一種具有生物活性的人工角膜的製備方法
2023-06-11 16:52:41 1
專利名稱：一種具有生物活性的人工角膜的製備方法
技術領域：
本發明屬於生物材料的人工器官技術領域，具體涉及一種具有生物活性人工角膜的製備方法。
背景技術：
角膜炎症、外傷、化學燒傷、先天性異常等疾病常導致角膜損傷、造成視力下降甚至致盲，角膜移植的方法是臨床上最為有效的解決方案，但異體角膜供體的來源嚴重缺乏，而且移植前還需要進行配型，大大制約了角膜移植手術的開展，使大量角膜損傷的患者不能得到及時治療，最終導致失明。在我國，每年因角膜損傷而致盲的患者約有30萬，而能夠接受角膜移植的患者僅有2000多例。在某些特殊情況下，例如化學性燒傷、眼部類天皰瘡、Stevens-Johnson症候群、反覆角膜移植排斥等，角膜移植的成功率就很低。因此臨床上迫切需要一種可供移植的角膜替代物，這類替代物具有以下要求(1)具有優良的生物相容性和組織相容性；(2)具有適當的網孔結構，有利於細胞的長入；(3)具有一定的可加工性，能根據實際需要加工成不同的屈光度，植入體內最終可完全透明；(4)包含促進角膜細胞生長和阻止局部病變發展的功能成分。雖然目前對人工角膜生物材料的研究較多，但都具有一定的缺陷，不能滿足實際應用的要求。
羊膜是目前臨床上使用較多的一種角膜覆蓋材料，具有完整的基底膜和細胞外基質，生物相容性較高，缺點是羊膜相對較薄，厚度僅為20～100μm，僅適用於治療眼表淺度損傷，對於深度或角膜基質缺損的療效不佳。
相比而言，異種角膜來源豐富，具有與人體角膜基質相似的組織結構，移植后角膜的厚度、屈光度保持不變，感覺神經可以長入，知覺能夠恢復；然而其中所含的細胞成分和基質蛋白成分都將導致異種角膜移植後產生強烈的免疫排斥反應，致使移植失敗。如果能夠去除異種角膜的免疫源性，則可避免這一問題的出現，解決臨床角膜供體不足的問題。目前研究中常用的方法是採用去垢劑和核酸酶的方法去除異種角膜中的細胞成分，如姚玉峰申請的中國專利(200410018107.5)「一種無細胞的異種角膜基質及製備方法和用途」，其製備方法是將獲取的新鮮動物角膜，用離子型或非離子型去垢劑洗脫角膜基質細胞膜成分，再使用核酸酶法去除核酸；將無細胞異種角膜基質脫水處理後保存備用。存在的問題是由於其採用的異種動物角膜經過脫細胞處理，僅去除了角膜內皮細胞和基質細胞，未考慮殘留的異種基質蛋白成分的生物不相容所引發的免疫排斥反應；同時在製備過程中使用了多種去垢劑，其不可避免的殘留會對細胞產生毒性，影響臨床治療效果；而且該發明處理後的角膜不含一些抑制局部病變發展和有利於角膜細胞生長的功能組分，難以獲得理想的修復效果。
發明內容
針對現有技術的不足，本發明的目的是提出一種具有生物活性的人工角膜的製備方法，使製備的人工角膜具有與正常角膜相似的拉伸強度、屈光度，植入患處後可阻止病變發展及角膜溶解，促進角膜上皮再生及基質膠原合成，減少新生血管生成；同時具有良好的生物相容性，無明顯的免疫排斥反應，對細胞無毒性，可治療各種眼損傷。
為實現上述目的，本發明人工角膜的製備包括有動物角膜的預處理步驟，本發明是將預處理後的角膜採用酶消化、反覆凍融、洗滌、60Co輻照、複合促進角膜細胞生長或/和阻止局部病變發展的功能組分的步驟製備。其具體方法按照以下步驟操作(1)酶消化將預處理後的動物角膜置於1000～8000U/ml蛋白酶溶液中消化30分鐘～12小時，以去除角膜表皮細胞及角膜內皮細胞，消化時間的長短取決於消化環境溫度，溫度低則消化時間長；再用蒸餾水漂洗角膜，洗去殘留的蛋白質後，用蒸餾水繼續浸泡，使角膜內基質細胞充分溶脹。
(2)反覆凍融將溶脹後的角膜置於液氮中至少30分鐘，確保角膜內外的溫度達到一致；取出角膜後置於室溫下自然解凍，如此反覆凍融2～5次，使細胞完全破裂崩解；用蒸餾水漂洗角膜，洗去殘留；(3)洗滌將漂洗後的角膜置於含表面活性劑(如脫氧膽酸鈉、聚乙二醇1000等)的溶液中溶解細胞，震蕩洗滌6～12小時，溶解角膜中的脂類、蛋白質等；用蒸餾水漂洗角膜，目的是將溶解的細胞成分和表面活性劑徹底洗脫；(4)60Co輻照將洗滌後的角膜凍幹，將凍幹後的角膜使用60Co輻射，輻照總劑量為5～20kGY，目的一方面是消毒；一方面可以使殘留的基質蛋白變性失活，以去除異種角膜所引起免疫排斥反應的抗原；輻照後的角膜可在低溫下儲存；(5)輻照處理後的角膜還可以根據受體角膜損傷情況，複合促進角膜細胞生長或/和阻止局部病變發展的功能組分，其可以是表皮細胞生長因子、血小板源性生長因子、轉化生長因子、鹼性成纖維細胞生長因子、血管內皮細胞生長因子、神經生長因子、膠原酶抑制劑、抗生素、半胱氨酸中的一種或是幾種，使其具有抗感染能力，並可抑制創面膠原纖維的破壞，促進角膜創面的癒合。複合的方法可採用(中國專利98125671.6說明書第2頁)文獻中所述的煅燒骨與BMP複合的方法或其他現有技術進行。可以採用凍幹儲存。
(6)光學加工根據需要，可以對製備的人工角膜採用角膜切削刀或雷射進行表面加工，使其具有一定的屈光度，以滿足受體眼部的光學要求。
本發明所製備的具有活性的人工角膜可用於各種角膜損傷的治療，存放於4℃環境下可保存一年以上。
本發明用於修復人體角膜損傷的人工角膜的製備方法以及按其方法獲得的人工角膜與現有技術和產品相比，具有以下優點1)本發明的製備方法具有成本低、方法簡便、易於操作的優點。
2)本發明製備的人工角膜可應用於炎症、潰瘍、化學燒傷等原因造成的角膜潰瘍或角膜穿孔的角膜移植手術，具有一定的彈性、韌性，其形狀大小和厚度易於改變。
3)本發明製備的人工角膜，經凍幹處理為白色海綿狀，具有網孔結構，可促進細胞的正常附著和生長，植入體內可逐漸被受體細胞所改建，最終可完全透明。
4)本發明製備的人工角膜具有與人體角膜相似的拉伸強度、屈光度，易於根據受體的需求進行加工。
5)本發明由於在製備過程中主要使用物理方法來去除抗原成分，與現有技術工藝相比大大減少了化學物質的使用，尤其是未採用對細胞有較大毒性的曲拉通X-100，減少了化學物質殘留，提高了所獲得角膜的生物相容性，利於被機體接受；而且本發明使用的表面活性劑(如脫氧膽酸鈉等)具有容易洗脫，殘留量少的特點。
6)本發明製備的人工角膜通過複合促進角膜細胞生長和阻止局部病變發展的功能組分在植入病損的創面後可抗感染、阻止潰瘍發展及角膜溶解，促進基質膠原合成及上皮再生，減少新生血管生成，最終可形成與正常角膜相似的結構。
7)本發明製備的人工角膜通過低滲溶液溶脹、反覆凍融、表面活性劑洗滌、60Co輻照後，去除了異種角膜的細胞成分和基質蛋白活性，大大降低了異種移植引起的免疫排斥反應。
8)本發明製備的人工角膜還具有使用簡便、來源廣泛和易於貯存的特點，對各種普通眼損傷有良好的治療效果，是一種較好的角膜修復材料。
附圖及其說明
圖1、本發明製備的人工角膜外觀的照片，呈白色海綿狀結構。
圖2、本發明製備的人工角膜掃描電子顯微鏡的照片，可見角膜表面呈多孔狀結構。
圖3、兔角膜潰瘍照片，可見角膜缺損，局部有膿性分泌物。
圖4、使用本發明製備的人工角膜修復兔角膜潰瘍手術後的照片，可見植片與植床縫合緊密，呈凹盤狀。
圖5、本發明製備的人工角膜移植術後2月的兔眼部照片，可見角膜透明度明顯增強。
圖6、本發明製備的人工角膜移植術後4月的兔眼部照片，可見裂隙燈下角膜透明，曲率自然，厚度均勻一致。
具體實施例方式
以下將通過實施例對本發明做進一步的說明本發明可以選用牛、豬、馬、羊的角膜為材料進行預處理，將剝離去掉周圍組織的動物角膜，在生理鹽水中浸泡，使其溶脹後削切至所需厚度。
1)酶消化將預處理後的豬眼角膜置於4000U/ml的胰蛋白酶溶液中在室溫下(25℃)消化1小時。用蒸餾水漂洗角膜，洗去殘留的蛋白酶；再將角膜置於蒸餾水中浸泡4小時，使角膜內的基質細胞充分溶脹；
2)反覆凍融將溶脹後的角膜置於液氮中(-196℃)浸泡1小時；取出角膜後置於室溫下自然解凍，如此反覆凍融4次，用蒸餾水漂洗角膜；3)洗滌將凍融後的角膜置於40g/L濃度的脫氧膽酸鈉溶液中，室溫下(15℃)震蕩洗滌6小時，用蒸餾水漂洗角膜；4)60Co輻照將洗滌後的角膜置於真空冷凍乾燥機進行凍幹，將凍幹後的角膜使用60Co輻射，輻照總劑量為16kGY，採用4kGY/分鐘的劑量照射4分鐘；5)將輻照處理後的角膜片置於含有5μg/ml表皮生長因子、5μg/ml鹼性成纖維細胞生長因子和5％(m/v)半胱氨酸(可抑制角膜創面膠原纖維的破壞，促進潰瘍的癒合)的緩衝溶液中浸泡6小時後取出凍幹儲存。附圖1和2為製備的人工角膜的照片。
6)光學加工對所製備的人工角膜使用角膜切削刀或雷射對其表面進行加工，使其具有一定的屈光度，以滿足受體眼部的光學要求。
動物試驗採用眼表潰瘍的2月齡紐西蘭兔(圖3)，2％戊巴比妥鈉腹腔注射30mg/kg麻醉至四肢鬆軟呼吸平穩後，解剖顯微鏡下用6mm環鑽切除病變角膜，剖切深度符合病變深度。用10-0尼龍線將6.5mm人工角膜平整置於植床上縫合固定(圖4)，手術方法和術後護理與常規板層角膜移植手術相同。結果顯示，術後一周，植入的角膜開始半透明，術後2月，角膜恢復透明(圖5)，術後4個月大體觀察角膜清晰度良好，裂隙燈下角膜透明，曲率自然，厚道均勻一致(圖6)，在修復過程中未見周圍角膜組織水腫及炎性反應。
權利要求
1.一種具有生物活性的人工角膜的製備方法，包括有動物角膜的預處理步驟，其特徵在於將預處理後的角膜採用酶消化、反覆凍融、洗滌、60Co輻照、複合促進角膜細胞生長或/和阻止局部病變發展的功能組分的步驟製備。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，具體操作按以下步驟(1)酶消化將預處理後的動物角膜置於1000～8000U/ml蛋白酶溶液中消化30分鐘～12小時，再用蒸餾水漂洗角膜，蒸餾水浸泡角膜，使其充分溶脹；(2)反覆凍融將溶脹後的角膜置於液氮中至少30分鐘，取出角膜後置於室溫下自然解凍，如此反覆凍融2～5次，用蒸餾水漂洗角膜；(3)洗滌將漂洗後的角膜置於含表面活性劑的溶液中溶解細胞，震蕩洗滌6～12小時，用蒸餾水漂洗角膜；(4)60Co輻照將洗滌後的角膜凍幹，將凍幹後的角膜使用60Co輻射，輻照總劑量為5～20kGY。
3.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，所述的複合促進角膜細胞生長或/和阻止局部病變發展的功能組分，可以是表皮細胞生長因子、血小板源性生長因子、轉化生長因子、鹼性成纖維細胞生長因子、血管內皮細胞生長因子、神經生長因子、膠原酶抑制劑、抗生素、半胱氨酸中的一種或是幾種。
4.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，對複合功能組分後的角膜採用角膜切削刀或雷射進行表面光學加工。
全文摘要
一種具有生物活性的人工角膜的製備方法，本發明以動物角膜基質為材料，採用酶消化、反覆凍融、洗滌文檔編號A61F2/14GK1879578SQ20051004281
公開日2006年12月20日 申請日期2005年6月15日 優先權日2005年6月15日
發明者張勇傑, 金巖, 劉源, 趙宇 申請人:西安組織工程工程技術研究中心