一種從維生素c發酵醪液中提取蛋白質的方法
2023-11-06 11:28:42
專利名稱：一種從維生素c發酵醪液中提取蛋白質的方法
技術領域：
本發明涉及一種從維生素C發酵醪液中提取蛋白質的方法，特別涉及一種菌絲體收集破碎和蛋白質分離提取的生產技術，屬於生物技術領域。
背景技術：
維生素C是維持人身健康的一種不可缺少的物質。它是活細胞氧化還原反應的催化劑、參與體內多種代謝、具有促進體內 多種急速合成的生理作用。機體內缺乏維生素C易發生壞血病，嚴重時可造成死亡。臨床應用防治壞血病；促進機體代謝，增強抗感染能力，阻止產生致癌物質；各種疾病的急救；使組織產生膠原質可促進傷口癒合；可幫助酶將膽固醇轉化成膽固酸排掉，以減輕血管壁的脆性，預防冠心病；大劑量靜脈注射用於克山病的治療。食品應用用於食品添加劑。如食品的抗氧化劑、啤酒的抗老劑、麵粉的改性劑、罐頭食品的亞硝酸鹽抑制劑及糕點、糖果、飲料、乳製品的營養添加劑。VC用於化妝品行業及飼料添加劑等。目前，維生素C主要是以玉米澱粉為原料，採用二步發酵法進行生產。二步發酵法是美國的Tengerdy和Huang等首先發現的,其經過的是L-山梨糖的途徑，即L-山梨醇先經過細菌轉化的L-山梨糖，後者再經過細菌發酵生成維生素C前體2-KGA。國外的二步發酵法研究較早，L-山梨糖代謝途徑和代謝機制研究也比較深入，但是由於其2-KGA轉化率低而至今未被用於生產實踐。我國維生素C二步發酵法是由中國科學院微生物研究所和北京製藥廠合作於20世紀70年代初發明的，它是目前唯一成功應用於維生素C工業生產的微生物轉化法，該辦法屬L-山梨糖途徑，其特點為第二步發酵由氧化葡萄糖酸桿菌和巨大芽孢桿菌等伴生菌混合發酵完成。我國最初篩選出的一組能利用L-山梨糖產生2-KGA的優良菌株是氧化葡萄糖酸桿菌及其伴生菌條紋假單孢菌，以後經不斷實踐改進，1976年6月通過中試鑑定並逐漸在全國範圍內推廣使用。維生素C二步發酵生產法會產生大量的菌絲體、蛋白質等副產物，約佔發酵液的4%，經超濾截留成分粘度比較大，含有一定的古龍酸鈉成分，氣味難聞，無法直接作為動物飼料，很多維生素C生產廠家將這部分截留成分置於空場堆放、鍋爐焚燒或者直接外售。維生素C發酵副產物的不及時處理對空氣造成汙染，影響廠容，因此有必要對維生素C發酵副產物進行綜合利用，對社會和公司發展都有雙贏意義。我國是世界最大的飼料消費國，我國養殖業對飼料蛋白的需求量日益增加，例如飼用大豆蛋白的70%依靠進口(參見丁國文，擴大非糧食飼料原料供給[J].中國飼料，2006,22:22-23)。因此，從維生素C發酵副產物中提取蛋白質用作飼料蛋白具有重要意義。
發明內容
針對現有技術中存在的不足，本發明提供了一種從維生素C發酵副產物一維生素C發酵醪液中提取蛋白質的方法，該方法能方便、快捷的將蛋白質從醪液中提取出來，實現了資源的綜合利用，即解決了發酵醪液對環境造成汙染的問題，又變廢為寶減少了資源的浪費，具有很好的經濟學和社會學意義。
本發明公開了一種從維生素C發酵醪液中提取蛋白質的方法，其步驟為收集維生素C發酵醪液超濾濾渣，通過超低溫速凍，高壓均質機對菌絲體等物質進行破碎，酶法水解提取蛋白，離心、絮凝沉降、乾燥得到蛋白粉，具體技術方案如下
一種從維生素C發酵醪液中提取蛋白質的方法，其特徵是具體包括以下步驟
(1)將維生素C發酵醪液用超濾膜進行超濾處理，將其中的菌絲體和蛋白質等大分子物質從醪液中截留出來，收集截留成分；
(2)將步驟(I)超濾所得的截留成分加入水攪拌均勻，然後採用超低溫速凍技術將截留成分溶液速凍，得懸濁液，然後再用高壓 均質機將所得懸濁液進行破碎處理；
(3)將蛋白複合酶加入步驟(2)處理後的懸濁液中，酶解提取其中的蛋白質成分；
(4)將酶解所得的酶解液進行離心分離，收集上清液；
(5)調節步驟(4)所述上清液的pH，使蛋白質絮凝沉降，過濾取沉澱；
(6)將步驟(5)中的沉澱進行乾燥，得蛋白粉。上述步驟(I)中，所述超濾膜的截留分子量為1000 2000道爾頓；發酵醪液進行超濾的條件為進水壓力O. 2 O. 5Mpa，超濾溫度29 39°C，發酵醪液pH值5. O 7. 5。上述步驟(2)中，水的加入體積與截留成分的體積比為1:0. 5 1:5 ;超低溫速凍溫度為-35 -50°C，速凍時間為5 IOmin ;懸濁液通過高壓均質機的壓力為100 150Mpa，流速為 150-260m/s。上述步驟(3)中，所述蛋白複合酶由羧肽酶和酶 A組成，酶A選自下列酶中的一種或多種胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、鹼性蛋白酶；其中羧肽酶與酶A的質量比為I: I. 0-2.0，優選的所述蛋白複合酶由羧肽酶、鹼性蛋白酶和胰蛋白酶組成，它們的質量比為羧肽酶鹼性蛋白酶胰蛋白酶=1:1. 2 :0. 5。上述步驟(3)中，蛋白複合酶的用量為懸濁液質量的O. 35% 1.2%，酶解溫度為40 60°C，酶解時懸濁液pH為5. 5 8. 5，酶解時間為2 3. 5h。上述步驟(4)中，在30 40°C下進行離心分離，轉速為800 1500rpm，時間為30 90mino上述步驟(5)中，將上清液pH調節至2. O 4. 5，使蛋白質絮凝沉降，蛋白質沉降時間為6-14h。上述步驟(6)中，乾燥採用噴霧乾燥的方法,噴霧乾燥進風溫度為200 300°C,出風溫度為50 100°C。本發明具有的優點和積極效果
I.本發明利用維生素C發酵副產物提取蛋白粉，提取蛋白中胺基酸種類豐富，可作為飼料蛋白，亦可作為蛋白質深加工的原料，實現了維生素C發酵副產物的綜合有效利用，增加了飼用蛋白粉來源的一個新渠道，節約了資源，保護了環境。2.利用均質機對維生素C發酵菌絲體等成分進行了先速凍後破碎，對發酵副產物中的蛋白質成分進行了提取，通過蛋白複合酶提取維生素髮酵副產物中的蛋白質，蛋白提取率高。3.本發明原料成本低，設備簡單，操作方便，能耗小，副產物綜合利用價值高，易於實現規模化生產，減小了維生素C生產對環境的汙染，提高了產業附加值。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體工藝條件、物料配比及其結果僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所描述的本發明。下述實施例中，採用15 _30wt%的鹽酸溶液、15_40wt%的硫酸溶液、氫氧化鈉或其水溶液、氫氧化鉀或其水溶液調節pH。實施例I
(I)發酵醪液超濾處理
取維生素C發酵醪液100g，通過截留分子量2000道爾頓的超濾膜系統進行處理，進水壓力控制在O. 4 O. 5Mpa，調節發酵醪液pH值5. 0，操作溫度35 39°C，超濾處理後菌絲體和蛋白質等副廣物得到截留，截留率達98. 0%,收集截留成分。(2)破碎處理
收集截留成分，加入蒸餾水並攪拌均勻，水與截留成分的體積比為1:0. 5，然後將混合液加入超低溫速凍設備，在_35°C速凍5min，然後再在壓力120Mpa，流速200m/s條件下通過高壓均質機對懸濁液進行破碎處理，菌體破碎率為94%。(3)酶法水解
往破碎後的漿液中添加漿液質量O. 35%的蛋白複合酶(羧肽酶、鹼性蛋白酶、木瓜蛋白酶質量比為1:1:1)，對蛋白質進行酶解，反應溫度為50 55°C，pH為7 8，反應時間為
3.5h。(4)離心分離
利用離心機對酶解液進行離心分離，離心處理轉速為800rpm，離心溫度為30°C，離心時間為60min，收集離心上清液，蛋白收率為95%。(5)絮凝沉降
加鹽酸溶液調節上清液PH值至3. 5-4. 5，自然沉降6h，棄去上清液，蛋白收率為86%。(6)乾燥
利用噴霧乾燥器對沉降組分進行乾燥處理，進風溫度為200°C，噴霧乾燥過程中對蛋白漿液進行攪拌，出風溫度為80°C，可得到淡黃色蛋白粉49. 62g。實施例2
(I)發酵醪液超濾處理取維生素C發酵醪液100g，通過截留量1500道爾頓的超濾膜系統進行處理，進水壓力控制在O. 2-0. 3Mpa，調節發酵醪液pH值7. 5，操作溫度30_34°C，菌絲體和蛋白質等副產物得到截留，截留率達97. 5%，收集截留成分。(2)破碎處理
收集截留成分，加入蒸餾水並攪拌均勻，水與截留成分的體積比為1:1，然後將混合液加入超低溫速凍設備，在-50°C速凍8min，然後再在壓力lOOMpa，流速260m/s條件下通過高壓均質機對懸濁液進行破碎處理，菌體破碎率為95. 5%。(3)酶法水解
往破碎後的漿液中，添加漿液質量I. 2%的蛋白複合酶(羧肽酶、木瓜蛋白酶質量比為1:1)，對蛋白質進行酶解，反應溫度為55-60°C，pH為5. 5-6. O，反應時間為3h。
(4)離心分離
利用離心機對酶解液進行離心分離，離心處理轉速為1500rpm，離心溫度為35°C，離心時間為30min，收集離心上清液，蛋白收率為93%。(5)絮凝沉降
加鹽酸溶液調節上清液PH值至3. 0-4. O,自然沉降14h，棄去上清液，蛋白收率為93%。(6)乾燥 利用噴霧乾燥器對沉降組分進行乾燥處理，噴霧乾燥過程中對蛋白漿液進行攪拌，進風溫度為300°C，出風溫度為100°C，得到淡黃色蛋白粉52. 28g。實施例3
(I)發酵醪液超濾處理
取維生素C發酵醪液100g，通過截留量1000道爾頓的超濾膜系統進行處理，進水壓力控制在O. 2-0. 25Mpa，調節發酵醪液pH值6. 0，操作溫度29_33°C。菌絲體和蛋白質等副產物得到截留，截留率達99. 0%，收集截留成分。(2)破碎處理
收集截留成分，加入蒸餾水並攪拌均勻，水與截留成分的體積比為I: I. 5，然後將混合液加入超低溫速凍設備，在_50°C速凍lOmin，然後再在壓力150Mpa，流速150m/s的條件下通過高壓均質機對懸濁液進行破碎處理，菌體破碎率為99. 0%。(3)酶法水解
往破碎後的漿液中，添加漿液質量O. 75%的混合酶(羧肽酶、鹼性蛋白酶、胰蛋白酶的質量比為1:1. 2:0. 5)，對蛋白質進行酶解，反應溫度為40-45°C，pH為7. 5-8. 5，反應時間為2h。(4)離心分離
利用離心機對酶解液進行離心分離，離心處理轉速為1200rpm，離心溫度為40°C，離心時間為90min，收集離心上清液，蛋白收率為99. 3%。(5)絮凝沉降
加鹽酸溶液調節上清液PH值至蛋白等電點3. 5-4. 5，自然沉降10h，棄去上清液，蛋白收率為95%。(6)乾燥
利用噴霧乾燥器對沉降組分進行乾燥處理，噴霧乾燥過程中對蛋白漿液進行攪拌，進風溫度為280°C，出風溫度為50°C，可得到淡黃色蛋白粉59. 44g。實施例4
採用實施例3的步驟提取蛋白粉，不同的是所用的混合酶是質量比為1:0. 5:0. 5的羧肽酶、鹼性蛋白酶和胰蛋白酶，離心收集上清液，測得蛋白收率為98%。
權利要求
1.一種從維生素C發酵醪液中提取蛋白質的方法，其特徵是包括以下步驟 (1)將維生素C發酵醪液用超濾膜進行超濾處理，將其中的菌絲體和蛋白質等大分子物質從醪液中截留出來，收集截留成分； (2)將步驟(I)超濾所得的截留成分加入水攪拌均勻，然後採用超低溫速凍技術將截留成分溶液速凍，得懸濁液，然後再用高壓均質機將所得懸濁液進行破碎處理； (3)將蛋白複合酶加入步驟(2)處理後的懸濁液中，酶解提取其中的蛋白質成分； (4)將酶解所得的酶解液進行離心分離，收集上清液； (5)調節步驟(4)所述上清液的pH，使蛋白質絮凝沉降，過濾取沉澱； (6)將步驟(5)中的沉澱進行乾燥，得蛋白粉。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵是步驟(I)中，所述超濾膜的截留分子量為1000 2000道爾頓；發酵醪液進行超濾的條件為進水壓力O. 2 O. 5Mpa，超濾溫度29 39 0C，發酵醪液pH值5. O 7. 5。
3.根據權利要求I所述的方法，其特徵是步驟(2)中，水的加入體積與截留成分的體積比為1:0. 5 1:5 ;超低溫速凍溫度為-35 -50°c，速凍時間為5 IOmin ;懸濁液通過高壓均質機的壓力為100 150Mpa，流速為150_260m/s。
4.根據權利要求I所述的方法，其特徵是步驟(3)中，所述蛋白複合酶由羧肽酶和酶A組成，酶A選自下列酶中的一種或多種胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、鹼性蛋白酶；其中羧肽酶與酶A的質量比為1:1.0-2. O。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵是步驟(3)中，所述蛋白複合酶由羧肽酶、鹼性蛋白酶和胰蛋白酶組成，它們的質量比為羧肽酶鹼性蛋白酶胰蛋白酶=1:1. 2 :0. 5。
6.根據權利要求1、4或5所述的方法，其特徵是步驟(3)中，蛋白複合酶的用量為懸濁液質量的O. 35% I. 2%，酶解溫度為40 60°C，酶解時懸濁液pH為5. 5 8. 5，酶解時間為2 3. 5h。
7.根據權利要求I所述的方法，其特徵是步驟(4)中，在30 40°C下進行離心分離，轉速為800 1500rpm，時間為30 90min。
8.根據權利要求I所述的方法，其特徵是步驟(5)中，將上清液pH調節至2.O 4. 5，使蛋白質絮凝沉降，蛋白質沉降時間為6-14h。
9.根據權利要求I所述的方法，其特徵是步驟(6)中，乾燥採用噴霧乾燥的方法，噴霧乾燥進風溫度為200 300°C，出風溫度為50 100°C。
全文摘要
本發明公開了一種從維生素C發酵醪液中提取蛋白質的方法，包括以下步驟將維生素C發酵醪液用超濾膜進行超濾，收集截留成分；將截留成分加入水攪拌均勻，然後採用超低溫速凍技術將截留成分溶液速凍，然後再用高壓均質機將進行破碎處理；將蛋白複合酶加入破碎處理後的懸濁液中，酶解提取其中的蛋白質成分，將酶解所得的酶解液進行離心分離，收集上清液；調節上清液的pH，使蛋白質絮凝沉降；將沉澱進行乾燥，得蛋白粉。本發明利用維生素C發酵副產物提取蛋白粉，提取蛋白中胺基酸種類豐富，可作為飼料蛋白，亦可作為蛋白質深加工的原料，實現了維生素C發酵副產物的綜合有效利用，增加了飼用蛋白粉來源的一個新渠道，節約了資源，保護了環境。
文檔編號C12P21/06GK102766671SQ201210281439
公開日2012年11月7日 申請日期2012年8月9日 優先權日2012年8月9日
發明者付吉明, 劉敏, 莊禕, 張全景, 王喬隆, 鄭秀寧 申請人:山東天力藥業有限公司