一種體外誘導Hum24形成平行G4結構的方法及其應用的製作方法

2023-06-06 06:24:01 2

專利名稱：一種體外誘導Hum24形成平行G4結構的方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種體外誘導Hum24形成平行G4結構的方法及其應用。
技術背景端粒DNA是位於染色體末端並對染色體具有保護作用的富含鳥嘌呤(G)的 DNA序列，它由一段雙鏈重複區域和一段單鏈重複區域構成，人類和哺乳動物的 重複序列單元為TTAGGG。富含G的DNA單鏈在陽離子的誘導下可以通過G鹼 基間Hoogsteen氫鍵形成四鏈體(G4)。研究表明，85~90%惡性腫瘤的發病都與 端粒酶的活性有關，而DNAG4結構的形成可以有效抑制端粒酶的活性，進而達到 抑制腫瘤細胞生長的目的。因此，能夠誘導DNAG4形成並使之穩定的化合物有望 成為抗腫瘤的先導化合物，成為目前研究的熱點。大量研究表明，單鏈DNA (序列為TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG ， 簡稱為Hum24)在Na+溶液中形成反平行結構G4，在K+溶液中形成平行和反平行 共存的G4混合結構。 發明內容本發明的目的是提供一種體外誘導Hum24形成平行G4結構的方法。 本發明所提供的體外誘導Hum24形成平行G4結構的方法，是用L-多聚賴氨酸或其藥學上可接受的鹽誘導單鏈Hum24形成平行G4結構；所述L-多聚賴氨酸的結構式如下formula see original document page 3 式(I)所述Hum24的序列如序列表中序列1所示。所述L-多聚賴氨酸藥學上可接受的鹽具體可為溴鹽' 所述L-多聚賴氨酸的分子量為15000-30000。本發明的另一個目的是提供一種輔助篩選抗腫瘤藥物的方法。 本發明所提供的輔助篩選抗腫瘤藥物的方法，包括以下步驟1) 按照上述誘導單鏈Hum24形成平行G4結構的方法製備所述平行G4結構；2) 利用所述平行G4結構篩選待測物質，能使所述平行G4結構更穩定的物質 即為候選抗腫瘤藥物。實驗結果表明，用L-多聚賴氨酸誘導單鏈Hum24能夠形成穩定的平行G4結 構；該平行G4結構可用於輔助篩選抗腫瘤藥物。


圖1為Hum24在未加入L-多聚賴氨酸和加入L-多聚賴氨酸的條件下構象變化 的園二色譜圖(a) Hum24; (b)加入L-多聚賴氨酸，使Hum24與L-多聚賴氨 酸的摩爾比為6: 1;每個譜圖的摩爾橢圓度為-6—8 (mdeg)。圖2 a為L-多聚賴氨酸誘導單鏈Hum24形成的平行G4結構的熔點曲線圖；b 為加入米託蒽醌(MTO)的平行G4結構的熔點曲線圖。
具體實施方式
實施例l、 L-多聚賴氨酸誘導單鏈Hum24形成平行G4結構的方法 在無金屬離子存在的條件下，溶液中Hum24呈單鏈構型存在，這種構型在園 二色譜(CD)中有明顯的特徵在255 nm附近出現一個正峰，在238nm附近出 現一個負峰。當單鏈Hum24溶液中加入一定濃度多聚賴氨酸時，Hum24由單鏈轉 化為一種平行的G4結構，在CD譜中有明顯的特徵為在260nm附近出現一個正 峰，在240nm附近出現一個負峰。具體的實驗方法如下緩衝溶液為由如下終濃度的物質組成的水溶液10 mM Tris-HCl， lmM EDTA; pH 7.4。將30 OD單鏈Hum24 (上海英俊生物技術有限公 司)(其序列如序列表中序列1所示)溶解在所述緩衝溶液中得到濃度為200 ^M的 Hum24母液。將3.8mgL-多聚賴氨酸(分子量15000-30000， Sigma)溶解在所述 緩衝溶液中得到濃度為200pML-多聚賴氨酸母液。將L-多聚賴氨酸母液用所述緩 衝溶液稀釋成濃度分別為0.2pM、 0.25pM、 0.33pM、 0.4pM、 0.5|iM、 0.7pM、 lpM、 2pM的L-多聚賴氨酸溶液。取200 pM的單鏈Hum24溶液分別加入上述濃度的L-多聚賴氨酸溶液，使混合溶液中單鏈Hum24與L-多聚賴氨酸的摩爾比分別為io : i， 8: i， 6 : i， 5: i, 4 : i， 3: i， 2 : i， i : i。將上述混合溶液，均在25 °c孵育12h，採用圓二色譜儀測定其構象的變化情況。實驗結果表明單鏈Hum24與L-多聚賴氨酸的摩爾比對於平行G4結構的形成非常重要，只有在其摩爾比為8 : 1-4 : 1時才能形成平行G4結構。其中，單鏈Hum24與L-多聚賴氨酸摩爾比為6 : 1時形成的平行G4結構的園二色譜圖如圖1中b所示。通過變溫CD表徵由多聚賴氨酸誘導形成的平行G4結構的熱穩定性。DNA的 熔點(Tm)反映了它的熱穩定性。熔點越高說明該DNA越穩定，反之，熔點越低 該結構越不穩定。Hum24G4的熔點是指G4結構分解50n/。時的溫度。通過檢測此 平行G4結構在262 nm的CD信號隨著溫度升高的降低來得到它的熔點。具體的實驗方法如下將以單鏈Hum24與L-多聚賴氨酸摩爾比為6 : 1時形成 的平行G4結構通過圓二色譜變溫測定實驗進行熔點的測定。採用的儀器為Jasco815 圓二色譜儀，CD實驗中採用的CD吸收池光程為1 cm。在進行CD實驗前用高純 N2除氧5分鐘，而且實驗中也一直用高純N2作為保護氣以保證沒有臭氧出現，CD 實驗數據採集前，用緩衝溶液進行基線校對。在近紫外區220nm-320nm採集CD 光譜，掃描速度為500nm/min，採集次數為4次。在變溫實驗中採用JascoPTC-423S 控溫儀，升溫速度為2°C/min，通過監控262 nm CD信號來進行G4熔點的測定， 結果如圖2a所示。變溫CD結果表明此平行G4結構的熔點為45i:，比文獻報導 的金屬離子誘導形成的反平行結構以及混合結構的HumG4都穩定，說明多聚賴氨 酸誘導形成的平行G4結構是比較穩定的。熔點圖如圖2 a所示。實施例2、本發明輔助篩選抗腫瘤藥物的方法的可行性驗證採用已知抗腫瘤藥物米託蒽醌(MTO)來驗證該輔助篩選抗腫瘤藥物的方法的 可行性。首先，按照實施例1中提供的方法製備平行G4結構。將單鏈Hum24 (上 海英俊生物技術有限公司)(其序列如序列表中序列1所示)溶液與L-多聚賴氨酸 溶液混合，使混合溶液中Hum24與L-多聚賴氨酸的摩爾比為6 : 1，將上述混合溶 液，在25'C孵育12h，採用圓二色譜儀測定其構象的變化情況。通過圓二色譜證 明形成了平行G4結構。然後在所形成的平行G4結構中加入2pM米託蒽醌(MTO) 溶液,反應12小時後，參照實施例1中的方法測定其熔點。變溫CD結果表明加入 MTO的平行G4結構的熔點為65°C，比單純此平行G4結構的熔點提高了 20 °C。 熔點圖如圖2b所示。說明本發明提供的輔助篩選抗腫瘤藥物的方法可用於篩選抗 腫瘤藥物。序列表11 <211〉24 DNA 人工序列 <400〉1Uagggttag ggttagggtt aggg
權利要求
1、一種體外誘導Hum24形成平行G4結構的方法，其特徵在於用L-多聚賴氨酸或其藥學上可接受的鹽誘導單鏈Hum24形成平行G4結構；所述L-多聚賴氨酸的結構式如下式(I)所述Hum24的序列如序列表中序列1所示。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述L-多聚賴氨酸藥學上可接受 的鹽為溴鹽。
3、 根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述L-多聚賴氨酸的分子量 為15000-30000。
4、 一種輔助篩選抗腫瘤藥物的方法，包括以下步驟1) 按照權利要求1-3任一所述的方法製備所述平行G4結構；2) 利用所述平行G4結構篩選待測物質，能使所述平行G4結構更穩定的物質即 為候選抗腫瘤藥物。
全文摘要
本發明公開了一種體外誘導Hum24形成平行G4結構的方法及其應用。該方法是用L-多聚賴氨酸誘導單鏈Hum24形成平行G4結構，所述L-多聚賴氨酸的結構如式(I)所示。實驗結果表明，用L-多聚賴氨酸誘導單鏈Hum24能夠形成穩定的平行G4結構，該平行G4結構可用於輔助篩選抗腫瘤藥物。
文檔編號C07H21/00GK101235065SQ20081010126
公開日2008年8月6日 申請日期2008年3月3日 優先權日2008年3月3日
發明者向俊峰, 唐亞林, 張秀鳳 申請人:中國科學院化學研究所