。圖8為分別給予PBS (control)和靜脈、腹腔注射低劑量、高劑量重組HGF治療的EAE模型小鼠的臨床評分比較，圖中箭頭I和2分別表示靜脈、腹腔注射高劑量(IOOng/只)重組HGF的首次給藥日，箭頭3表示靜脈注射低劑量(50ng/只)重組HGF的首次給藥日。圖9為分別給予PBS和重組HGF治療的EAE模型小鼠的脊髓切片觀察。圖10為電鏡檢測分別給予PBS和重組HGF治療的EAE模型小鼠的脊髓脫髓鞘修復情況。圖11為給予重組HGF治療第3、11、17天的EAE模型小鼠的脊髓組織病理學觀察(Toludin blue 染色)。圖12為給予重組HGF或MSC-CMiqcm治療前24小時分別給予cMet抗體(HGF的唯一受體)和對照IgG抗體的EAE模型小鼠的臨床評分比較，圖中箭頭1、2、3分別表示重組HGF的3次給藥日，箭頭4表示MSC-CMicitlkll的給藥日。圖13為給予重組HGF治療前24小時分別給予cMet抗體和對照IgG抗體的EAE模型小鼠脊髓中細胞因子水平分析。圖14為給予重組HGF治療前24小時分別給予cMet抗體和對照IgG抗體的EAE模型小鼠的ELISP0T分析。圖15為給予MSC-CM1(I_治療前24小時分別給予cMet抗體和對照IgG抗體的EAE模型小鼠脊髓中細胞因子水平分析。、
圖16為給予MSC-CM1(I_治療前24小時分別給予cMet抗體和對照IgG抗體的EAE模型小鼠的ELISP0T分析。圖17為神經幹細胞分別在對照培養基(contro I)、MSC-CMlookll、重組HGF溶液、MSC-CM100kI)+cMet抗體、重組HGF溶液+cMet抗體中的培養分化情況，其中A為不同培養條件下各種神經細胞的免疫螢光染色分析圖，B為不同培養條件下各種神經細胞佔細胞總數的比例分析圖。圖18為MSC-CM1(I_刺激神經幹細胞向少突膠質細胞和神經元分化，但該行為能夠被cMet抗體和HGF抗體分別阻斷。圖19為重組HGF刺激神經幹細胞遷移，但該行為能夠被cMet抗體阻斷。 圖20為分別給予PBS和重組HGF治療的EAE模型小鼠的脊髓組織切片觀察(綠色螢光蛋白標記髓鞘)，其中A為EAE脊髓組織經HGF治療後病灶大小和細胞遷移數量的螢光顯微圖，B為脊髓組織損傷區域的數量及損傷區域細胞數的定量分析。
具體實施例方式以下將參照附圖，對HGF對MS的治療作用及其效果進行詳細的描述。實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件。優選實施例中所述的MSC-CM是通過以下方法製得取正常人骨髓20ml，加入含10%(v/V)小牛血清和1000mg/L D-葡萄糖的DMEM低糖培養基25ml，2000rpm離心5分鐘，去除上清並計數細胞，按照每2 X IO8個細胞加入5ml淋巴細胞分離液的比例加入淋巴細胞分離液，480g離心15分鐘，取第二層淋巴細胞(約10-14ml)至50ml離心管中，加入含10%(v/V)小牛血清和1000mg/L D-葡萄糖的DMEM低糖培養基50ml，完全混合，450g離心5分鐘，去除上清並計數細胞，加入含10%(v/v)小牛血清和1000mg/L D-葡萄糖的DMEM低糖培養基IOml，接種細胞至75cm2培養瓶中，每瓶接種I. 5 X IO7個細胞、15ml培養基，3天後換液，此後每隔3-4天換液I次，第15天收集培養上清，即得MSC-CM，4°C保存備用。一、MSC-CM調節神經發育與EAE模型的疾病進展
將神經幹細胞培養於MSC-CM中，同時設置對照培養基組。本發明中所述的對照培養基均指的是含有10%(v/v)小牛血清和1000mg/L D-葡萄糖的DMEM低糖培養基。結果發現，神經幹細胞在PBS中培養3天後，神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)陽性的星形膠質細胞超過30%，A2B5陽性的少突膠質細胞前體細胞約佔30%，04陽性的少突膠質細胞約佔25%，β -微管蛋白(β -Tubulin)陽性的神經元少於5% ;而神經幹細胞在MSC-CM中培養3天後，GFAP陽性的星形膠質細胞降至約20%，A2B5陽性的少突膠質細胞前體細胞增至約35%，04陽性的少突膠質細胞增至約50%，β -微管蛋白陽性的神經元增至約25% (圖I)。 取M0G35-55免疫構建的EAE模型小鼠，從免疫首日開始，每日進行臨床評分，評分標準如下0分，無臨床症狀；0. 5分，尾部無力；1分，尾部癱瘓；2分，協調性運動消失；2. 5分，單側後肢癱瘓；3分，雙側後肢癱瘓；3. 5分，雙側後肢癱瘓伴前肢無力；4分，前肢癱瘓；5分，瀕死或者死亡。免疫後第17天，當EAE模型小鼠處於疾病高峰期時，開始給予靜脈注射MSC-CM治療，同時設置PBS對照組，治療共持續35天。需要說明的是，本發明中都是在EAE模型小鼠處於疾病高峰期時進行給藥治療，但由於每批實驗小鼠的體質不一定相同，到達EAE疾病高峰期的時間不一定相同，因此每次給藥治療的時間不一定相同。上述實驗發現，給予PBS治療的EAE模型小鼠的臨床評分基本穩定在2. 5^3之間；而給予MSC-CM治療的EAE模型小鼠在疾病高峰期的功能性缺陷急劇減少，治療結束後的臨床評分基本穩定在I左右(圖2)。進一步觀察分別給予PBS和MSC-CM治療的EAE模型小鼠的脊髓切片(LFB染色)，可見經MSC-CM治療的EAE模型小鼠的脊髓脫髓鞘區域減少(圖3)。上述實驗結果說明，MSC-CM具有調節神經發育與EAE模型疾病進展的活性。二、MSC-CM調節神經發育與EAE模型疾病進展的活性來源於50_100kD部分
對MSC-CM進行片段大小分級研究，同時設置對照培養基組。結果發現，分子量為I-IOkD 的部分 MSC-CM(用 MSC-CMltlkll 表示)和分子量為 l_30kD 的部分 MSC-CM(用 MSC-CM3tlkll表示)沒有顯著改變體外培養的神經細胞的發育；用分子量為l_50kD的部分MSC-CM (用MSC-CM5tlkll表示)培養神經幹細胞雖然可見星形膠質細胞比例減少、少突膠質細胞比例增力口，但其不能調節EAE模型小鼠體內的疾病進展；而分子量為I-IOOkD的部分MSC-CM (用·鼠的疾病負荷，且疾病功能改善情況與完全MSC-CM相似(圖4、圖5)。進一步，分離分別給予對照培養基和MSC-CMiwkll治療的EAE模型小鼠的脊髓單核細胞，測定其產生炎性細胞因子的水平。結果發現，與對照培養基相比，EAE模型小鼠經MSC-CM1(I_治療後,促炎症細胞因子幹擾素-Y (IFN-Y )、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)和白介素-17 (IL-17)的水平降低，而抗炎症細胞因子IL-10的水平增加(圖6)。上述結果說明，MSC-CM調節神經發育與EAE模型疾病進展的活性來源於50_100kD部分。三、HGF調節EAE模型疾病進展
免疫印跡分析確定，在多個MSC-CMicitlkll樣本中均包含HGF (圖7)。HGF由62_65kD的a鏈和34kD的β鏈組成，分子量在50-100kD範圍內，由活化的MSC所分泌，推測其可能是MSC-CM中調節神經發育與EAE模型疾病進展的活性分子。為了確定HGF是否具有上述活性，分別給予M0G35-55免疫誘導的處於疾病高峰期的EAE模型小鼠靜脈注射低劑量(50ng/只)或高劑量(IOOng/只)的重組HGF治療，同時設置PBS對照組，每隔I天給藥I次，共給藥3次，監視免疫後30天的臨床評分。結果發現，給予PBS治療的EAE模型小鼠的臨床評分基本穩定在3 3. 5之間；而給予低劑量或高劑量重組HGF治療的EAE模型小鼠的臨床評分減少，其中高劑量組的疾病功能改善更好(圖8)。為了確定給藥的最有效途徑，同時考察了腹腔注射高劑量(IOOng/只)重組HGF的治療效果。結果發現，靜脈注射重組HGF治療的EAE模型小鼠在免疫30天後的臨床評分為I. 5，而腹腔注射重組HGF治療的EAE模型小鼠在免疫30天後的臨床評分為2. 4，說明靜脈注射給藥的治療效果更好(圖8)。取分別給予PBS和重組HGF治療的EAE模型小鼠在免疫30天後的脊髓切片，分別用LFB、H&E和Tol Blue染色，觀察發現，給予PBS治療的EAE模型小鼠在免疫30天後沿著脊髓出現大量的白質病變，而給予重組HGF治療的EAE模型小鼠的脫髓鞘程度大幅度降低同時白質區域大部分相對正常；給予PBS治療的EAE模型小鼠在白質區域的炎性細胞浸潤程度和密度也低於給予重組HGF治療的EAE模型小鼠(圖9)。用甲苯胺藍標記髓鞘完整性，電子顯微鏡分析表明，給予重組HGF治療的EAE模型小鼠的殘餘病灶區內，無髓軸突數量減少，小直徑髓鞘軸突數量相對增加(圖10)。用M0G35-55免疫PLP-EGFP轉基因小鼠(該小鼠的髓鞘蛋白前脂蛋白(PLP)被增強型綠色螢光蛋白(EGFP)所標記)構建EAE模型小鼠，分別給予PBS和重組HGF治療，再取脊髓組織切片置螢光顯微鏡下觀察(髓鞘完整的細胞顯示綠色螢光)，可見給予重組HGF治療後，EAE模型小鼠的脊髓損傷區域明顯減少，髓鞘修復細胞數量顯著增多(圖20)。這些研究表明HGF對EAE模型小鼠有顯著的增強脊髓髓鞘恢復的作用，其誘導的疾病功能改善與組織學改善密切相關。為了進一步驗證HGF是否能抑制EAE模型的病理進程或增強功能恢復，分別處死給予重組HGF治療第3、11、17天的EAE模型小鼠，取脊髓組織進行病理學分析。結果發現，給予重組HGF治療3天後，EAE模型小鼠的脊髓仍然有廣泛的脫髓鞘病變與顯著的細胞浸潤；治療11天後，雖然有殘餘的脫髓鞘病變和少數炎性細胞，但病變在很大程度上得到解決；治療17天後，所有纖維包括小直徑纖維都處於廣泛的髓鞘再生中(圖11)，說明HGF確實能夠減少EAE模型的病理壓力，同時增強髓鞘修復。四、HGF和MSC-CM調節EAE模型疾病進展的活性通過cMet介導
在其它系統中HGF的生物效應主要通過酪氨酸激酶受體cMet介導，cMet也是目前唯一已知的HGF受體。為了確定HGF調節EAE模型疾病進展的活性是否也通過cMet介導，本發明先在M0G35-55免疫後第13天給EAE模型小鼠2次注射cMet抗體或對照IgG抗體(2次注射間隔時間為6小時，2X250ng/只)，再在免疫後第14、16、18天給予3次靜脈注射重組HGF治療。結果發現，給予IgG抗體-HGF的EAE模型小鼠在24小時後可見明顯的疾病功能改善，5-7天後趨於穩定，而給予cMet抗體-HGF的EAE模型小鼠在14天內未見任何顯著的疾病功能改善(圖12)。細胞因子水平分析顯示，給予HGF-IgG抗體的EAE模型小鼠表達相對低水平的促炎症細胞因子IFN-Y、TNF-a、IL_2和IL-17，而這些因子的表達水平在給予HGF-cMet抗體的EAE模型小鼠中大大提升；同樣的，給予HGF-IgG抗體的EAE模型小鼠表達相對高水平的抗炎症細胞因子IL-10，而IL-10的表達水平在給予HGF-cMet抗體的EAE模型小鼠中大大降低(圖13)。ELISP0T分析顯示，HGF誘導細胞產生抗炎症細胞因子IL-10，而cMet抗體逆轉細胞產生促炎症細胞因子IFN-Y和IL-17 (圖14)。上述結果證實了 HGF調節EAE模型疾病進展的活性是通過cMet介導。為了確定MSC-CM調節EAE模型疾病進展的活性是否也通過cMet介導，本發明先在M0G35-55免疫後第15天給EAE模型小鼠2次注射cMet抗體或對照IgG抗體(2次注射間隔時間為6小時，2 X 250ng/只)，再在免疫後第16天給予I次靜脈注射MSC_CM1(I_治療。結果發現，給予IgG抗體-MSC-CM1(I_的EAE模型小鼠出現快速且持續的功能恢復，並伴有相關的重要組織學改善，而給予cMet抗體-MSC-CMiwkll的EAE模型小鼠在15天內未見明顯的疾病功能改善和組織學改善(圖12)。細胞因子水平分析顯示，給予IgG抗體-MSC-CMicitlkD的EAE模型小鼠促炎症細胞因子IFN- Y ,TNF- a、IL-2和IL-17表達減少，抗炎症細胞因子IL-10和IL-4表達增多(圖15)。ELISP0T分析顯示，MSC-CM1(l(lkD在很大程度上扭轉了 cMet抗體阻斷後的IFN-Y、IL-17和IL-10分泌頻率(圖16)。上述結果證實了 MSC-CM調節EAE模型疾病進展的活性是通過cMet介導，也證實了 MSC-CM調節EAE模型疾病進展的活性主要來源於其中包含的HGF。五、HGF和MSC-CM調節神經發育的活性通過cMet介導
為了確定HGF是否具有調節神經發育的活性，以及HGF和MSC-CM調節神經發育的活性是否也通過cMet介導，分別用對照培養基、MSC-CMicicm、重組HGF溶液、MSC-CM1(I_ +cMet抗體、重組HGF溶液+cMet抗體培養神經幹細胞，對比不同種類的神經幹細胞衍生細胞佔細胞總數的比例。結果發現，用對照培養基培養神經幹細胞7天後，A2B5陽性的少突膠質細胞前體細胞、04陽性的少突膠質細胞和微管蛋白陽性的神經元的比例低於10%，而GFAP陽性的星形膠質細胞比例大於60% ;相比之下，用MSC-CMiwkll培養神經幹細胞7天後，Α2Β5陽性的少突膠質細胞前體細胞比例增加至約25%，04陽性的少突膠質細胞的比例大於30%, β -微管蛋白陽性的神經元比例大於40%，而GFAP陽性的星形膠質細胞的比例急劇降低至約10% ;類似的細胞比例變化也出現於重組HGF培養組(45ng HGF/3X IO5個細胞)，只是GFAP陽性的星形膠質細胞的減少比MSC-CM1Q_培養組更加明顯；而在MSC-CM1Q_培養組和重組HGF培養組中加入cMet抗體共孵育，培養的細胞組成與常規培養基相近；說明HGF和MSC-CM都可以刺激少突膠質細胞前體細胞、少突膠質細胞和神經元增殖，抑制星形膠質細胞增殖，但該行為能夠被cMet抗體和HGF抗體所阻斷(圖17)。進一步觀察結果顯示，MSC-CMlookll能夠刺激神經幹細胞向少突膠質細胞和神經元分化，但該行為同樣能夠被cMet抗體和HGF抗體所阻斷(圖18)。從而證實了 HGF和MSC-CM調節神經發育的活性都是通過cMet介導，也證實了 MSC-CM調節神經發育的活性主要來源於其中包含的HGF。六、HGF刺激EAE源性神經幹細胞遷移通過cMet介導· 文獻報導，MSC不僅促進少突膠質細胞增殖，而且刺激神經幹細胞遷移。為了評估HGF是否也具有刺激EAE源性神經幹細胞遷移的活性，以及HGF刺激EAE源性神經幹細胞遷移的活性是否也通過cMet介導，本發明從EAE模型小鼠的腦室下區獲取神經幹細胞，對比細胞在HGF和HGF+cMet抗體環境中的遷移能力。結果發現，重組HGF能夠刺激神經幹細胞遷移，但該行為能夠被cMet抗體所阻斷(圖19)，說明HGF刺激EAE源性神經幹細胞遷移的活性也是通過cMet介導。上述實驗中所用的MSC-CM系原代MSC的條件培養液，本發明還考察了傳代MSC的條件培養液在調節神經發育與EAE模型疾病進展方面的活性。結果顯示，採用10代以內傳代MSC製得的條件培養液同樣具有調節神經發育與EAE模型疾病進展的活性，只是與原代相比作用起效較慢。綜合上述研究結果，MSC-CM具有調節神經發育與EAE模型疾病進展的活性，該活性來源於MSC所釋放的HGF，單獨給予HGF同樣可以刺激少突膠質細胞和神經元的發育及遷移，增強髓鞘修復能力，減少EAE病變負荷，促進疾病功能恢復，且給予EAE模型短暫的HGF治療即能持續地引導疾病功能改善，而MSC-CM和HGF調節神經發育與EAE模型疾病進展的活性都是通過cMet介導。
權利要求
1.肝細胞生長因子在製備治療多發性硬化症的藥物中的應用。
2.根據權利要求I所述的應用，其特徵在於，所述多發性硬化症為實驗性自身免疫性腦脊髓炎。
3.含有肝細胞生長因子的骨髓間充質幹細胞條件培養液在製備治療多發性硬化症的藥物中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述多發性硬化症為實驗性自身免疫性腦脊髓炎。
全文摘要
本發明公開了肝細胞生長因子(HGF)及含有HGF的骨髓間充質幹細胞(MSC)條件培養液(MSC-CM)在製備治療多發性硬化症(MS)的藥物中的應用，研究結果顯示，在髓鞘少突膠質細胞糖蛋白35-55多肽片段(MOG35-55)誘導的MS動物模型EAE中，給予含有人MSC旁分泌物質的MSC-CM能夠降低EAE功能缺陷，並在功能性細胞損傷時促進少突膠質細胞和神經元的發育，其中發揮主要作用的是MSC釋放的HGF；單獨給予HGF的作用與MSC-CM相似，同樣可以刺激少突膠質細胞和神經元的發育及遷移，增強髓鞘修復能力，減少MS動物模型EAE的病變負荷，促進疾病功能恢復，且給予EAE模型短暫的HGF治療即能持續地引導疾病功能改善；本發明不僅拓寬了HGF和MSC-CM的應用範圍，而且為MS的臨床治療提供了一種有效藥物，同時有助於新型高效MS治療藥物的進一步深入開發。
文檔編號A61P25/00GK102716467SQ20121013027
公開日2012年10月10日 申請日期2012年4月28日 優先權日2012年4月28日
發明者白蓮花 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院