古尼擬青黴菌絲體及其提取物的鎮靜藥物用途的製作方法

2023-06-04 16:53:31 1

專利名稱：：古尼擬青黴菌絲體及其提取物的鎮靜藥物用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及古尼擬青黴菌絲體及其提取物的新醫藥用途，具體的說，涉及古尼擬青黴菌絲體及其提取物的鎮靜藥物用途。#絲*隨著對蟲草研究的不斷深入，古尼蟲草逐漸成為繼冬蟲夏草後又一種重要的蟲草資源。自1983年古尼蟲草在我國首次報導後，梁宗瑜等對其菌種分離、無性型確定、營養成分、藥理實驗及液體發酵等多方面作了大量的研究工作，表明古尼蟲草在提高機體免疫力、促進睡眠和增強記憶力、鎮痛等方面有十分重要的作用。隨著實驗技術的不斷提髙，古尼蟲草仍然具有很大的應用研究潛力。1985年，梁宗瑜在國內首先報導並確認古尼蟲草無性型古尼擬青黴CPaeci7^/c"^//nn7liang)是擬青黴的新種。古尼擬青黴(AecZ/^/CMg"/M//Z.Q.Liang)(RCEF0864)在提高機體免疫力、增強記憶力、鎮痛等方面有十分重要的作用。它的毒性研究表明，古尼擬青黴屬無毒性藥物，特殊毒理研究表明，它沒有致畸、致突變、致瘤作用。中國專利申請公開CN101002592A公開了古尼擬青黴菌絲體及其發酵產物作為飼料添加劑，用於改善禽肉風味、營養和口感。現有技術尚無古尼擬青黴在鎮靜方面醫藥用途的相關報導和應用。
發明內容本發明提供了古尼擬青黴菌絲體及其提取物的一種新醫藥用途，具體的，是其用於製備鎮靜藥物的用途。其中，上述所述的用途，所述的藥物是以治療有效量的古尼擬青黴菌絲體或其提取物為活性成分與藥學上可接受的輔料而製成的。其中，所述的治療有效量，古尼擬青黴菌絲體一般為0.30-0.60g/kg,或其提取物一般為0.6-2.4g/kg。所述的輔料，沒有特別限制，可以是製藥工業上常規的藥劑輔料或賦形劑。可以通過本領域常規的製藥工藝，將所述的藥物活性成分古尼擬青黴菌絲體或其提取物與藥物輔料通過本領域合適藥劑工藝製成所需要的製劑。其中，上述所述的用途，其所述的藥物可以為口服製劑，也可以為注射製劑，沒有特別限制。也可以為固體製劑，例如膠囊、片劑等，也可以為液體製劑，例如口服液、混懸劑、注射液等。本發明所述的上述用途，其中所述的古尼擬青黴菌絲體，是由古尼擬青黴菌經發酵工藝產生的菌絲體。其發酵工藝可以是現有技術已知工藝，例如中國專利申請公開CN101002592A披露的古尼擬青黴菌絲體及其發酵工藝，其全文引入本申請作為參考。進一步地，所述的用途，其特徵在於所述的古尼擬青黴菌絲體由古尼擬青黴菌(Aec〃o/z7/cesg"/2/2/2'Z.Q.Liang)經斜面菌種培養、液體搖瓶培養、種子罐培養、發酵罐發酵培養等步驟而得到的菌絲體,其中古尼擬青黴菌(Aec//o/z/ces^//m//Z.Q.Liang)保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為CGMCCNo.2682。優選地，上述所述的用途，其所述的斜面菌種培養的培養基為SDAY培養基，原料重量配比為葡萄糖40g、蛋白腖10g、酵母浸出粉IOg、瓊脂20g，加水至1L,pH6.5。優選地，上述所述的用途，其所述的液體搖瓶培養、種子罐培養、發酵罐發酵培養的培養基相同，均為蠶蛹粉培養基，原料重量配比為蔗糖30g，蠶蛹粉25g，酵母粉5g，加水至1L，pH7-8。本發明中所用到的古尼青黴菌絲體可以自制也可以購買。其製備方法包括菌株的分離和菌種的發酵，具體步驟如下菌株的分離方法是在超淨工作檯上，在無菌條件下，將釆來的已有明顯成熟子囊的新鮮蟲草用無菌水衝洗乾淨，置於已滅菌的直徑為15cm的培養皿中，蟲草的內菌核部分用打溼的脫脂棉包裹，以保溼。蟲草的可孕部分下放置一滅菌的載玻片，蟲草菌核部分用小玻片墊起，以使可孕部分不要直接接觸載玻片，其距離約0.5cm左右。然後將培養皿放置於20°C±0.5匸的光照培養箱培養，待子囊孢子彈射於載玻片上時，在孢子周圍滴加剛溶化的PDA培養基少許，移出玻片，置於另一滅菌的培養皿中保溼培養，待長出菌絲後用接種針挑取少量菌絲轉另一平皿(SDAY培養基)培養(同上)，直至長出單一的純化的菌落為至。經分子生物學方法驗證，該菌株為古尼蟲草(Corc//ce/^//)無性型。菌種的發酵工藝是由斜面菌種培養、液體搖瓶培養、種子罐培養、發酵罐發酵培養等四步完成的。一級斜面菌種培養斜面培養基為SDAY培養基，即斜面試管菌種培養基的原料重量配比為葡萄糖40g、蛋白腖IOg、酵母浸出粉IOg、瓊脂20g，加水至1L,pH6.5。液體搖瓶培養液體搖瓶培養基為蠶蛹粉培養基蔗糖30g，蠶蛹粉25g，酵母粉5g,水1000ml，pH7-8;500ml三角瓶裝液量1/3，取生長良好的古尼擬青黴(屍aec/^m/c"^m/727)(RCEF0864)菌株種子，勻漿化，按2%的接種量接種於搖瓶中，在恆溫水洛搖床上25°C、140r/min培養4天。每100ml培養液可產菌絲量達1.27g乾重；種子罐培養培養基同液體種子,在70L氣升式發酵罐中裝入S0L液體培養基，培養基溫度大於95°C、pH值為6.0-7.0,並加入食用消泡劑，加入量為0.03°/。，在14.7xl(TPa壓力下，通入蒸汽加熱到121。C，並保壓30~45分鐘；滅菌後，冷卻至2(TC時將6瓶上述培養好的500ml搖瓶種子接入培養，培養溫度為25~26°C,通氣量為1:0.5V/V*min,保壓4.903~7.0845xl04Pa，經20-48h通氣培養，達到對數生長期後即可，最終培養體積為50L;種子罐中l-18h為延滯期，18-36h為快速生長期，36-42h為快速生長後期。培養時間以36h為宜。發酵罐發酵培養培養基同上，在1T發酵罐中裝入700L液體培養基，pH值為6.0~7.0，並加入食用消泡劑，加入量為0.03%,通蒸汽和原位加熱到121°C，在14.7xl(TPa壓力下，保壓30~45分鐘；滅菌後，冷卻至26'C時，將一級種子罐的50L液體種子全部接入二級種子罐培養，培養溫度25~26°C，通氣量為1:0.5V/V'min,保壓4.903-7.0845xl0卞a,經過36-48h通氣培養，達到對數生長期後即可，最終培養體積為700L;發酵罐中0-12h為延滯期，12-36h為快速生長期，36h後為生長穩定期、衰退期，42h達高峰。以42h收穫最宜。幹菌絲收量為15.4g/L。本發明所述的用途，其中所述的提取物，是由菌絲體經本領域常規中藥提取分離技術步驟而得到的提取物，例如可以為水提取、乙醇沉澱而得到的多糖提取物。進一步地，所述的提取物為菌絲體經熱水提、乙醇沉澱、水洗得粗多糖，為淡黃褐色，得率約為3%-5%，多糖含量為70%-75%。菌株胞內多糖主峰GPp主要含有甘露糖、葡萄糖和半乳糖，紅外光譜顯示菌株胞內多糖GPp具有多糖峰的特徵吸收，其特徵吸收峰為3422，2938，1677，1523,1430，1039,823cm。本發明發現，古尼擬青黴菌絲體及其提取物對小鼠自發活動有一定的抑制作用，因此，古尼擬青黴菌絲體及其提取物具有鎮靜作用，可以將其用於製成鎮靜類藥物，用於預防或者治療需要治療的個體。圖1為實施例1所用的古尼擬青黴菌絲體及其提取物製備方法的流程圖。具體實施方式下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步的說明。實施例1所用的小鼠為昆明種小鼠，雌雄各半，體重18-22g,購自安徽醫科大學實驗動物中心(皖醫實動準第01號)。所用的古尼擬青黴菌絲體粉，為自製，實驗時用蒸餾水配成所需濃度；安神補腦液，吉林敖東延邊藥業股份有限公司生產。古尼擬青黴菌絲體製備方法如下，流程圖參見附圖l。菌株的分離方法是在超淨工作檯上，在無菌條件下，將釆來的已有明顯成熟子囊的新鮮蟲草用無菌水衝洗乾淨，置於已滅菌的直徑為15cm的培養皿中，蟲草的內菌核部分用打溼的脫脂棉包裹，以保溼。蟲草的可孕部分下放置一滅菌的載玻片，蟲草菌核部分用小玻片墊起，以使可孕部分不要直接接觸載玻片，其距離約0.5cm左右。然後將培養皿放置於20°C±0.5。C的光照培養箱培養，待子囊孢子彈射於載玻片上時，在孢子周圍滴加剛溶化的PDA培養基少許，移出玻片，置於另一滅菌的培養皿中保溼培養，待長出菌絲後用接種針挑取少量菌絲轉另一平皿(SDAY培養基)培養(同上)，直至長出單一的純化的菌落為至。該菌株為古尼擬青黴(Aec//o/zyces^;/7/n7Z.Q.Liang)(RCEF0864)，古尼蟲草(Cor加柳g"薦7)無性型。菌種的發酵工藝是由斜面菌種培養、液體搖瓶培養、種子罐培養、發酵罐發酵培養等四步完成的。一級斜面菌種培養斜面培養基為SDAY培養基，即斜面試管菌種培養基的原料重量配比為葡萄糖40g、蛋白腖IOg、酵母浸出粉IOg、瓊脂20g,加水至1L,pH6.5。液體搖瓶培養液體搖瓶培養基為蠶蛹粉培養基蔗糖30g，蠶蛹粉25g，酵母粉5g,水1000ml，pH7-8;500ml三角瓶裝液量1/3，取生長良好的古尼擬青黴(Aec27o/H7c"(RCEF0864)菌株種子，勻漿化，按2%的接種量接種於搖瓶中，在恆溫水浴搖床上25°C、140r/min培養4天。每100ml培養液可產菌絲量達1.27g乾重；種子罐培養培養基同液體種子，在70L氣升式發酵罐中裝入50L液體培養基,培養基溫度大於95'C、pH值為6.0~7.0，並加入食用消泡劑，加入量為0.03°/。，在14.7xl4pa壓力下，通入蒸汽加熱到121。C，並保壓30-45分鐘；滅菌後，冷卻至2(TC時將6瓶上述培養好的500ml搖瓶種子接入培養，培養溫度為25~26°C，通氣量為1:0.5V/V'min，保壓4.903—7.0845xl04Pa，經36h通氣培養，達到對數生長期後即可，最終培養體積為50L;種子罐中1-18h為延滯期，18-36h為快速生長期，36-42h為快速生長後期。培養時間以36h為宜。發酵罐發酵培養培養基同上，在1T發酵罐中裝入700L液體培養基，pH值為6.0~7.0，並加入食用消泡劑，加入量為0.03wt%，通蒸汽和原位加熱到121°C，在14.7xl(TPa壓力下，保壓40分鐘；滅菌後，冷卻至26°C時，將一級種子罐的5QL液體種子全部接入二級種子罐培養，培養溫度25~26°C，通氣量為1:0.5V/V'min,保壓4.903~7.0845xl04Pa，經過42h通氣培養，達到對數生長期後即可，最終培養體積為700L;發酵罐中0-12h為延滯期，12-36h為快速生長期，36h後為生長穩定期、衰退期，42h達高峰。以42h收穫最宜。將得到的發酵醪離心後，於4(TC下乾燥，得到幹菌絲，其收量為15.4g/L。實驗分組和給藥方法實驗動物隨機分為5組對照組、陽性藥(安神補腦液5ml/kg)組、古尼擬青黴菌絲體粉(0.15、0.30、0.60g/kg)三個劑量組，ig給藥，連續5天，末次給藥後lh進行實驗。小鼠自發活動實驗自發活動儀記錄法末次給藥後lh,將小鼠投入箱中適應5分鐘後，記錄5分鐘的自發活動次數。小鼠走動時間和舉雙肢法末次給藥後lh,將小鼠投入底部墊有木屑的箱中適應5分鐘後，記錄2分鐘內小鼠走動時間及雙前肢向上抬舉次數。統計方法資料多組間採用方差分析，兩組間釆用t檢驗。實驗結果1.古尼擬青黴菌絲體粉對小鼠自發活動的影響自發活動儀記錄法的實驗結果見表l。從表l種可以看出，與對照組比較，古尼擬青黴菌絲體粉(0.60g/kg)可明顯減少小鼠自發活動次數。小鼠走動時間和舉雙肢法的實驗結果見表2。從表2中可以看出，與對照組比較，古尼擬青黴菌絲體粉(0.60g/kg)可明顯減少小鼠走動時間，古尼擬青黴菌絲體粉(O.30、0.60g/kg)可明顯使前肢向上抬舉次數減少。上述試驗均說明古尼擬青黴菌絲體對小鼠的自發活動有很好的抑制作用。古尼擬青黴菌絲體具有很好鎮靜作用，可以作為鎮靜類藥表l古尼擬青黴菌絲體粉對小鼠自發活動的影響(Z±s，n=8)tableseeoriginaldocumentpage11注與對照組比較，*屍<0.05表2古尼擬青黴菌絲體粉對小鼠走動時間和前肢向上抬舉的影響(Z±s，n=8)tableseeoriginaldocumentpage11注與對照組比較，*屍<0.05實施例2按照實施例1方法製得古尼擬青黴菌絲體。將得到的古尼擬青黴菌幹菌絲體進行如下提取過程得到提取物(見圖1)。將得到的提取物按照實施例1中的條件進行實驗，自發活動儀記錄法的實驗結果見表3;小鼠走動時間和舉雙肢法的實驗結果見表4。表3古尼擬青黴菌幹菌絲體提取物對小鼠自發性活動的影響(自發活動儀記錄法，^士s，n-8)tableseeoriginaldocumentpage12表4古尼擬青黴菌幹菌絲體提取物對小鼠走動時間及前肢向上抬舉次數的影響(^s，n=8)tableseeoriginaldocumentpage12從上述實驗可以看出，古尼擬青黴菌絲體及其提取物均具有一定的鎮定作用，可以用作鎮定類藥物的用途。已經根據優選實施例對本發明作了描述。應當理解的是前面的描述和實施例僅僅為了舉例說明本發明而已。在不偏離本發明的精神和範圍的前提下，本領域技術人員可以設計出本發明的多種替換方案和改進方案，其均應被理解為在本發明的保護範圍之內。權利要求1.古尼擬青黴菌絲體或其提取物在製備用於鎮靜藥物中的用途。2.如權利要求1所述的用途，其特徵在於所述的藥物是以治療有效量的古尼擬青黴菌絲體或其提取物為活性成分與藥學上可接受的輔料而製成的。3.如權利要求1或2所述的用途，其特徵在於所述的藥物為口服製劑或注射製劑。4.如權利要求1-3所述的用途，其特徵在於所述的古尼擬青黴菌絲體由古尼擬青黴菌(屍aec2'/咖/cogWM//Z.Q.Liang)經斜面菌種培養、液體搖瓶培養、種子罐培養、發酵罐發酵培養等步驟而得到的菌絲體，其中古尼擬青黴菌(^///2i7Z.Q.Liang)保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為CGMCCNo.2682。5.根據權利要求4所述的用途，其特徵在於所述的斜面菌種培養的培養基為SDAY培養基，原料重量配比為葡萄糖40g、蛋白腖10g、酵母浸出粉IOg、瓊脂20g,加水至1L,pH6.5。6.根據權利要求4所述的用途，其特徵在於所述的液體搖瓶培養、種子罐培養、發酵罐發酵培養的培養基相同，均為蠶蛹粉培養基，原料重量配比為蔗糖30g，蠶蛹粉25g,酵母粉5g,加水至1L,pH7-8。7.根據權利要求1-6所述的用途，其特徵在於所述的提取物是由菌絲體經水提取、乙醇沉澱而得到的多糖提取物。全文摘要本發明公開了古尼擬青黴菌絲體及其提取物的鎮靜藥物用途，具體地說，古尼擬青黴菌絲體及其提取物具有鎮靜作用，可以作為鎮靜類藥物。屬於醫藥用途發明。文檔編號A61P25/00GK101401827SQ20081018103公開日2009年4月8日申請日期2008年11月21日優先權日2008年11月21日發明者李春如,樊美珍,勃黃申請人:樊美珍;李春如;黃勃