一種適用於螢光偏振技術中檢測單核苷酸多態性的方法

2023-05-29 14:46:01

專利名稱：一種適用於螢光偏振技術中檢測單核苷酸多態性的方法
技術領域：
本發明涉及螢光偏振檢測技術領域，具體涉及一種適用於螢光偏振技術中 檢測單核苷酸多態性的方法。
背景技術：
單核苷酸多態性(SNP)指在某一人群的正常個體的基因組內特定核酸位
置上有著不同鹼基，是人類DNA序列的差異，即染色體基因組序列中單核苷酸
改變時發生的DNA序列的多態性變化，人類三等位和四等位基因的SNPs是非
常少見的，因此SNPs也被稱作雙等位基因標記。人類基因組30億個鹼基中，
大約每300到500個鹼基就有一個SNP發生，整個人類基因組大約有2000萬
SNP。 SNP既能在編碼基因又能在非編碼基因中發生，對人類個體的表型(形態、
代謝和免疫狀態等)，個體對環境致病因素的易感性、抵抗力、藥物和治療的
反應敏感性產生重大影響，其檢測對生物醫學研究、藥物開發、醫學診斷、生
物醫學和法醫學發展有重要意義。
對SNP的檢測可為新的治療方法、預計藥物療效、預警病情發展提供基礎， 對決定常見疾病相關的易感等位基因、基因型(DNA序列)與表現型(疾病和健 康)的關係及個性化藥物及健康計劃的實現提供堅實後盾，臨床意義重大。 目前，RFLP、等位基因特異的寡核苷酸雜交、寡核苷酸連接分析、等位基因特 異的PCR、 DNA測序等技術都可分別進行SNP及基因變異檢測，但這些方法多 需要電泳和多步後處理，費時費力而效率有待提高。或儀器設備昂貴，難以大 規模推廣應用。
1999年，Chen等將螢光偏振檢測與PCR擴增及末端終止子延伸反應結合用於單核苷酸多態性(SNP)檢測。該方法是在純化的PCR擴增產物中，加入3' 端緊鄰SNP位點上遊的SNP引物，兩種螢光標記的Acyclo終止鹼基，當某熒 光標記的Acyclo終止鹼基與模板中SNP位點鹼基互補摻入時，該螢光FP值增 加；反之，無摻入，FP值小。但因該方法涉及擴增、消化純化、滅活、雜交延 伸分管等步驟，這些步驟分步進行，不僅成本高，而且在操作過程因需要更換 反應管而易發生汙染，影響檢測結果的準確性。這些問題都限制了該方法的推 廣應用。

發明內容
本發明要提供一種適用於螢光偏振技術中檢測單核苷酸多態性的方法，以 克服現有技術存在的成本高、操作步驟繁瑣、易發生汙染和影響檢測結果準確 性問題。
為克服現有技術存在的問題，本發明的技術方案是
一種適用於螢光偏振技術中檢測單核苷酸多態性的方法，所採用的試劑由 MgC12， IOX反應緩衝液，TaqDNA聚合酶，dNTPs，靶基因DNA引物，靶區域的3' 端帶螢光標記的DNA探針組成；
將上述試劑進行擴增所述PCR擴增試劑包括5 10倍的PCR緩衝液；濃度 各為2. 0 2. 5咖ol/L的dGTP、 dCTP、 dATP和dTTP，濃度各為O. 05-2. 0 y mol/L 的靶基因的上遊引物、下遊引物、3'端帶螢光標記的探針以及l-2U/ul的 TaqDNA聚合酶，其中上遊引物與下遊引物濃度的之比為5 10: 1 ;所述擴增 反應條件是94-95。C變性4-10min後，95 0 C孵育0-l秒，60° C孵育0-1秒， 72° C孵育10秒，35-45個循環，最後一個循環無72。 C孵育。
由於本發明應用非對稱PCR、 3'端螢光標記的探針及縮短的擴增循環條件，
實現了擴增與探針和單鏈擴增產物的雜交在閉管中一步完成。 與現有技術相比，本發明的優點是1、 本方法步驟簡單，操作簡單；擴增雜交閉管中一步進行，不易發生汙 染，結果準確。
2、 結果分析簡單，結果判斷時僅需數字比較，易標準化、自動化，應用
範圍廣；可用於檢測臨床血液或組織標本；
3、 成本低，不需任何專用試劑及螢光淬滅或微溝槽結合劑。
具體實施方式
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下面將結合實施例對本發明能夠進行詳細地描述。
實施例l:在對鉑類耐藥預測相關ERCC1基因第4個外顯子第118位密碼子上 C/T單核苷酸多態性的檢測中，
1、 所用的試劑是由MgC12， IOX反應緩衝液，TaqDNA聚合酶，dNTPs， ERCC1基因第4個外顯子DNA引物，第118位密碼子上C/T單核苷酸多態性的DNA探 針組成。
2、 將上述試劑按非對稱PCR方法進行擴增反應在25uL體系中進行，加入 PCR緩衝液2. 5叱，加入1.0U TaqDNA聚合酶；濃度分別為2. 0 mmol/L的dGTP、 dCTP、 dATP和dTTP;濃度各為0.5uM的ERCCl上遊引物和3'端帶螢光標記的探 針混合物，濃度為0.05uM的ERCC1下遊引物。
擴增反應條件是94'C變性5min後，95° C孵育l秒，60° C孵育l秒，72° C 孵育10秒，45個循環，最後一個循環無72。 C孵育。然後對擴增產物進行螢光 偏振值的檢測，根據螢光偏振值的高低變化判讀臨床血液或組織標本的C/T單 核苷酸多態性檢測結果。
實施例2:在對鉑類藥物敏感性預測相關XRCCl基因Argl94Trp多態性的檢 測中，1、 所用的試劑是由MgC12， IOX反應緩衝液，TaqDNA聚合酶，dNTPs, XRCC1基因DNA引物，第194位密碼子上單核苷酸多態性的DNA探針組成。
2、 將上述試劑按非對稱PCR方法進行擴增反應在25uL體系中進行，加入 PCR緩衝液2. 5叱，加入2. 0U TaqDNA聚合酶；濃度分別為2. 5mmol/L的dGTP、 dCTP、 dATP和dTTP;濃度各為2.0uM的XRCCl上遊引物和3，端帶螢光標記的探 針混合物，濃度為O. 4uM的XRCC1下遊引物。
擴增反應條件是95"變性10min後，95 ° C孵育1秒，56° C孵育l秒， 72 ° C孵育10秒，40個循環，最後一個循環無72。 C孵育。然後對擴增產物進 行螢光偏振值的檢測，根據螢光偏振值的高低變化判讀臨床血液或組織標本的 單核苷酸多態性檢測結果。
實施例3:在對磺脲類藥物療效預測相關SUR1基因多態性Serl369Ala
的檢測中，
1、 所用的試劑是由MgC12， IOX反應緩衝液，TaqDNA聚合酶，dNTPs， SUR1基因DNA引物，第1369位密碼子上單核苷酸多態性的DNA探針組成。
2、 將上述試劑按非對稱PCR方法進行擴增反應在25uL體系中進行，加入 PCR緩衝液2. 5叱，加入l. 5U TaqDNA聚合酶；濃度分別為2. 0咖ol/L的dGTP、dCTP、 dATP和dTTP;濃度各為2.0uM的SURl基因上遊引物和3'端帶螢光標記的探針 混合物,濃度為0.4uM的SUR1基因下遊引物。
擴增反應條件是94。C變性8min後，72° C孵育10秒，35個循環，最後一 個循環無72。 C孵育。然後對擴增產物進行螢光偏振值的檢測，根據螢光偏振 值的高低變化判讀臨床血液或組織標本的單核苷酸多態性檢測結果。
權利要求
1、一種適用於螢光偏振技術中檢測單核苷酸多態性的方法，所採用的試劑由MgCl2，10×反應緩衝液，TaqDNA聚合酶，dNTPs，靶基因DNA引物，靶區域的3』端帶螢光標記的DNA探針組成；將上述試劑進行擴增所述PCR擴增試劑包括5～10倍的PCR緩衝液；濃度各為2.0～2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，濃度各為0.05-2.0μmol/L的靶基因的上遊引物、下遊引物、3』端帶螢光標記的探針以及1-2U/μl的TaqDNA聚合酶，其中上遊引物與下遊引物濃度的之比為5～10∶1；所述擴增反應條件是94-95℃變性4-10min後，95℃孵育0-1秒，60℃孵育0-1秒，72℃孵育10秒，35-45個循環，最後一個循環無72℃孵育。
全文摘要
本發明涉及螢光偏振檢測技術領域，具體涉及一種適用於螢光偏振技術中檢測單核苷酸多態性的方法。本發明為克服現有技術存在的成本高、操作步驟繁瑣、易發生汙染和影響檢測結果準確性問題，現採用的技術方案是一種適用於螢光偏振技術中檢測單核苷酸多態性的方法，所採用的試劑由MgCl2，10×反應緩衝液，TaqDNA聚合酶，dNTPs，靶基因DNA引物，靶區域的3』端帶螢光標記的DNA探針組成；將上述試劑進行擴增反應。本發明的優點是1.本方法步驟簡單，操作簡單；擴增雜交閉管中一步進行，不易發生汙染，結果準確。2.結果分析簡單，結果判斷時僅需數字比較，易標準化、自動化，應用範圍廣；3.成本低，不需任何專用試劑及螢光淬滅或微溝槽結合劑。
文檔編號C12Q1/68GK101538607SQ20091002226
公開日2009年9月23日 申請日期2009年4月29日 優先權日2009年4月29日
發明者劉文超, 菊 張, 張賀龍 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學