雞蛋清殼素的分離方法

2023-06-08 00:03:51 2

專利名稱:雞蛋清殼素的分離方法
本發明涉及雞蛋清殼素的分離，含有殼素(Cystatin)的抗病毒劑及其作為病毒蛋白質水解過程抑制劑的應用。
已知生物組織含有蛋白(水解)酶以及相應的抑制劑，它們參與生物體在機體正常及致病的情況下的各種生物功能的控制和調節過程。因此各種動物病毒的蛋白(水解)酶，例如細小RNA(核糖核酸)病毒，在病毒的複製中起著重要的作用。病毒蛋白酶將前體蛋白分解成較小的產物，並將分解產物裝配成更大、更複雜的病毒結構(J.Putnak and B.Phillips，Microb.Rev.45，287(1982))。因此，蛋白酶抑制劑也表現為潛在的治療物。
已知細小RNA病毒蛋白酶對巰基蛋白酶抑制劑非常敏感，例如汞製劑，碘乙酸鹽，α2-巨球蛋白及其它(B.D.Korant，K.Lonberg-Holm and P.Lacolla，inTargets for the design of antiviral agents，E.De Clercg and R.T.Walker，eds.，Plenum Press，pp.61-98，1984)。巰基蛋白酶的一種特異抑制劑也是低Mr蛋白雞殼素，它是從蛋清中分離出來的(A.Anastasi，M.A.Brown，A.A.Kembhavi，M.J.H.Nicklin，C.A.Sayers，D.C.Sunter and A.J.Barrett，Biochem.J.211，129-138，1983;V.Turk，et al.，Hoppe-Seyler′S Z.Physioi.Chem.364，1487-1496，1983)。雞殼素以兩種形式被分離出來，其等電點不同，PI5.6和6.5。其胺基酸序列已經確定(V.Turk et al.，Biochem.J.214，813-817，1984)。已發現雞卵殼素為植物蛋白酶木瓜蛋白酶和哺乳動物蛋白酶組織蛋白酶B.H和L的有效抑制劑(A.Anastasi et al.，Biochem.J.211，129-138.1983)。
雖然已經公開的方法業已給出了純的產物，但產率相當低。
因此，作為本發明的首要方面，我們提出了一種新的，從天然來源的雞蛋清中分離雞殼素的方法。將雞蛋清水溶液加熱至最高80℃(60-70℃間任意溫度)沉澱非活性蛋白質。溶液隨後冷卻並離心。往上清液中加入lM Nacl並在羧甲基(Cm)木瓜蛋白酶-Sepharose 4B上在PH8.0，1.0M Nacl存在的情況下用0.01M Tris緩衝液進行親和層析。抑制劑殼素用0.01M PH11.5 NaoH洗脫，超濾或冷凍乾燥濃縮，並在0.01M Tris緩衝液PH8.0的條件下於Sephadex G50上分離。收集抑制活性成份，超濾濃縮，在單Q柱上(Pharmacia Sweden)以起始緩衝液為0.01M PH8.0 Tris的快速蛋白液相層析(FPLC)的方法分離，往起始緩衝液中加入0.5M Nacl洗脫出雞殼素抑制劑。該抑制劑被洗脫出兩個抑制峰，PI值為5.6和6.5，用等電聚焦法測定。
本發明應用的所有化學製劑都是商業上已知並可買到的。本發明分離雞殼素的方法技術上簡單而且比到目前為止所描述過的方法得到的產率更高。
在我們的試驗中，我們驚奇地發現雞蛋清殼素抑制細小RNA病毒的水解蛋白活性。細小RNA病毒包括脊髓灰質炎病毒，鼻病毒及A型肝炎的致病因子與口足病病原。
雞蛋清殼素的抑制活性可被列於表中的結果所證實。因此本發明的下一個目的就是雞蛋清殼素在治療細小RNA病毒侵染的哺乳動物和鳥類，以及其它所有的由相應病毒感染的生物體上的應用。
本發明的另一目的是含有生理上可接受劑量，並對細小RNA病毒水解蛋白活性的抑制有效的雞蛋清殼素的抗病毒劑。這些抗病毒劑的配製和應用在本專業領域技術人員的知識和經驗的範圍之內。
應該指出的是，雖然在本申請當中只討論了根據本發明方法製備的雞蛋清殼素，但我們還提出了用遺傳工程方法製取的雞殼素的應用。
本發明用下述實例進行說明，但不局限於此。
雞蛋清殼素的分離實施例1100個雞蛋的蛋清用等體積蒸餾水稀釋，用韋林氏攪切器勻漿。溶液在水浴中於60℃下加熱，十五分鐘後在冷水浴中冷卻。沉澱物在Sorvall RC-2B凍凍離心機上以15000×g離心30分鐘，往上清液中加入Nacl(結晶)至1M。溶液隨之分成五等份，加到在一玻璃燒杯中預備好的CM-木瓜蛋白酶Sepharose 4B柱上(按照Anastasi.A.et al.，Biochem.J.211，129-138，1983製備)，用含有1M Nacl的0.01M PH8.0 Tris緩衝液洗，隨後用0.01M PH11.5NaoH洗脫雞殼素。所得組份在Amicon YM-5薄膜上超濾濃縮至原體積的1/5，然後加到用含有1M Nacl的0.01M PH8.0 Tris緩衝液平衡過的SephaderG50柱上。收集洗脫下來的含有抑制活性的蛋白組份，在Amicon YM-5超濾膜上濃縮至50ml，然後用0.01M PH8.0 Tris為起始緩衝液，隨之加入0.5M Nacl形成梯度於10ml快速蛋白液相層析單Q柱上層析分離洗脫之。抑制劑被洗脫出兩個PI值為5.6和6.5的峰。總產率相當於蛋清中雞蛋殼素起始含量的32%。
雞殼素抑制活性以木瓜蛋白酶為試驗酶用苯甲醯-外消旋-精氨酸-2-萘醯胺(Bz-Arg Nap)為底物按已知方法(A.J.Barrett，Anal.Biochem.37，280-293，1972)測定。1單位抑制活性相當於1μg木瓜蛋白酶完全抑制。
實施例2100個蛋的蛋清用等體積蒸餾水稀釋，用韋林氏攪切器勻漿。溶液於水浴中加熱至80℃，15分鐘後在水浴中冷卻。以下試驗程序與實施例1所述相同。產率約為27%，比實施例1稍低一些。
生物活性試驗在人HeLa細胞中應用雞蛋清殼素抑制病毒複製本試驗用人HeLa細胞O系(B.korant et al，Vivology，48，71-86，1972)或人WISH細胞(Americal Type Culture Colletion CCL25)進行。
細胞單層培養在如前所述(B.korant et al，Virology48，71-86，1972)的塑料北特利平皿中的加有10%小牛血清的Mc Coy5A培養基中。試驗中用的病毒是Mahony品系的脊髓灰質炎Ⅰ型病毒和(在複製過程中不需要大量蛋白分解的棒狀病毒品種)皰疹口炎病毒。
病毒培養及感染滴定按標準方法進行(B.Korant etal，Virology 48，71-86 1972)。病毒感染或對照細胞的標記通過往無蛋氨酸培養基中加入35S-L-Metionina(1200Ci/mmole)至50μCi/ml的比活性而完成。標記蛋白的分析在含有上述(B.Korant et al，Proc Natl.Acad.Sci.USA，76，2992-2995，1979)十二烷基磺酸鈉(SDS)的聚丙烯醯胺平板凝膠中進行。染色、乾燥的凝膠用Dupont Cronex 4X-光膠片自動曝光照相。
結果列於下表。
表用雞蛋清殼素(100μM)處理的人HeLa細胞中脊髓灰質炎病毒複製的抑制病毒 抑制%脊髓灰質炎Ⅰ型病毒(Mahony) 80%+/-5%1A型鼻病毒 73%+/-8%皰疹口炎病毒 7%+/-4%表中所得結果證明，雞蛋清殼素明顯地顯示出抑制脊髓灰質炎病毒和鼻病毒複製的抗病毒作用。
權利要求
1.一種分離雞蛋清殼素的方法，其特徵在於將雞蛋清水溶液加熱至(最高)溫度為80℃，在瓊脂糖上色譜分離，隨後在葡聚糖凝膠分子篩上色譜分離，並在最後一步用快速蛋白液相層析型離子交換色譜法純化。
2.根據權利要求
1所述的方法，其中所述的瓊脂糖優先選用羧甲基木瓜蛋白酶-瓊脂糖4B。
3.根據權利要求
1所述的方法，其中所述的葡聚糖凝膠優先選用葡聚糖凝膠-G-50。
專利摘要
本文提出了一種從雞蛋清水溶液中分離雞蛋清殼素的新方法，通過將其加熱至最高80℃，在羧甲基木瓜蛋白酶-Sepharose4B上層析，在Sephadex G-50上分離，用快速蛋白液相層析型的離子交換層析法純化。進一步揭示了新製劑及應用雞蛋清殼素治療生物體病毒感染的方法，特別是哺乳動物和鳥類細小RNA病毒感染的療法。
文檔編號B01D15/00GK86100617SQ86100617
公開日1986年11月12日 申請日期1986年1月16日
發明者維託·吐克, 佐茨·布辛 申請人:克爾克製藥廠有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan