一種gkn1基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用的製作方法

2023-09-23 08:59:25 1

專利名稱：一種gkn1基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用的製作方法
一種GKN1基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用技術領域：
本發明涉及一種試劑盒，具體地說關於一種GKN1基因的原位雜交檢測試 劑盒及其檢測方法和應用。
背景技術：
根據國內外權威機構提供的資料，我國每年癌症的新增人數160萬，死亡 人數近160萬，患者600萬，全球每年新增癌症患者800萬，死亡人數接近800 萬，患者約有8400萬人，到2020年以上人數將翻一番，這是一組可怕的數字。 根據最新報導，胃癌在全世界範圍內是發病率最高的癌症之一，男性的發病率 是女性的1.5 2.5倍。胃癌的發病率隨著年齡的增加而顯著升高，以男性胃 癌發病率為例，45 54歲發病率為70/10萬，55 64歲階段為145. 7/10萬， 65 74歲為264. 3/10萬。發病的高峰年齡在50歲 80歲。大約90%的胃癌屬 於腺癌，可分為兩個主要類型(l)腸型胃癌，分化較好，在男性、老年患者 中更常見。腸型胃癌在高風險地區中佔主導地位，比如東亞、東歐、中南美洲 等地區。(2)瀰漫型胃癌，分化不好，在男性與女性中發病率更接近，在年輕 患者中更常見。瀰漫型胃腺癌的地區分布更均勻，與A型血及遺傳關係密切。 近幾十年來腸型胃癌的發病率明顯下降，帶動了胃癌的整體發病率的降低，而 瀰漫型胃癌發病率卻上升了。 2002年全球每IO萬名男性發生胃癌的的人數為 22人，女性為10. 4人；死亡率在男性中為每10萬人16. 3人，女性為7. 9人。 2002年全世界估計有90萬胃癌新患者(其中男性為60萬，女性為33萬)，同 時有70萬人死於胃癌(男性為45萬人，女性為25萬人)。男性中，胃癌的發 病率僅次於胃癌和前列腺癌，而死亡率僅次於肺癌居第二位。在女性中，胃癌
的發病率居第五位，排在乳腺癌、宮頸癌、肺癌和腸癌之後。按地理分布，有 三分之二的胃癌分布在日本、中國、韓國、中南美洲、東歐和中東的部分地區， 在北美、澳大利亞和紐西蘭、北歐和印度的發病率較低。發達國家的胃癌的發
病率和死亡率在近幾十年有顯著下降了，美國在20世紀50年代年死亡率約為 22/10萬，90年代下降至3.7/10萬以下。日本近年來亦有明顯下降趨勢，這 得益於採用X線鋇餐檢査或胃鏡定點篩査，大大提高了早期胃癌的檢出率。我
閨肓灑tfj及炳w飢，育酒亡煩徵夕匕L入效tfj虹凹or:一 我國是胃癌的咼發 區，胃癌年患病率和死亡率均是世界平均水平的2倍多。在衛生部組織的
1990 1992年全國第二次死因調査中，中國胃癌的粗死亡率為25. 2/10萬(男 性為32. 8/10萬，女性為17. 0/10萬)，佔到所有因癌症死亡人數的23. 2%，接 近四分之一。
男性發病率下降，女性發病率上升。根據全國腫瘤防治辦公室楊玲博士 2006年發表在《世界胃腸病學雜誌》中的文章的估計，2005年中國胃癌發病 率在男性中達37. 1/10萬，女性中為17. 4/10萬。每年新發胃癌患者達40萬 人，死亡人數達30萬人，胃癌將是中國的第三大常見腫瘤(在男性中排在肺癌 和肝癌之後，女性排在乳腺癌和肺癌之後)。從2000年到2005年間，胃癌的 發病率和死亡率輕微的下降了，但這種下降的趨勢是由男性引起的，相反，女 性的胃癌發病率和死亡率都有上升的趨勢。
人們普遍認為，胃癌發病率的下降主要與膳食方式的改變及冰箱的普及有 關。上海市區1972年男性胃癌的發病率為62/10萬，女性為23.9/10萬，而 1995年男女發病率分別降至36/10萬和18/10萬，尤以男性明顯。但要警惕的 是，胃癌正在逼近年輕人，近年來我國青年人胃癌佔全部胃癌總數的比率已由 上個世紀70年代的1. 7%上升到3. 3%。胃癌發病率在城市中下降，在農村中大
幅上升，從1973 1975年到1990 1992年的二十年間，胃癌的發病率升高了 10%。城市人口胃癌發病率下降了 23.8%，但在農村人口中增加了25.8%，因為
中國三分之二的人口住在農村，所以胃癌仍是所有人口中最常見的癌症之一， 而在城市中發病率居所有腫瘤的第三位。
胃癌篩査可大大降低死亡率，總的說來，胃癌發病率高的地區，其患者的 生存率反而更好，這主要是由於高發病的地區的胃癌在胃部的生長部位有關。 腫瘤發生在幽門竇的預後比發生在賁門部位要好。對高風險地區的人群進行早 期篩査有助於降低死亡率，例如日本對一些地區進行了大規模的胃癌篩査，男 性的胃癌死亡率自二十世紀70年代以來幾乎減少了 50%。早期胃癌5年生存率 可達95%
如果胃癌僅限於胃壁的黏膜層，5年的生存率可達95%。然而，目前很少 有胃癌患者在早期被發現，導致5年生存率在20% 50%。因而早期發現，早診 早治是提高胃癌治癒率、降低死亡率的關鍵。
2005年美國衛生研究院、癌症研究院、疾控中心等多家單位做了一個年度 報告，"認為人類在抗癌大戰中是失敗"，也就是說癌症死亡率沒有降低，其列 舉出造成抗癌大戰失敗的幾個因素是1.腫瘤細胞異質性；2.腫瘤細胞耐藥性; 3.抗癌藥物設計思路不完善等。同時，該報告中亦提出應重新審視現有診治癌 症的措施。
本發明人在研究中發現，導致癌症死亡率不降的另一個重要原因是，不能 做到真正的早期診斷。依照傳統的醫學影像及和其它生化(如蛋白標記物)指 標來診斷癌症，認為佔位性癌塊在2公分下是屬於早期癌症的診斷(更小些有 時無症狀體徵)，這一概念值得認真討論。影像醫學的2公分以下癌塊屬早期 這一界定科學性是不夠嚴謹的，從細胞學角度，1公分的腫塊約有一億個腫瘤細胞，2公分的腫塊其三維空間的細胞疊加數遠不止2億個腫瘤細胞，從癌變 前期到單克隆癌細胞產生及形成2公分的癌塊，其病理演變過程相當長，可能 是一年或兩年、甚至三年以上，很難證實的是在這個過程中，腫塊是癌症唯一
的發生地和單獨的病灶。臨床上已證實 一旦形成腫塊的同時，其他癌細胞通 過不同途徑遷移到其他部位克隆生長； 一旦切除原發灶後，其他器官復發灶或 多發癌塊灶先後形成或轉移。因此，在臨床上以2公分以下的腫塊大小來界定 早期與否,不夠嚴謹(有些病例，在發現原發病灶時，同時發現轉移病灶，不 在我們表述的內容中)，這時己經是晚期了，這是導致癌症死亡率不降的真正 原因。
隨著分子生物技術日益完善，功能基因組學，癌症基因組學等研究的深入 展開，至今，我們已有可能在基因水平上做更精確的早期診斷，在癌變前期或 癌細胞形成(單克隆時)就能做到早期預測診斷。
美國羅德島醫院的研究者發現兩種分子標誌物可用於預測胃癌患者的預 後情況。胃癌是世界上最常見，也是最致命的癌症之一。胃癌外科手術後的不 良表現通常與兩種蛋白低表達量有關。這兩種蛋白就是gastrokinel和 gastrokine2 (GKN1和GKN2)，通常被正常的胃細胞表達這兩種蛋白。這一研 究結果與以前的研究結果一致，當胃細胞表現成癌症特徵時，GKN1和GKN2蛋 白的表達量就十分低。這一研究是首次將低表達量的GKN與胃癌手術後的預後 相結合。這發現可幫助內科醫生更好地診斷胃癌患者的病況，提供個性化的治 療方案，判斷哪些患者需要進行化療，哪些患者需要接受額外的外科手術治療。 醫學博士 steven moss說胃癌是一種很難治療的癌症，除非能在胃癌早期就診 斷出來接受及時的治療，但是胃癌早期通常缺乏有效的診斷線索。因此很不幸 的是胃癌被診斷出來時往往已經是晚期癌症了。該項研究發現具有深遠的意
義。因為一旦我們的研究證實這一潛在診斷標誌物有助診斷病人的預後情況， 我們就可以應用這一成果拯救更多的胃癌患者，為胃癌患者提供個性化的治療 方案，使他們活得更久，活得更舒適。
據美國國立癌症研究所統計。每年在世界範圍內有大約760， 000個病例被 診斷為胃癌。從病理學的角度來說，胃癌可分成兩種亞型。 一種是擴散型(一 種更具有侵襲性的癌症形式可發生於胃癌的任一階段， 一旦成為瀰漫型癌細胞 的移動性更強)，另一種是腸型(這在小腸或大腸裡見到擴散的癌細胞)。胃癌 的兩種形式通常都是由於一種細菌慢性感染所致，這就是幽門螺旋桿菌 (H. pylori)幽門螺旋桿菌是引起胃炎和胃潰瘍的常見致病菌。外科手術是治 療胃癌的常用手段，可將胃部分切除或全部摘除。胃癌患者有5年生存率的達 24%。
Moss是幽門螺旋菌研究方面的專家，他和同事首先研究幽門螺旋桿菌對正 常胃細胞的影響。他的關注的熱點在G認1和G認2，因為通常幽門螺旋桿菌感 染者細胞裡這兩種蛋白的表達受到抑制。
研究者對150名接受外科手術治療的胃癌患者進行組織採樣，結果發現大 部分的胃癌患者GKN1和GKN2的表達都受到抑制，這些證據在瀰漫型胃癌患者 中特別明顯。超過3/4的患者細胞裡GKN1的表達量相當低，85°/。的患者細胞幾 乎沒有GKN2存在。並且，腸型胃癌患者手術後GKN1和GKN2的表達量更低， 而GKN1和GKN2表達量低的患者往往預後不良，這些患者的存活率中值只有兩 年，而GKN1和GKN2表達量正常的胃癌患者存活時間可達10年以上。
研究者現在不清楚GKN1和GKN2的確切功能，他們說深入的研究將會對 GKN1和GKN2的分子作用機制進一步明確，並且可能將GKN1和GKN2作為潛在 的臨床診斷指標。該研究採集的組織樣本來自155名外科手術後的胃癌車者(其
中81名男性患者，74名女性患者)這些病人全來自美國羅德島醫院，接受手 術的平均年齡是72歲，研究中的患者有各個階段的，其中73名為胃癌I期患 者，44名為II期患者，34名為m期患者，40名是IV期患者，其中超過60名是 腸型胃癌患者，90名是瀰漫型胃癌患者。
目前對GKN基因的研究都採用高通量基因晶片技術，而這一方法多用於科 研方面，不適應臨床應用，特別是個性化檢測應用在我國現階段尚未見報導。 根據現有的文獻資料及査新報告GKN1基因的檢測技術及檢測試劑盒未見報導。 原位雜交技術(in situ hybridization)是將分子生物學與細胞化學技術 結合起來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的 技術。其原理是使含有特異序列、經過標記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條 件下與組織細胞中的互補核酸單鏈即靶核酸發生雜交，再以放射自顯影或免疫
細胞化學方法對標記探針進行探測，從而在細胞原位顯示特異的DNA或RNA分 子。
中國專利文獻CN1556221公開了"IC53基因及其相關產物診斷和治療結腸 癌的用途及一種診斷結腸癌的試劑盒"。中國專利文獻CN1769485公開了 "豐節 孔扇貝病原類立克次氏體的原位雜交檢測方法及其試劑盒"。中國專利文 獻CN1556410'公開了 "一種魚類病毒的檢測試劑盒及其檢測方法"。中國專利 文獻CN1680597公開了"一種用於定量檢測C型肝炎病毒(HCV)的螢光定量PCR 試劑盒"。中國專利文獻CN2918435，公開了 "一種檢測肥胖相關基因SNP的寡 核苷酸晶片及試劑盒"。但是，關於GKN1基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測 技術未見報導。
發明內容
本發明的目的是，提供一種GKN1基因的原位雜交檢測試劑盒在製備檢測 胃癌疾病藥物中的應用。
本發明的再一的目的是，提供一種GKN1基因的原位雜交檢測試劑盒。 本發明的再一的目的是，提供一種GKN1基因原位雜交檢測方法。 為實現上述目的，本發明採取的技術方案是 一種GKN1基因的原位雜交 檢測試劑盒，在製備檢測胃癌疾病藥物中的應用，所述的試劑盒包括雜 交探針、標記物，其中所述的雜交探針序列如SEQIDNO.l所示。GKN1基因 序列見SEQ ID NO. 1， GKN1基因的核苷酸序列長度是820bp， CDS: 64. .663，位於染色體2pl4"位點上。
所述的雜交探針序列如SEQIDNO.l所示的RNA序列。 所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。 所述的放射性核素選自SH、 35S、 1251或"P中的一種。 所述的非放射性標記物選自生物素、地高辛、鹼性磷酸酶、辣根過氧化酶 或螢光素中的一種。
所述的非放射性標記物優選自地高辛。
其中，所述的試劑盒還包括增效劑，所述的增效劑是鹼性磷酸酶抗體。 為實現上述第二個目的，本發明採取的技術方案是 一種GKN1基因的原 位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，其中，所述的雜交探針序 列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標記物選自放射性核素或非放射性標 記物。
為實現上述第三個目的，本發明採取的技術方案是 一種GKN1基因原 位雜交檢測方法，該方法包括以下步驟
a、 將試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交複合體；
b、 檢測a步驟得到的雜交複合體。
所述a步驟中形成雜交複合體的條件為核酸雜交的溫度為42t:;核酸雜 交的時間為16—24小時，所述的底物'選用血液細胞標本或組織細胞標本。
本發明的檢測試劑盒是採用核酸雜交技術和組化免疫方法相結 合，以GKN1基因為檢測對象，合成探針是GKN1基因的DNA或RNA 序列，檢測的底物是人體血液標本白細胞或組織細胞的RNA的表達 量。原位雜交技術的顯示方法能提供GKN1基因的半定量或定量表達 程度判定。根據雜交後免疫組化顯色判定以上基因的表達量，正常人 GKN1基因高表達，GKN1基因在胃癌晚期病人低表達，和正常人有顯 著差異。本發明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效 劑等組成。本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業內人士均熟知，具體操作 步驟是標本處理、預雜交、雜交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結果報 告，其中雜交的具體步驟包括
儀器操作
1) .將待測標本放入反應槽中；
2) .儀器自動棄去液體，自動加消化液；
3) .儀器自動棄去液體，自動後固定；
4) .儀器自動棄去液體，自動預雜交(42°C);
5) .儀器自動棄去液體，自動清洗；
6) .儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C);
7) .儀器自動棄去液體，自動清洗；
8) .儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(室溫)；
9) .儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色；
10) .取出封片鏡檢。
本發明優點在於
1、 本發明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。
2、 本發明的檢測方法操作方便、簡單，能在區級以上醫院普遍使用和推 廣。克服了目前對GKN1基因的研究都採用高通量基因晶片方法，而這些方法
多用於科研方面，不適應臨床應用的缺陷。
3、 本發明的臨床意義是更早期跟蹤檢測胃癌發生，以及用於癌症預防醫 學檢測。本發明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測癌胚蛋白標誌物，以及影像醫 學檢査有顯著不同。本發明可以在基因水平上檢測基因異常表達，在影像醫學 檢査未發現佔位性癌病灶之前，癌症生化指標未產生異常之前，亦未形成腫塊 之前，能及早做到以上基因表達異常的信息採集，給臨床胃癌病患一個真正的 早期診斷和轉移侵入以及治療後轉移復發及早預測。這樣才有可能實施胃癌的 早期診斷、早期預防、早期治療，有可能從源頭上徹底根治胃癌惡疾。


圖l是本發明實施例中胃癌病人GKN1基因低表達圖。 圖2是本發明實施例中正常人GKN1基因表達圖。
具體實施方式
下面結合圖對本發明提供的一種GKN1基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢 測方法和應用的具體實施方式
做詳細說明。 實施例1
一種GKN1基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物、增效 劑，其中，所述的雜交探針序列如SEQ IDNO. 1所示。雜交探針用地
高辛標記。試劑盒中的其它液體和標本組成如下
消化液lOOu 1/管l管/盒無色透明液體
保護液100ul/管l管/盒無色透明液體
預雜交液1300til/管2管/盒無色透明液體
正義雜交液lOu 1/管l管/盒無色透明液體
反義雜交液10u 1/管l管/盒無色透明液體
封閉液1000 u 1/管l管/盒無色透明液體
鹼性磷酸酶抗體l"/管l管/盒無色透明液體
顯色劑A175u 1/管l管/盒黃色液體
顯色劑B320u 1/管l管/盒無色透明液體
緩衝液i 10x90ml/瓶l瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩衝液n iox80ml/瓶l瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩衝液III 10x20m/瓶3瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩衝液IV 10x90ml/瓶i瓶/盒淺黃色或無色透明液體
固定液90ml/瓶i瓶/盒無色透明液體
陽性對照標本6片/盒
上述試劑成分說明(所有試劑購自SIGMA)
1、 消化液20mg/ml蛋白酶K, 100mg蛋白酶K，加DEPO H20 5ml;
2、 保護液0. 2g的glycine加入lml的1 X緩衝液I ;'
3、 預雜交液IX緩衝液II 7.5ml 50XD 3ml
10mg/ml yest t-靈750ul
llmg/ml SALMON TESTES DNA 682ul 0. 04M EDTA 3ml 50% formamide 15ml
4、 封閉液0.03g的bloking (購買自羅氏公司)加入lml IX緩衝液
III;
5、 lOx緩衝液I: (PH7. 1-7.4) NaCl 80g
Na2HP(V12H20 3 60g KC1 2g KH2P04 2g
加三蒸水至11，並高壓滅菌；
6、 lOx緩衝液II: (PH7.0) NaCl 175.3g
檸檬酸鈉88.2g HCl 幾滴
加三蒸水至ll，並高壓滅菌；
7、 緩衝液III: (PH7.9) Tris 121. lg
NaCl 87.66g HCl60ml左右 加三蒸水至ll，並高壓滅菌；
8、 緩衝液IV:
1M Tris-HC1(PH9. 5): Tirs 121. lg加HCl 3ml左右，加水900ml，調PH
至9.5，加水至ll，並高壓滅菌；
1M NaCl: NaCl 58. 44加水至11，並高壓滅菌；
0. 5M MgCl2: 101. 65g MgCl2. 6H20加水至11，並高壓滅菌；
9、 固定液多聚甲醛40g加1X緩衝液I至ll，稍加熱(約50-60度)攪 拌至溶解；
10、 顯色劑A: NBT lg加70%DMF11.44ml;
11、 顯色劑B: BCIP lg加100%DMF30ml。 本發明的試劑盒可以多人份使用或一人份使用。 實施例2
一種GKN1基因原位雜交檢測方法及其試劑盒應用 一、標本處理
1、 用10ml的離心管，裝4. 5ml淋巴細胞分離液，再將3 ml抗凝血緩慢 加入含有淋巴細胞分離液(血淋巴細胞分離液=1:1.5)的離心管 中，2000r/min離心10 min;
2、 吸取中間層白細胞至另一離心管中，再在此管中加入約兩倍的IX緩衝液 I，混勻，1500g/min離心10 min;
3、 棄上清.沉澱加入約兩倍的1 X緩衝液I，混勻，1500g/min離心iO min;
4、 棄上清，並把試管口多餘的液體用擦手紙吸去。再將沉澱製成懸液，滴 在玻片上推片，自然乾燥。(有條件的醫院可以用製片機製片。)3 ml血，可以 做4張片子；
5、 用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1X緩衝液I洗5min。 每缸可以放16片；
6、 標本可保存在-2(TC，或繼續做實驗。
二、 將試劑盒中試劑配製成使用濃度
1、 將10X緩衝液I用三蒸水按1:10稀釋成1X緩衝液I ;
2、 將20 X緩衝液II用三蒸水按1:10稀釋成2 X緩衝液II;
按1:100稀釋成0. 2 X緩衝液II;按1:200稀釋成0. 1 X緩衝液II;
3、 將IOX緩衝液III用三蒸水按1:10稀釋成ix緩衝液m;
4、 IOX緩衝液IV用三蒸水按1:10稀釋成X緩衝液IV (取ltt， 2tt， 3tt各 10ml，加水至100ml既可)。
三、 實驗步驟
1、 取每位待檢者標本兩張，(另外兩張留作復査用)及陽性對照標本兩張 (每次實驗做一對陽性對照)；
2、 在玻璃缸裡加消化液(消化液100ul加1X緩衝液199. 9ml，即為使用濃 度)20 ml。 37。C水浴預熱10分鐘。放進16張玻片，37。C處理12 min，再用1 X緩衝液I洗5min;
3、 用0. 2%的保護液(保護液lml加1X緩衝液199ml即為使用濃度)洗10min， 三蒸水洗5min，以上過程都在玻璃缸進行。玻片自然乾燥；
4、 將玻片放入保溼盒內，加預雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保溼盒，放 在42'C恆溫水浴箱中3h以上；
5、 取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內，用70%， 90%， 95%的乙醇各洗 2min ，自然乾燥；
6、 將玻片放入保溼盒內，每位病人標本兩張， 一張加正義雜交液20ul/片， 另一張加反義雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保溼盒，放在42-C恆溫水浴 箱中16-24h;
7、 取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內
在42"C恆溫水浴箱中用2X緩衝液II洗兩次，每次15min 在42。C恆溫水浴箱中用0. 2X緩衝液II洗一次，每次15min 在42"C恆溫水浴箱中用0. 1 X緩衝液II洗兩次，每次15min;
8、 用IX緩衝液III洗30s,取出玻片，自然乾燥；
9、 將玻片放入保溼盒內，加0. 5%1封閉液(lml封閉液加5mllX緩衝液III) 100ul/片，蓋緊保溼盒，在室溫下作用30min;
10、 取出玻片，用IX緩衝液III洗30s，自然乾燥；
11、 將玻片放入保溼盒內，加鹼性磷酸酶抗體(加入1.8mllX緩衝液 ni)100ul/片，蓋緊保溼盒在室溫下作用30min;
12、 取出玻片，用IX緩衝液III洗3次，每次15min;
13、 1X緩衝液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73. 3ul，顯色劑B157. 5ul加 到30mllX緩衝液IV中，混勻)，室溫避光12h以上；
14、 用三蒸水洗5min，自然乾燥，(用甘油加10%的1 X緩衝液I混勻)封片 鏡檢。
四、結果判斷
在光鏡下計數100-300個細胞，計算染上紫色細胞的百分比。 陽性對照標本加反義雜交液的應該80%以上染上紫色。' 所有加正義雜交液的陰性內對照應無色。
胃癌病人GKN1基因低表達圖見圖1。正常人GKN1基因表達圖見圖2。 地高辛標記的cDNA、 RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標記優 點，還克服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內源性生物素幹憂等 缺點)，將該雜交探針與人體血液白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫 組化的方法顯色，在光鏡下觀察mRNA的存在和定位，根據染色的細胞數，判斷
目的基因的表達量。
本發明方法是目前常用的核酸原位雜交技術，該方法通過檢測底物細胞中
的GKN1基因表達量，用來確定胃癌是否發生，臨床研究表明，G認l基因是胃 癌的抑癌基因，因為GKN1基因在正常人中高表達，如果GKN1基因低表達，說 明胃癌已經發生，而且可能已轉移，從而獲得胃癌症的診斷信息。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通 技術人員，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些 改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。
SEQUENCE LISTING 〈110〉芮屈生物技術(上海)有限公司
〈120> —種GKNl基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用 / 1
<170〉 Patentln version 3. 1 〈210〉 1 〈211〉 820 〈212〉 謹
〈213〉 智人(Homo sapiens) 〈400〉 1
1
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ccaacataca tggctgagga gatgcaagag gcaagcctgt ttttttactc aggaacgtgc 600
tacacgacca gtgtactatg gattgtggac atttccttct gtggagacac ggtggag犯c 660
taaacaattt tttaaagcca ctatggattt agtcatctga atatgctgtg cagaaaaaat 720
atgggctcca gtggttttta ccatgtcatt ctgaaatttt tctctactag ttatgtttga 780
tttctttaag tttcaataaa atcatttagc attgaattca 820
權利要求
1. 一種GKN1基因的原位雜交檢測試劑盒在製備檢測胃癌疾病藥物中的應用，所述的試劑盒包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。
2. 根據權利要求1所述的應用，其特徵在於所述的雜交探針 序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。
3. 根據權利要求1或2所述的應用，其特徵在於所述的標記 物選自放射性核素或非放射性標記物。
4. 根據權利要求3所述的應用，其特徵在於所述的放射性核 素選自3H、 35S、 1251或32P中的一種。
5. 根據權利要求3所述的應用，其特徵在於所述的非放射性 標記物選自生物素、地高辛、鹼性磷酸酶、辣根過氧化酶或螢光素中的一種。
6. 根據權利要求5所述的應用，其特徵在於所述的非放射性標記物優選自地高辛。
7. 根據權利要求1或2所述的應用，其特徵在於所述的試劑盒還包括增效劑，所述的增效劑是鹼性磷酸酶抗體。
8. —種GKN1基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物， 其特徵在於，所述的雜交探針序列如SEQ IDNO. 1所示，所述的標記 物選自放射性核素或非放射性標記物。
9. 一種GKN1基因原位雜交檢測方法，其特徵在於，該方法包 括以下步驟a、 將權利要求8所述試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交複合體；b、 檢測a步驟得到的雜交複合體。
10.根據權利要求9所述的檢測方法，其特徵在於a步驟中形 成雜交複合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C;核酸雜交的時間 為16 — 24小時，所述的底物選用血液細胞標本或組織細胞標本。
全文摘要
本發明涉及一種GKN1基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。本發明還提供了一種GKN1基因原位雜交檢測方法。另外，本發明還提供了試劑盒在製備檢測胃癌疾病藥物中的應用。本發明優點在於本發明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。本發明的檢測方法操作方便、簡單，能在區級以上醫院普遍使用和推廣。
文檔編號C12Q1/68GK101386886SQ200810202078
公開日2009年3月18日 申請日期2008年10月31日 優先權日2008年10月31日 公開號200810202078.發明者張雲福, 裘建英 申請人:芮屈生物技術(上海)有限公司