四碳醇的發酵生產的製作方法

2023-12-04 03:25:51 2

專利名稱：：四碳醇的發酵生產的製作方法
技術領域：
：本發明涉及工業微生物學和醇類生產的領域。更具體地，通過重組微生物的工業發酵來產生異丁醇。
背景技術：
：丁醇是重要的工業化學物質，用作燃料添加劑，塑料工業中的原料化學物質以及食品和香料工業中的食品級萃取劑。每年通過石油化學方法產生100至120億磅的丁醇，並且對這種曰用化學物質的需求很可能增加。異丁醇化學合成的方法是已知的，如氧化合成，一氧化碳的催化氬化((7//膨ww:sEwqyc/o/e(iza。/iWw血a/C/ze/mW^,第6版，2003,Wiley-VCHVerlagGmbHandCo.,Weinheim，Germany,Vol.5,pp.716-719)以及甲醇和n-丙醇的Guerbet縮合(Carlini等，丄A/o/.Cafa/.A-215-220(2004))。這些方法使用源自石油化學，並且通常是昂貴的，環境不友好的原料。從植物產生的原料生產異丁醇將最小化溫室氣體釋放並將表示本領域中的進展。異丁醇是作為酵母發酵的副產物通過生物產生的。它是作為通過該組真菌不完全代謝胺基酸的結果形成的"雜醇油"的組分。從L-纈氨酸的分解代謝特異性地產生異丁醇。作為氮源收集L-纈氨酸的胺基後，通過所謂的Ehrlich途徑將所得到的a-酮酸脫羧基並還原成異丁醇(Dickinson等，丄腸/.CZew.273(40):25752-25756(1998))。在飲料發酵過程中獲得的雜醇油和/或其組分的產量通常是低的。例如，報導了啤酒發酵中產生的異丁醇濃度低於百萬分之16(Garda等，屍race^B/ocAe/mWAy29:303-309(1994))。將外源L-纈氨酸添加至發酵中提高了異丁醇的產量，如Dickinson等所迷的，上文，其中報導了通過在發酵中提供20g/L濃度的L-纈氨酸獲得了3g/L異丁醇的產量。然而，將纈氨酸用作原料對於工業規模的異丁醇生產成本過高。直接從糖生物合成異丁醇在經濟上是可行的，並將表示本領域中的進展。沒有設計重組微生物來生產異丁醇的報導。因此，存在對環境負責的，成本有效的作為單一產物的異丁醇生產方法的需求。本發明通過提供表達異丁醇生物合成途徑的重組微生物生產宿主解決了這種需求。發明概述本發明提供了具有工程化異丁醇生物合成途徑的重組微生物。該工程化的微生物用於異丁醇的商業性生產。因此，在一個實施方案中，本發明提供了重組微生物宿主細胞，其包括至少一個編碼多肽的DNA分子，該多肽催化選自以下的底物至產物的轉化i)丙酮酸至乙醯乳酸(途徑步驟a)ii)乙醯乳酸至2，3-二羥基異戊酸(途徑步驟b)iii)2,3-二羥基異戊酸至a-酮基異戊酸(途徑步驟c)iv)a-酮基異戊酸至異丁醛(途徑步驟d)，和v)異丁醛至異丁醇(途徑步驟e)其中至少一個DNA分子對於所迷微生物宿主細胞是異源的，並且其中所迷微生物宿主細胞產生異丁醇。在另一個實施方案中，本發明提供了重組微生物宿主細胞，其包括至少一個編碼多肽的DNA分子，該多肽催化選自以下的底物至產物的轉化i)丙酮酸至乙醯乳酸(途徑步驟a)ii)乙醯乳酸至2，3-二羥基異戊酸(途徑步驟b)iii)2，3-二羥基異戊酸至a-酮基異戊酸(途徑步驟c)iv)a-酮基異戊酸至異丁醯-CoA(途徑步驟f)v)異丁醯-CoA至異丁醛(途徑步驟g)，和vi)異丁醛至異丁醇(途徑步驟e)其中至少一個DNA分子對於所述微生物宿主細胞是異源的，並且其中所迷微生物宿主細胞產生異丁醇。在另一實施方案中，本發明提供了重組微生物宿主細胞，其包括至少一個編碼多肽的DNA分子，該多肽催化選自以下的底物至產物的轉化i)丙酮酸至乙醯乳酸(途徑步驟a)ii)乙醯乳酸至2，3-二輕基異戊酸(途徑步驟b)iii)2,3-二羥基異戊酸至a-酮基異戊酸(途徑步驟c)iv)a-酮基異戊酸至纈氨酸(途徑步驟h)v)纈氨酸至異丁胺(途徑步驟i),vi)異丁胺至異丁醛(途徑步驟j)，和vii)異丁醛至異丁醇(途徑步驟e)其中至少一個DNA分子對於所述微生物宿主細胞是異源的，並且其中所述微生物宿主細胞產生異丁醇。在另一實施方案中，本發明提供了生產異丁醇的方法，其包括1)提供重組微生物宿主細胞，其包括至少一個編碼多肽的DNA分子，該多肽催化選自以下的底物至產物的轉化1)丙酮酸至乙醯乳酸(途徑步驟a)ii)乙醯乳酸至2，3-二羥基異戊酸(途徑步驟b)iii)2,3-二羥基異戊酸至a-酮基異戊酸(途徑步驟c)iv)a-酮基異戊酸至異丁醛(途徑步驟d)，和v)異丁醛至異丁醇(途徑步驟e)其中至少一個DNA分子對所述微生物宿主細胞是異源的；和2)在由此產生異丁醇的條件下將(i)中的宿主細胞接觸發酵培養基中的可發酵碳底物。在另一實施方案中，本發明提供了生產異丁醇的方法，其包括1)提供重組微生物宿主細胞，其包括至少一個編碼多肽的DNA分子，該多肽催化選自以下的底物至產物的轉化i)丙酮酸至乙醯乳酸(途徑步驟a)ii)乙醯乳酸至2，3-二羥基異戊酸(途徑步驟b)iii)2，3-二羥基異戊酸至a-酮基異戊酸(途徑步驟c)iv)a-酮基異戊酸至異丁醯-CoA(途徑步驟f)v)異丁醯-CoA至異丁醛(途徑步驟g)，和vi)異丁搭至異丁醇(途徑步驟e)其中至少一個DNA分子對於所迷微生物宿主細胞是異源的；和2)在由此產生異丁醇的條件下將(i)中的宿主細胞接觸發酵培養基中的可發酵碳底物。在另一實施方案中，本發明提供了生產異丁醇的方法，其包括1)提供重組微生物宿主細胞，其包括至少一個編碼多肽的DNA分子，該多肽催化選自以下的底物至產物的轉化1)丙酮酸至乙醯乳酸(途徑步驟a)ii)乙醯乳酸至2，3-二羥基異戊酸(途徑步驟b)iii)2,3-二羥基異戊酸至a-輛基異戊酸(途徑步驟c)iv)a-酮基異戊酸至纈氨酸(途徑步驟h)v)纈氨酸至異丁胺(途徑步驟i)，vi)異丁胺至異丁醛(途徑步驟j),和vii)異丁醛至異丁醇(途徑步驟e)其中至少一個DNA分子對於所述微生物宿主細胞是異源的；和2)在由此產生異丁醇的條件下將(i)中的宿主細胞接觸發酵培養基中的可發酵碳底物。在可替換的實施方案中，本發明提供了通過本發明的方法產生的含有異丁醇的發酵培養基。附圖和序列表簡述從以下形成本申請一部分的詳述，附圖和附帶的序列描迷可以更全面地了解本發明。圖1顯示了四個不同的異丁醇生物合成途徑。標記為"a","b","c，，，"d"，"e，，，"f，，"g"，"h"，"i，，，"j，，和"k，，的步驟表示以下所述的底物至產物的轉化。以下的序列符合37C.F.R.1.821-1.825("含有核苷酸序列和/或胺基酸序列公開內容的專利申請的要求-序列規定")並符合世界智慧財產權組織(WIPO)標準ST.25(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(細則5.2和49.5(a-bis),和行政指令的208條和附錄C)。用於核苷酸和M酸序列數椐的符號和格式遵照37C.F.R.§1.822中列出的規定。表1基因和蛋白質SEOID編號的概括tableseeoriginaldocumentpage14tableseeoriginaldocumentpage15tableseeoriginaldocumentpage16tableseeoriginaldocumentpage17SEQIDNO:11-38，40-69,72-75,85-138,144,145，147-157,159-176是本文所述實施例中使用的寡核苷酸克隆，篩選或測序引物的核苷酸序列。SEQIDNO:39是實施例16中所述的c^S^4基因簇的核苷酸序列。SEQIDNO:70是實施例13中所述的葡萄糖異構酶啟動子1.6GI的核苷酸序列。SEQIDNO:71是實施例13中所述的1.5GI啟動子的核苷酸序列。SEQIDNO:76是實施例17中所述的GPD啟動子的核苷酸序列。SEQIDNO:77是實施例17中所述的CYC1終止子的核苷酸序列。SEQIDNO:79是實施例17中所述的FBA啟動子的核苷酸序列。SEQIDNO:81是實施例17中所述的ADH1啟動子的核苷酸序列SEQIDNO:82是實施例17中所述的ADH1終止子的核苷酸序列。SEQIDNO:84是實施例17中所述的GMP啟動子的核苷酸序列。SEQIDNO:139是蔗糖水解酶(CscA)的胺基酸序列。SEQIDNO:140是D-果糖激酶(CscK)的胺基酸序列。SEQIDNO:141是蔗糖透性酶(CscB)的胺基酸序列。SEQIDNO:142是實施例20中所述的質粒pPF988DssPspac的核苷酸序列。SEQIDNO:143是實施例20中所述的質粒pPF988DssPgroE的核苷酸序列。SEQIDNO:146是實施例20中所述的pPF988Dss載體片段的核苷酸序列。SEQIDNO:177是實施例21中所迷的質粒pPF988整合栽體的核苷酸序列。SEQIDNO:267是實施例21中所述的質粒pC194的核香酸序列。發明詳述本發明涉及使用重組微生物生產異丁醇的方法。本發明滿足各種商業和工業需求。丁醇是具有多種應用的重要工業日用化學品，其中其作為燃料或燃料添加劑的潛能是特別重要的。儘管只是四碳醇，丁醇具有與汽油相似的能含量並可以與任何礦物燃料混合。喜歡將丁醇作為燃料或燃料添加劑，因為它在標準內燃機中燃燒時只產生C02並且幾乎沒有SOx或NOx。此外，丁醇比迄今為止最優選的燃料添加劑乙醇的腐蝕性小。除了作為生物燃料或燃料添加劑的用途，丁醇具有影響新興燃料電池工業中氫分配問題的潛能。目前燃料電池受到與氫運輸和分配相關的安全問題的困擾。對於氫含量可以將丁酵容易地重組，並可以通過現有的加油站分配，以燃料電池或車輛需要的純度。最後，本發明從源自植物的碳源生產異丁醇，避免了與丁醉生產的標準石化方法相關的負面環境影響。以下的定義和縮寫用於權利要求和說明書的解釋。如在此所用的術語"發明"和"本發明"是非限制性的術語，不是用來指特定發明的任何單個實施方案，而是包括如說明書和權利要求中所述的所有可能的實施方案。術語"異丁醇生物合成途徑"指的是產生異丁醇的酶途徑。在此可交替使用的術語"乙醯乳酸合酶，，和"乙醯乳酸合成酶"指的是催化丙酮酸轉化成乙醜乳酸和C02的酶。優選的乙醜乳酸合酶已知為EC編號2.2丄69(E"2ymeA^we"c/^wre(酶命名)/992,AcademicPress,SanDiego)。這些酶可從各種來源獲得，包括但不限於，枯草芽孢桿菌(GenBankNo:CAB15618(SEQIDNO:178)，Z99122(SEQIDNO:78)，各自為NCBI(國立生物技術信息中心)胺基酸序列，NCBI核苷酸序列),肺炎克雷伯氏菌(GenBankNo:AAA25079(SEQIDNO:2)，M73842(SEQIDNO:l)),和乳酸乳球菌(GenBankNo:AAA25161(SEQIDNO:180),LI6975(SEQIDNO:179))。在此可交替使用的術語"乙醯醇酸異構還原酶"和"乙醯醇酸還原異構酶"指的是使用NADPH(還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯)作為電子供體催化乙醯乳酸轉化成2,3-二羥基異戊酸的酶。優選的乙醯醇酸異構還原酶已知為EC編號1丄1.86,並且可從大量的微生物陣列中獲得序列，這些微生物包括但不限於，大腸桿菌(GenBankNo:NP一418222(SEQIDNO:4)，NC—000913(SEQIDNO:3))，釀酒酵母(GenBankNo:NP—013459(SEQIDNO:181),NC—001144(SEQIDNO:80))，海藻甲烷球菌(GenBankNo:CAF30210(SEQIDNO:183),BX957220(SEQIDNO:182)),和枯草芽孢桿菌(GenBankNo:CAB14798(SEQIDNO:158),Z99118(SEQIDNO:184))。術語"乙醯醇酸脫水酶"指的是催化2,3-二羥基異戊酸轉化成a-酮基異戊酸的酶。優選的乙醯醇酸脫水酶已知為EC編號4.2.1.9。這些酶可從大量的微生物陣列中獲得序列，這些微生物包括但不限於，大腸桿菌(GenBankNo:YP一026248(SEQIDNO:6)，NC—000913(SEQIDNO:5))，釀酒酵母(GenBankNo:NP一012550(SEQIDNO:186)，NC—001142(SEQIDNO:83))，海藻甲烷球菌(GenBankNo:CAF29874(SEQIDNO:188)，BX957219(SEQIDNO:187)),和枯草芽孢桿菌(GenBankNo:CAB14105(SEQIDNO:190)，Z99115(SEQIDNO:189))。術語"支鏈a-酮酸脫羧酶"指的是催化a-酮基異戊酸轉化成異丁醛和C02的酶。優選的支鏈a-酮酸脫羧酶已知為EC編號4.1.1.72並可從各種來源獲得，包括但不限於，乳酸乳球菌(GenBankNo:AAS49166(SEQIDNO:193),AY548760(SEQIDNO:192);CAG34226(SEQIDNO:8),AJ746364(SEQIDNO:191)，鼠傷寒沙門氏菌(GenBankNo:NP—461346(SEQIDNO:195)，NC—003197(SEQIDNO:194))，和丙醇丁酮梭菌(GenBankNo:NP—149189(SEQIDNO:197)，NC—001988(SEQIDNO:196))。術語"支鏈醇脫氫酶"指的是催化異丁醛轉化成異丁醇的酶。優選的支鏈醇脫氫酶已知為EC編號1.1.1.265，但也可以歸類於其他醇脫氫酶(特別是，EC1.1.1.1或l丄l.2)。這些酶使用NADH(還原型煙醯胺腺噤呤二核苷酸)和/或NADPH作為電子供體，並從各種來源可獲得，包括但不限於，釀酒酵母(GenBankNo:NP_010656(SEQIDNO:199),NC—001136(SEQIDNO:198);NP—014051(SEQIDNO:201)，NC—001145(SEQIDNO:200))，大腸桿菌(GenBankNo:NP_417484(SEQIDNO:10),NC—000913(SEQIDNO:9))，和丙醇丁酮梭菌(GenBankNo:NP—349892(SEQIDNO:203),NC_003030(SEQIDNO:202);NP一349891(SEQIDNO:204)，NC—003030(SEQIDNO:158))。術語"支鏈酮酸脫氬酶"指的是催化a-酮基異戊酸轉化成異丁醯-CoA(異丁醯-輔酶A)的酶，使用NAD+(煙醯胺腺噪呤二核苷酸)作為電子受體。優選的支鏈酮酸脫氫酶已知為EC編號1.2.4.4。這些支鏈酮酸脫氫酶由四個亞基構成，並且所有亞基的序列可從大量微生物陣列中獲得，這些維生物包括但不限於，枯草芽孢桿菌(GenBankNo:CAB14336(SEQIDNO:206),Z99116(SEQIDNO:205);CAB14335(SEQIDNO:208)，Z99116(SEQIDNO:207);CAB14334(SEQIDNO:210)，Z99U6(SEQIDNO:209);和CAB14337(SEQIDNO:212)，Z99U6(SEQIDNO:2U))和惡臭假單胞菌(GenBankNo:AAA65614(SEQIDNO:214)，M57613(SEQIDNO:213);AAA65615(SEQIDNO:216)。M57613(SEQIDNO:215);AAA65617(SEQIDNO:218)，M57613(SEQIDNO:217);和AAA65618(SEQIDNO:220),M57613(SEQIDNO:219))。術語"醯化醛脫氫酶"指的是催化異丁醯-CoA轉化成異丁醛的酶，使用NADH或NADPH作為電子供體。優選的醯化^脫氫酶已知為EC編號1.2.1.10和1.2.1.57。這些酶可從多個來源獲得，包括但不限於，拜氏梭菌(GenBankNo:AAD31841(SEQIDNO:222)，AF157306(SEQIDNO:221))，丙醇丁酮梭菌(GenBankNo:NP_149325(SEQIDNO:224),NC—001988(SEQIDNO:223);NP—149199(SEQIDNO:226),NC_001988(SEQIDNO:225)),惡臭假單胞菌(GenBankNo:AAA89106(SEQIDNO:228),U13232(SEQIDNO:227))，和嗜熱棲熱菌(GenBankNo:YP—145486(SEQIDNO:230)，NC—006461(SEQIDNO:229))。術語"轉氨酶"指的是催化a-酮基異戊酸轉化成L-纈氨酸的酶，使用丙氨酸或穀氨酸作為胺供體。優選的轉氨酶已知為EC編號2.6.1.42和2.6.1.66。這些酶可從多種來源獲得。丙氨酸依賴性酶的來源實例包括，但不限於，大腸桿菌(GenBankNo:YP—026231(SEQIDNO:232)，NC—000913(SEQIDNO:231))和地衣芽孢桿菌(GenBankNo:YP—093743(SEQIDNO:234),NC—006322(SEQIDNO:233))。穀氨酸依賴性酶的來源實例包括，但不限於，大腸桿菌(GenBankNo:YP—026247(SEQIDNO:236)，NC—000913(SEQIDNO:235)),釀酒酵母(GenBankNo:NP—012682(SEQIDNO:238),NC_00U42(SEQIDNO:237))和嗜熱鹼甲烷桿菌(GenBankNo:NP—276546(SEQIDNO:240)，NC—000916(SEQIDNO:239))。術語"纈氨酸脫氫酶"指的是催化a-酮基異戊酸轉化成L-繩氨酸的酶，使用NAD(P)H作為電子供體和氨作為胺供體。優選的纈氨酸脫氬酶已知為EC編號1.4.1.8和1.4.1.9,並可從各種來源獲得，包括但不限於，天藍色鏈黴菌(GenBankNo:NP—628270(SEQIDNO:242),NC—003888(SEQIDNO:241))和枯草芽孢桿菌(GenBankNo:CAB14339(SEQIDNO:244)，Z99116(SEQIDNO:243))。術語"纈氨酸脫羧酶"指的是催化L-緗氨酸轉化成異丁胺和C02的酶。優選的翔氨酸脫羧酶已知為EC編號4丄1."。這些酶可在鏈黴菌中找到，如例如，生綠鏈黴菌(GenBankNo:AAN10242(SEQIDNO:246)，AY116644(SEQIDNO:245))。術語"w轉氨酶"指的是催化異丁胺轉化成異丁搭的酶，使用合適的胺基酸作為胺供體。優選的co轉氨酶已知為EC編號2.6丄18並可從各種來源獲得，包括但不限於，反硝化產鹼菌(AAP92672(SEQIDNO:248)，AY330220(SEQIDNO:247)),真養雷氏菌(GenBankNo:YP—294474)(SEQIDNO:250),NC—007247(SEQIDNO:249))，S/iewa"e〃aorte/c^"ws(GenBankNo:NP—71卯46(SEQIDNO:252)，NC—004347(SEQIDNO:251))，和悉臭脅i羊胞菌(GenBankNo:AAN66223(SEQIDNO:254)，AE016776(SEQIDNO:253))。術語"異丁醯-CoA突變酶"指的是催化丁醯-CoA轉化成異丁醯-CoA的酶。這種酶使用輔酶Bi2作為輔因子。優選的異丁醯-CoA突變酶已知為EC編號5.4.99.13。在各種鏈黴菌中找到這種酶，包括但不限於，肉桂地鏈黴菌(GenBankNo:AAC08713(SEQIDNO:256)，U67612(SEQIDNO:255);CAB59633(SEQIDNO:258),AJ246005(SEQIDNO:257))，天藍色鏈黴菌(GenBankNo:CAB70645(SEQIDNO:260)，AL939123(SEQIDNO:269);CAB92663(SEQIDNO:262);AL93912KSEQIDNO:261));和除蟲鏈黴菌(GenBankNo:NP—824008(SEQIDNO:264)，NC—003155(SEQIDNO:263);NP—824637(SEQIDNO:266),NC—003155(SEQIDNO:265))。術語"兼性厭氧菌，，指的是在好氧和厭氧環境中都可以生長的微生物。術語"碳底物"或"可發酵碳底物"指的是能夠被本發明的宿主微生物代謝的碳源，並且是選自單糖，寡糖，多糖和單碳底物或其混合物的碳源。術語"基因"指的是能夠表達為特定蛋白質的核酸片段，任選包括編碼序列之前(5，非-編碼序列)和之後(3，非-編碼序列)的調控序列。"天然基因"指的是與其自身調控序列在自然狀態發現的基因。"嵌合基因"指的是不是天然基因的任何基因，包括不是在自然狀態一起發現的調控序列和編碼序列。因此，嵌合基因可以包括來自不同來源的調控序列和編碼序列，或調控序列和編碼序列源自相同的來源，但以不同於自然狀態發現的方式排列。"內源基因"指的是處於其在生物體基因組中的天然位置的天然基因。"外源基因"或"異源基因"指的是通常不是在宿主生物體中發現的而是通過基因轉移引入宿主生物體中的基因。外源基因可以包括插入非天然生物體中的天然基因，或嵌合基因。"轉基因"是已經通過轉化程序引入基因組中的基因。如在此所用的，術語"編碼序列"指的是編碼特定胺基酸序列的DNA序列。"合適的調控序列"指的是位於編碼序列上遊(5'非-編碼序列)，之內或下遊(3'非-編碼序列)的核苷酸序列，並且其影響相連編碼序列的轉錄，RNA加工或穩定性，或翻譯。調控序列可以包括啟動於，翻譯前導序列，內含於，多腺苷酸化識別序列，RNA加工位點，效應子結合位點和莖-環結構。術語"啟動子"指的是能夠控制編碼序列或功能性RNA表達的DNA序列。通常，編碼序列位於啟動子序列的3，端。啟動子可以完全源自天然基因，或由源自自然狀態發現的不同啟動子的不同序列構成，或甚至包括合成的DNA片段。本領域技術人員應當理解不同的啟動子可以指導不同組織或細胞類型中的，或在不同的發育階段的，或應答不同的環境或生物條件的基因表達。使基因在大部分時間在大部分細胞類型中得到表達的啟動子通常稱為"組成型啟動子"。進一步認識到因為在大部分情況中，調控序列的確切分界線還沒有得到完全限定，因此不同長度的DNA片段可能具有相同的啟動子活性。術語"可操縱地連接"指的是單個核酸片段上的核酸序列連接，使得一個的功能受到另一個的影響。例如，在其能夠影響編碼序列的表達時，啟動子可操縱地連接編碼序列(即，編碼序列處於啟動子的轉錄控制下)。可以將編碼序列以正義或反義方向可操縱地連接調控序列。如在此所用的術語"表達"指的是源自本發明核酸片段的正義(mRNA)或反義RNA的轉錄和穩定累積。表達還可以指mRNA翻譯成多肽。如在此所用的術語"轉化"指的是核酸片段轉移至宿主生物體中，導致遺傳上穩定的遺傳。將含有轉化的核酸片段的宿主生物體稱為"轉基因"或"重組"或"轉化的"生物體。術語"質粒"，"栽體"和"盒"指的是額外的染色體序列，其通常攜帶不是細胞重要代謝的一部分的基因，且通常是環狀雙鏈DNA片段的形式。這樣的序列可以是源自任何來源的單鏈或雙鏈DNA或RNA的自主複製序列，基因組整合序列，噬菌體或核苷酸序列，線性或環狀的，其中各種核苷酸序列已經連接或重組成獨特的構建體，其能夠序列引入細胞^。、"轉化盒"指的是含有外源基因並具有除了促進特定宿主細胞轉化的外源基因以外的序列的特定載體。"表達盒，，指的是含有外源基因並具有除了允許該基因在外源宿主中提高的表達的外源基因以外的序列的特定栽體。如在此所用的術語"密碼子簡併性"指的是遺傳密碼中允許核苷酸序列改變而沒有影響所編碼多肽的胺基酸序列的性質。本領域技術人員公知核苦酸密碼子使用中由特定宿主細胞呈現的"密碼子偏好"確定了給定的胺基酸。因此，合成用於在宿主細胞中提高表達的基因時，理想的是設計基因使得密碼子使用的頻率接近宿主細胞的優選密碼子使用的頻率。術語"密碼子最佳化"，當涉及用於各種宿主轉化的基因和核酸分子的編碼片段時，指的是基因或核酸分子編碼片段中的密碼子改變，的多肽。在此使用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域公知的，並描述於Sambrook，J.，Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,她/ecw/orC7ow/wg..」La6orafo^Ma"wa/(分子克隆實驗室手冊)，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY(1989)(眾匕後^^為"Maniatis");和SUhavy，T.丄，Bennan，M.L.和Enquist，L.M.，￡lx/7er//wew"w"/zGeweFt/wows(4吏用基因融合的表達),ColdSpringHarborLaboratoryPress.ColdSpringHarbor,NY(1984);和Ausubel,F.M.等，CwAreW屍r^oco/jz"Mo/ecw/w(分子生物學中的通用實驗方案),GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience出版(1987)。異丁醇生物合成途徑利用碳水化合物的微生物使用Embden-Meyerhof-Parnas(EMP)途徑，Entner-Doudoroff途徑和戊糖磷酸酯循環作為主要的代謝途徑來提供用於生長和維持的能量和細胞前體。這些途徑具有共同的中間產物甘油醛-3-磷酸，並且最終直接或結合EMP途徑形成丙酮酸。隨後，丙酮酸通過各種方式轉化成乙醯-輔酶A(乙醯-CoA)。乙醯-CoA用作關鍵的中間產物，例如，在產生脂肪酸，胺基酸和次級代謝產物中。糖轉化成丙酮酸的組合反應產生了能量(例如，腺苷-5，-三磷酸，ATP)和還原等價物(例如，還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸，NADH，和還原型煙醯胺腺噪呤二核苷酸磷酸酯，NADPH)。NADH和NADPH必須再循環成其氧化形式(各自為NAD+和NAPD+)。在無機電子受體(例如，02，N03—和SO-)的存在下，還原等價物可以用來擴大能量池；或者，可以形成還原碳副產物。本發明能夠通過提供四個完整的反應途徑使用重組微生物從碳水化合物來源產生異丁醇，如圖1中所示的。其中三個途徑包括丙酮酸通過一系列的酶步驟轉化成異丁醇。優選的異丁醇步驟(圖l,步驟a至e)，包括以下的底物至產物的轉化a)丙酮酸至乙醯乳酸，例如由乙醯乳酸合酶催化的，b)乙醯乳酸至2,3-二羥基異戊酸，例如由乙醯醇酸異構還原酶催化的，c)2，3-二羥基異戊酸至a-酮基異戊酸，例如由乙醯醇酸脫水酶催化的，d)a-酮基異戊酸至異丁醛，例如由支鏈鯛酸脫羧酶催化的，e)異丁眵至異丁醇，例如由支鏈醇脫氬酶催化的。該途徑結合了已知在公認的纈氨酸生物合成(丙酮酸至a-酮基異戊酸)和纈氨酸分解代謝(a-酮基異戊酸至異丁醇)途徑中涉及的酶。因為許多纈氨酸生物合成酶還在異亮氨酸生物合成途徑中催化類似的反應，因此底物特異性在選擇基因來源中是一個主要的考慮因素。為此，對於乙醯乳酸合酶的主要目標基因是來自芽孢桿菌(a/aS)和克雷伯氏菌(6wdfi)的那些。已知這些特定的乙醯乳酸合酶參與這些生物體中的丁二醇發酵，並顯示出對丙酮酸的親和性高於酮丁酸(Gollop等，J.Bacteriol.172(6):3444-3449(1990);Holtzclaw等，Sa"e"o/.121(3):917-922(1975))。第二個和笫三個途徑步驟各自是由乙醯醇酸還原異構酶和脫水酶催化的。已經從各種來源表徵了這些酶，如例如，大腸桿菌(Chunduru等，脅cAem/考28(2):486-493(1989);Flint等，S/o/.CAe附.268(29):14732-14742(1993))。已知優選的異丁醇途徑的最後兩個步驟在酵母中發生，酵母可以使用纈氨酸作為氮源，並且在過程中分泌異丁醇。a-酮基異戊酸可以通過各種酮酸脫羧酶轉化成異丁醛，如例如丙酮酸脫羧酶。為了防止丙酮酸遠離異丁醇產生的方向錯誤，對丙酮酸的親和性降低的脫羧酶是理想的。迄今為止，本領域中已知存在兩種這樣的酶(Smit等，々7//.五"v/w".M化ra6/o/.71(l):303-311(2005);delaPlaza等，A^cto6/o/.238(2):367-374(2004))。兩種酶都來自乳酸乳球菌的菌株並對酮異戊酸的偏好超過丙酮酸50-200倍。最後，在酵母中已經鑑定了多種眵還原酶，許多具有重疊的底物特異性。已知偏好支鏈底物勝於乙搭的那些包括但不限於，醇脫氬酶VI(ADH6)和Yprlp(Larroy等，S/oc/iewJ.361(Ptl):163-172(2002);Ford等，r慮19(12):1087-1096(2002)),兩者都使用了NADPH作為電子供體。最近已經在大腸桿菌中鑑定了用支鏈底物激活的NADPH-依賴性還原酶，YqhD(Sulzenbacher等，《/.Mo/.嵐342(2):489-502(2004))。丙酮酸轉化成異丁醇的另一個途徑包括以下的底物至產物的轉化(圖1,步驟a，b,c,f,g,e):a)丙酮酸至乙醯乳酸，例如由乙醯乳酸合酶催化的，b)乙醯乳酸至2,3-二羥基異戊酸，例如由乙醯醇酸異構還原酶催化的，c)2,3-二羥基異戊酸至a-酮基異戊酸，例如由乙醯醇酸脫水酶催化的，f)a-酮基異戊酸至異丁醯-CoA，例如由支鏈酮酸脫氫酶催化的，g)異丁醯-CoA至異丁醛，例如由醯化醛脫氬酶催化的，e)異丁醛至異丁醇，例如由支鏈醇脫氫酶催化的。該途徑中的頭三個步驟(a，b，c)和上述的那些相同。通過支鏈酮酸脫氪酶的作用將a-酮基異戊酸轉化成異丁醯-CoA。雖然酵母只使用纈氨酸作為氮源，但許多其他生物體(真核生物和原核生物)可以也可以使用纈氨酸作為碳源。這些生物體具有支鏈酮酸脫氬酶(Sokatch等，./.Sa"en'o/.148(2):647-652(1981))，其產生異丁醯-CoA。異丁醯-CoA通過醯化醛脫氫酶可以轉化成異丁眵。已經描迷了明串珠菌(丄ewco麵foc)和丙酸桿菌(屍，'o"/Z^"mw7w)中用支鏈底物激活的脫氫酶，但還沒有克隆(Kazahaya等，v4///.M,'cro6/。/.18:43-55(1972);Hosol等,Fe匿wf.7fec/2"o/.57:418-427(1979))。然而，還可能的是已知作用於直鏈醯基-CoA(即，丁醯-CoA)的醯化醛脫氫酶也作用於異丁醯-CoA。然後異丁搭通過支鏈醇脫氫酶轉化成異丁醇，如以上對於第一個途徑中所迷的。丙酮酸轉化成異丁醇的另一個途徑包括以下的底物至產物的轉化(圖1，步驟a,b,c,h,i，j,e):a)丙酮酸至乙醯乳酸，例如由乙醯乳酸合酶催化的，b)乙醯乳酸至2，3-二幾基異戊酸，例如由乙醯醉酸異構還原酶催化的，c)2,3-二羥基異戊酸至a-酮基異戊酸，例如由乙醯醇酸脫水酶催化的，h)a-酮基異戊酸至纈氨酸，例如由纈氨酸脫氬酶或轉氨酶催化的，i)纈氨酸至異丁胺，例如由纈氨酸脫羧酶催化的，j)異丁胺至異丁眵，例如由co轉氨酶催化的，和e)異丁醛至異丁醇，例如由支鏈醇脫氬酶催化的。該途徑中的頭三個步驟(a,b,c)和上述的那些相同。該途徑需要加入纈氨酸脫氫酶或合適的轉氨酶。纈氨酸(和或亮氨酸)脫氬酶催化還原性胺化並使用氨；氨的Km值在毫摩爾範圍中(Priestly等，Aoc/zew261(3):853-861(1989);Vancura等，Ge".Mtcra^o/.134(12):3213-3219(1988)，Zink等，Ac/z.^oc/ie肌S/o;/^.99:72-77(1962);Sekimoto等，說oc/zew(日本)116(1):176-182(1994))。轉氨酶通常使用穀氨酸或丙氨酸作為氨基供體，並已經從各種生物體得到了表徵(Lee-Peng等,丄脇m'o/.139(2):399-345(1979);Berg等，丄&"mo/.155(3):1009-1014(1983))。丙氨酸-特異性酶是理想的，因為除去胺基時，該步驟的丙酮酸產生可以結合途徑中後來的丙酮酸消耗(參見以下的)。下一個步驟是纈氨酸的脫羧作用，這是在鏈黴菌中的valanimycin生物合成中發生的反應(Gang等，A/o/.M/cra&o/.46(2):505-517(2002))。所得到的異丁胺可以在吡,醛5，-磷酸-依賴性反應中轉化成異丁搭，例如通過(0-轉氨酶家族的酶。已經證明來自河流弧菌(r,力n'o//wWa/^)這樣的酶具有異丁胺活性(Shm等，j5/ofec/mo/.Aowg.65(2):206-211(1999))。已經克隆了另一種來自反硝化產鹼菌的co-轉氨酶並且具有一定的丁胺活性(Yun等M//7/.￡"v/ra".A//cra6/o/.70(4):2529-2534(2004))。在這種方向中，這些酶使用丙酮酸作為氨基受體，產生丙氨酸。如上所迷，在途徑的早期使用產生丙酮酸的轉氨酶可以抵消對丙酮酸池的不利影響。然後異丁醛通過支鏈醇脫氬酶轉化成異丁醇，如以上對於第一個途徑所述的。第四個異丁醇生物合成途徑包括圖1中步驟k,g,e所示的底物至產物的轉化。已知各種生物體通過丁醯-CoA中間產物產生丁酸和/或丁醇(Diirre等，F￡MSMcra&o/.Aev.17(3)251-262(1995);Abbad-Andaloussi等,緣油o/ogy142(5):1149-1158(1996))。通過加入能夠轉化丁醯-CoA至異丁醯-CoA的突變酶在這些生物體中工程化異丁醇產生(圖l,步驟k)。已經從鏈黴菌克隆了異丁醯-CoA突變酶(輔酶Bu-依賴性酶)的兩個亞基的基因(Ratnatilleke等，丄Ao/.C/^/w.274(44):31679-31685(1999))。異丁醯-CoA轉化成異丁醛(圖l中的步驟g)，其轉化成異丁醇(圖1中的步驟e)。因此，在提供丙酮酸至異丁醇的多個重組途徑中，存在各種選擇來滿足單個轉化步驟，並且本領域技術人員將能夠利用公眾可獲得的序列來構建相關的途徑。以下的表2中列出了本領域已知的且異丁醇生物合成途徑的構建中有用的代表性基因的列表。表2異丁酵生物合成途徑基因的來源基因GenBank引用乙醯乳酸合蘇tableseeoriginaldocumentpage28tableseeoriginaldocumentpage29tableseeoriginaldocumentpage30tableseeoriginaldocumentpage31用於異丁醇生產的微生物宿主用於異丁醇生產的微生物宿主可以選自細菌，藍細菌，絲狀真菌和酵母。用於異丁醇生產的微生物宿主優選耐異丁醇，使得產量不受到丁醇毒性的限制。在高異丁醇滴定水平具有代謝活性的微生物不是本領域公知的。儘管已經從產溶劑(solventogenic)梭菌分離了耐丁醇的突變體，但是關於其他潛在有用菌株的丁醇耐受性的信息獲得得很少。對於細菌醇耐受性比較的大部分研究表明丁醇比乙醇更毒(deCavalho等，M/cmsc.^s.7fec/.64:215-22(2004)和Kabelitz等，/^MS"M/cto6/o/.厶e〃.220:223-227(2003))。Tomas等(丄Sacfeno/.186:2006-2018(2004))報導了丙醇丁酮梭菌發酵過程中的1-丁醇產量受到了l-丁醇毒性的限制。l-丁醇對丙醇丁酮梭菌的主要影響是膜功能的破壞(Hermann等，五"W應.M/'c油o/.50:1238-1243(1985))。選擇用於異丁醇生產的微生物宿主優選耐異丁醇，並應當能夠將碳水化合物轉化成異丁醇。選擇合適微生物宿主的標準包括以下的內在的異丁醇耐受性，高葡萄糖利用率，用於基因操縱的遺傳工具的可用性和產生穩定的染色體改變的能力。可以通過基於菌林內在耐受性的篩選來鑑定具有異丁醇耐受性的合適宿主菌株。可以通過測定在最小培養基中生長時引起50%生長速率抑制UC50)的異丁醇濃度來測量微生物對異丁醇的內在耐受性。可以使用本領域已知的方法來測定IC50值。例如，可以將目標微生物在各種含量的異丁醇存在下生長並通過測量600納米處的光密度來監控生長速率。從生長曲線的對數部分計算倍增時間並用作生長速率的測量。可以從生長的百分比抑制對異丁醇濃度的圖中測定出產生50%生長抑制的異丁醇濃度。優選，宿主菌抹對於異丁醇應當具有高於約0.5%的IC50。用於異丁醇生產的微生物宿主還應當以高速率來利用葡萄糖。大部分微生物能夠利用碳水化合物。然而，特定的環境微生物不能高效地利用碳水化合物，並因此不是合適的宿主。在遺傳上修飾宿主的能力對於任何重組微生物的產生是必須的。基因轉移技術的方式可以通過電穿孔，綴合，轉導或天然轉化。各種宿主可綴合質粒和抗藥性標記是可獲得的。基於在該宿主中抗生素抗性標記的性質，對宿主生物體定製克隆載體。微生物宿主還必須得到操縱，以便通過刪除各種基因使碳流的竟爭途徑失活。這需要利用指導失活的轉座子或染色體整合栽體。此外，生產宿主應當順從化學誘變，使得可以獲得提高內在異丁醇耐受性的突變。基於上述的標準，用於異丁醇生產的合適微生物宿主包括，但不限於，梭菌屬，發酵單胞菌屬(Zywomomw)，埃希氏菌屬(^yc/jeWc/n'a),沙門氏菌屬，紅球菌屬(尺/iodococa^)，假單胞菌屬，芽孢桿菌屬，乳#幹菌屬(Z/a"o6ac〃/^s)，腸J求菌屬(￡>^erococcz^)，產石成桿菌屬(爿/ca/zge"es),克雷伯氏菌屬，類芽孢桿菌屬(屍aemAac〃/w)，節桿菌屬(勿/ro6a"er),棒狀桿菌屬(Cor"e6a"www),短桿菌屬(5訓力a"mww)，畢赤氏酵母屬(屍/c/j/a)，假絲酵母屬(CW/afa)，漢森酵母屬(//awseww/a)和酵母屬(Sacc/iaromycej)的成員。優選的宿主包括大腸桿菌(EscAe〃'c/n'aco/O,真養產鹼桿菌(爿/ca/z'gew^ew/rop/iuy),地衣芽孢桿菌，浸麻類芽孢桿菌(屍aemAac〃/uswmcenms)，紅串紅球菌(//moTococcz^er聲/^o/o/^)，惡臭々i單胞菌，才直物乳桿菌(Z^"o6ac/〃w//fl"^rw/n)，屎腸球菌(^^eracocc附/aec/ww)，鵓雞腸球菌(五w"rococcwsga〃/"an'ww),糞腸球菌(^V^erococcwjy^eca/z'j)，枯草芽孢桿菌和釀酒酵母。生產宿主的構建可以使用本領域公知的技術來構建含有必需基因的重組生物體，該基因編碼可發酵碳底物轉化成異丁醇的酶途徑。在本發明中，可以從各種來源分離編碼本發明異丁醇生物合成途徑之一的酶，例如，乙醯乳酸合酶，乙醯醇酸異構還原酶，乙醯醇酸脫水酶，支鏈a-酮酸脫羧酶，如上所迷。從細菌基因組獲得所需基因的方法是分子生物學領域中常見的和公知的。例如，如果基因的序列是已知的，可以通過限制性核酸內切酶分泌合適的基因組文庫，並可以使用與所需基因序列互補的探針來篩選。一旦序列得到分離，使用標準引物定向擴增方法如聚合酶鏈式反應(U.S.4，683，202)擴增DNA來獲得適於使用合適載體轉化的適量DNA。用於在異源宿主中表達的密碼子最佳化的工具是容易獲得的。基於宿主生物體的GC含量可以使用一些用於密碼子最佳化的工具。表3中給出了一些實例微生物宿主的GC含量。41微生物宿主的GC含量菌抹%GC地衣芽孢桿菌46枯草芽孢桿菌42丙醇丁酮梭菌37大腸桿菌50惡臭假單胞菌61真養產鹼桿菌61浸麻類芽孢桿菌51紅串紅球菌62短桿菌50多粘類芽孢桿菌(屍aem力acz'〃ws50/o/，y;ca)一旦鑑定並分離出相關的途徑基因，可以通過本領域公知的方式將它們轉化值合適的表達栽體中。用於轉化各種宿主細胞的載體或盒是常見的並從如下的公司可購得，EPICENTRE(Madison，WI)，InvitrogenCorp.(Carlsbad,CA),Stratagene(LaJolla,CA)和NewEnglandBiolabs,Inc.(Beverly,MA)。通常，栽體和盒含有指導相關基因的盒翻譯的序列，選擇標記和允許自主複製或染色體整合的序列。合適的栽體包括帶有轉錄啟動控制的基因5，端和控制轉錄終止的DNA片段的3，端。兩個控制片段可以源自與轉化的宿主細胞同源的基因，種的天然基因。用於驅動所需宿主細胞中相關途徑編碼片段的表達的啟動控制片段或啟動子是為數眾多的並是本領域技術人員熟知的。實際上，能夠驅動這些遺傳序列的任何啟動子都適用於本發明，包括但不限於，CTC7，///S3，(L4ZJ0，屍G《，屍//05，04屍D仏」ZX:/,77P/，^7/^3,ZJn￡M9，7TV,Ct/屍/,G屍D和G屍A/(用於在酵母中的表達)；」OA7(用於在畢赤氏酵母中的表達)；和/ac,ara，&/，&/7，/屍￡，/屍/，77，Mc和加(用於大腸桿菌，產鹼桿菌和假單胞菌中的表達)；am》a/r,"嚴啟動子和各種噬菌體啟動子，用於枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌和浸麻類芽孢桿菌中的表達；WW(用於革蘭氏陽性細菌中的表達，Eichenbaum等，^//.五"viro".M/cro6/o/.64(8):2763-2769(1998));和合成的Pll啟動子(用於植物乳桿菌中的表達，Rud等，M/cro&o/ogy152:1011-1019(2006))。終止控制片段也可以源自優選宿主的各種天然基因。任選地，終止位點不是必需的，然而，如果包括，是最優選的。特定的載體能夠在大範圍的宿主細菌中複製並可以通過綴合來轉移。pRK4的完整和注釋序列以及三個相關的栽體-pRK437,pRK442和pRK442(H)是可獲得的。已經證明這些衍生物對於革蘭氏陰性細菌中的遺傳操縱是有價值的工具(Scott等，屍/ww^50(l):74-79(2003))。寬宿主範圍的IncP4質粒RSF1010的幾個質粒衍生物也是可獲得的，具有可以在各種革蘭氏陰性細菌中起作用的啟動子。質粒pAYC36和pAYC37,具有活性啟動子和多個克隆位點，以允許異源基因在革蘭氏陰性細菌中的表達。還廣泛使用了染色體基因替代工具。例如，已經修改寬宿主範圍複製子pWV101的熱敏感性變體來構建質粒pVE6002,其可以用於在各種革蘭氏陽性細菌中實現基因替代(Maguin等，丄Sac/en'o/.174(17):5633-5638(1992))。此外，可利用體外transposome來形成來自商業來源如EPICENTRE⑧的各種基因組中的隨機突變。以下更詳細地描述了各種優選微生物宿主中異丁醇生物合成途徑的表達。大腸桿菌中異丁醇生物合成途徑的表達用於大腸桿菌轉化的栽體或盒是常見的並從以上所列的公司可購得。例如，可以從各種來源分離異丁醇生物合成途徑的基因，克隆至修飾的pUC9栽體中並轉化至大腸桿菌NM522中，如實施例6和7中所迷的。紅串紅球菌中異丁醇生物合成途徑的表達可以將一系列大腸桿菌-紅球菌穿梭栽體用於紅串紅球菌中的表達，包括但不限於，pRhBR17和pDA71(Kostichka等，J///.M!cra6/o/.5zo^c/i"o/.62:61-68(2003))。此外，可以將一系列啟動子用於紅串紅球菌中的異源基因表達(參見例如Nakashima等，々y/.￡"v,>ow.M,cro&o/.70:5557-5568(2004)，和Tao等，M/oo^o/.B/o^c/wo/.2005，DOI10.1007/s00253-005-0064)。可以使用Tao等，上文和Brans等E"v,腦.Mcro6/o/.66:2029-2036(2000))所述的方法形成紅串紅球菌中染色體基因的靶向基因破壞。如上所述，最初可以在pDA71或pRhBR71中克隆異丁醇生產需要的異源基因並轉化至大腸桿菌中。然後通過電穿孔將栽體轉化至紅串紅球菌中，如Kostichka等所迷的。可以將重組體生長於含有葡萄糖的培養基中並使用本領域已知的方法進行異丁醇的生產。枯草芽孢桿菌中異丁醇生物合成途徑的表達用於枯草芽孢桿菌中的基因表達和突變形成的方法也是本領域公知的。例如，可以從各種來源分離異丁醇生物合成途徑的基因，克隆至修飾的pUC19栽體中並轉化至枯草芽孢桿菌BE1010中，如實施例8中所述的。此外，可以將異丁醇生物合成途徑的五個基因分成兩個用於表達的操縱子，如實施例20中所述的。將途徑的三個基因(6w6仏//vD和hvD)整合至枯草芽孢桿菌BE1010的染色體中(Payne和Jackson,J.Bacteriol.173:2278-2282(1991))。將剩餘的兩個基因('7vZ)和6Wfi)克隆至表達栽體中並轉化至帶有整合的異丁醇基因的芽孢桿菌菌林中。地衣芽孢桿菌中異丁酵生物合成途徑的表達在枯草芽孢桿菌中複製的大部分質粒和穿梭栽體可以用於轉化地衣芽孢桿菌，通過原生質體轉化或電穿孔。在質粒pBE20或pBE60衍生物中克隆異丁醇生產需要的基因(Nagarajan等，Ge"e114:121-126(1992))。轉化地衣芽孢桿菌的方法是本領域已知的(例如，參見，Fleming等，^;/.￡"v/ro".A^cro6'o/.61(11):3775-3780(1995))。可以將為了在枯草芽孢桿菌中表達而構建的質粒轉化至地衣芽孢桿菌中來產生生產異丁醇的重組微生物宿主。浸麻類芽孢桿菌中異丁酵生物合成途徑的表達可以如以上對枯草芽孢桿菌中的表達所迷的來構建質粒並用於轉化浸麻類芽孢桿菌，通過原生質體轉化，以產生生產異丁醇的重組微生物宿主。真養產鹼桿菌(雷氏菌)中異丁酵生物合成途徑的表達用於真養產鹼桿菌中的基因表達和突變形成的方法是本領域已知的(參見，例如，Taghavi等，柳/.腸/匿緣油o/.，60(10):3585-3591(1994))。可以在上迷的任一種寬宿主範圍栽體中克隆用於異丁醇生物合成途徑的基因，並電穿孔來產生生產異丁醇的重組體。已經詳細描述了產鹼桿菌中的多(羥基丁酸)途徑，各種修飾真養產鹼桿菌的遺傳技術是已知的，並且那些工具可以應用於工程化異丁醇生物合成途徑。惡臭假單胞菌中異丁醇生物合成途徑的表達用於惡臭假單胞菌中的基因表達的方法是本領域已知的(參見，例如，Ben-Bassat等,U.S.專利No.6，586，229，在此將其引入作為參考)。可以將丁醇途徑基因插入pPUC18中並將該連接的DNA電穿孔至電感受態惡臭假單胞菌D0T-T1C5aARl細胞中來產生生產異丁醇的重組體。釀酒酵母中異丁酵生物合成途徑的表達用於釀酒酵母中的基因表達的方法是本領於已知的(參見，例如，她^2oc^￡>iz>7wo/ogy(酶學方法)，194巻,GwzdefoMo/ecw/arCe〃S/o/ogy(酵母遺傳學以及分子和細胞生物學指南)(A部分,2004,ChristineGuthrieandGeraldR.Fink(編輯)，ElsevierAcademicPress,SanDiego,CA)。酵母中基因的表達通常需要啟動子，接著為目標基因，以及轉錄終止子。在構建用於編碼異丁醇生物合成途徑的基因的表達盒中可以使用各種酵母啟動子，包括但不限於組成型啟動子FBA,GPD,ADH1和GPM，和誘導型啟動子GALl,GAL10和CUP1。合適的轉錄終止子包括但不限於FBAt,GPDt,GMPt,ERG10t,GALlt，CYC1和ADH1。例如，可以將異丁醇生物合成途徑的合適啟動子，轉錄終止子和基因克隆至大腸桿菌-酵母穿梭栽體中，如實施例17中所述的。植物乳桿菌中異丁醇生物合成途徑的表達乳桿菌屬屬於乳桿菌目(Lacfo6ac/〃a/es)家族並且在枯草芽孢桿菌和鏈球菌的轉化中所用的許多質粒和栽體可以用於乳桿菌。合適載體的非限制性實例包括pAM"l及其衍生物(Renault等，183:175-182(1996);和O，Sullivan等，G纏137:227-231(1993));pMBBl和pHW800,pMBBl的衍生物(Wyckoff等，智/.腸/隱緣油o/.62:1481-1486(1996));pMGl,一種可綴合質粒(Tanimoto等，/i5a"m'o/.184:5800-5804(2002));pNZ9520(Kleerebezem等，^p//.A/zcro6/o/.63:4581-4584(1997));pAM401(Fujimoto等，^//.￡"v/ro".Mc油W.67:1262-1267(2001));和pAT392(Arthur等，J"〃w/cro6,CAewoAe廣38:1899-1903(1994))。已經報導了幾個來自植物乳桿菌的質粒(例如，vanKranenburgR，GolkN,BongersR，LeerRJ，deVbsWM,SiezenRJ，KJeerebezemM，J///.￡""v/row.iW/croWo/.2005年3月；71(3):1223-1230)。例如，實施例21中描迷了植物乳桿菌中異丁醇生物合成途徑的表達。屎腸球菌，鵓雞腸球菌和糞腸球菌中異丁酵生物合成途徑的表達腸球菌屬屬於乳桿菌目家族並且在乳桿菌，枯草芽孢桿菌和鏈球菌的轉化中所用的許多質粒和栽體可以用於腸球菌。合適載體的非限制性實例包括pAM々1及其衍生物(Renault等，Ge"e183:175-182(1996);和O，Sullivan等,137:227-231(1993));pMBBl和pHW800，pMBBl的衍生物(Wyckoff等，J///.￡>m>o".AZ/cro6/o/.62:1481-1486(1996));pMGl，一種可綴合質粒(Tanimoto等，丄S論r/o厶184:5800-5804(2002));pNZ9520(Kleerebezem等，J///.M/cra&o/.63:4581-4584(1997));pAM401(Fujimoto等，/^//.E"v&o".Mcro&o/.67:1262-1267(2001));和pAT392(Arthur等，顛/m/⑧6.爿ge""C/e/m^er38:1899-1903(1994))。使用來自乳球菌的m"基因的用於糞腸球菌的表達栽體也可使用(Eichenbaum等，y4///.￡"v/row.M/cro6/o/.64:2763-2769(1998)。此外，可以4吏用用於屎腸球菌染色體中基因替代的栽體(Nallaapareddy等，^p/.五"v/ra".A^cra6/o/.72:334-345(2006))。例如，實施例22中描述了糞腸球菌中的異丁醇生物合成途徑的表達。發酵培養基本發明中的發酵培養基必須含有合適的碳底物。合適的物質包括，但不限於，單糖，如葡萄糖和果糖，寡糖，如乳糖或蔗糖，多糖，如澱粉或纖維素或其混合物，以及來自可再生原料的未純化混合物，如千酪乳清滲透物，玉米漿，甜菜糖蜜和麥芽。此外，碳底物還可以是單碳底物，如二氧化碳，或甲醇，對此已經證明了代謝轉化成關鍵的生化中間產物。除了單碳和二碳底物，還知道甲醇(methylotrophic)生物體利用各種其他含碳化合物，如甲胺，葡糖胺和各種胺基酸，用於代謝活性。例如，已知甲醇酵母利用來自甲胺的碳來形成海藻糖或甘油(Bellion等,Mc威G層AC/Co—.，[IntSymp]，7th(1993),415-32,編輯Murrell,J.Collin;Kelly,DonP.，出版商Intercept,Andover，UK)。相似地，假絲酵母的各種物種將代謝丙氨酸或油酸(Sulter等，Ac/j.Mc油W.153:485-489(1990))。因此，考慮了本發明中所用的碳源可以包括各種含碳底物並且只受生物體選擇的限制。但優選的碳底物是葡萄糖，果糖和蔗糖。除了合適的碳源，發酵培養基必須含有合適的礦物質，鹽，輔因子，緩沖劑和其他成分，這些是本領域技術人員已知的，適於培養物的生長和促進異丁醇生產需要的酶途徑。培養條件通常，細胞生長於合適培養基中約25'C至約40。C範圍的溫度。本發明中的合適生長培養基是通常的商業製備培養基，如LuriaBertani(LB)培養液，SabouraudDextrose(SD)培養液或酵母培養基(YM)培養液。還可以使用其他限定的或合成的生長培養基，並且用於特定微生物生長的合適培養基將是微生物學或發酵科學領域中技術人員已知的。還可以將已知直接或間接調節代謝產物抑制的試劑，例如，環腺苷2，:3，-單磷酸，摻入發酵培養基中。用於發酵的合適pH範圍為pH5.0至pH9.0,其中優選pH6.0至pH8.0作為起始條件。可以在好氣或厭氧條件下進行發酵，其中優選厭氧或微好氧條件。可以使用本領域已知的各種方法來測定發酵培養基中產生的異丁醇含量，例如，高性能液相色謙(hplc)或氣相色謙(gc)。工業分批發酵和連續發酵本發明使用分批發酵方法。傳統的分批發酵是封閉的系統，其中在發酵開始時設定培養基的組成並且在發酵過程中沒有接受人工改變。因此，在發酵開始時，用所需的微生物接種培養基，並且允許發酵發生而沒有給系統添加任何東西。通常，然而，"分批，，發酵對於碳源的添加是分批的，並且通常努力控制一些因素如pH和氧濃度。在分批系統中，系統的代謝產物和生物量組成恆定地改變直至停止發酵的時間。在分批培養內，細胞從靜態的停滯階段調節至高生長對數期，最後到達靜止期，其中生長速率減小或停止。如果未處理，靜止期中的細胞最終將死亡。對數期的細胞通常負責終產物或中間產物的大量產生。對標準分批系統的改進是給料-分批系統。給料-分批發酵方法也適用於本發明並包括典型的分批系統，除了隨著發酵進展增量添加底物。當代謝產物抑制傾向於抑制細胞代謝並且希望在培養基中含有有限量的底物時，給料-分批系統是有用的。給料-分批系統中實際底物濃度的測量是困難的，並因此基於測量因素的改變來估算，這些測量因素如pH,溶解氧和廢氣如C02的分壓。分批和給料-分批發酵是本領域常見的和y^知的，並且可以在以下找到實例ThomasD.Brock，在S/ofec/mo/ogy,'jre;cf6ooA。/7"(iwWo/A//cro6/.o/ogy(生物技術工業微生物學的教科書)，第二版(1989)SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA,，或Deshpande，MukundV.,i5/o&c/wo/.,36:227，(1992),在此引入作為參考。儘管以分批模式進行本發明，但考慮了該方法也將適於連續發酵方法。連續發酵是開放的系統，其中將限定的發酵培養基連續加入生物反應器中，並且同時取出等量的調節過的培養基用於處理。連續發酵通常將培養物維持於恆定的高密度，其中細胞主要處於對數期生長。連續發酵允許調節影響細胞生長或終產物濃度的一種因素或任何數量的因素。例如，一種方法以固定的速率維持限制的營養素如碳源或氮水平，並允許所有其他參數來調節。在其他系統中，可以連續改變影響生長的多種因素，而通過培養基濁度測量的細胞濃度保持恆定。連續系統為維持穩態生長條件而努力，因此由於抽取培養基引起的細胞損耗必須相對於發酵中的細胞生長率而平衡。調節連續發酵過程的營養素和生長因子的方法以及用於最大化產品發酵速率的技術是工業微生物領域中公知的，並且Brock,上文中詳細描述了各種方法。考慮了可以使用分批，給料-分批或連續過程來實踐本發明，並且任何已知的發酵模式將是合適的。此外，考慮了可以將細胞固定於作為完整細胞催化劑的物質上並接受用於異丁醇生產的發酵條件。從發酵培養基分離異丁醇的方法可以使用本領域已知的方法從發酵培養基分離生物產生的異丁醇。例如，可以通過離心，過濾，潷析等從發酵培養基去除固體。然後，可以從如上所述已經處理過除去固體的發酵培養基分離異丁醇，使用如蒸餾，液-液提取或基於膜的分離的方法。因為異丁醇與水形成低沸點的共沸混合物，蒸餾只可以將混合物分離成共沸組合物。可以結合另一種分離方法使用蒸餾來獲得繞過共沐組成分離。可以結合蒸餾使用來分離和純化異丁醇的方法包括，但不限於，潷析，液-液提取，吸附和基於膜的技術。此外，可以使用共沸蒸餾來分離異丁醇，使用夾帶劑(參見，例如，Doherty和Malone，Cowce/fwa/o/Z)/W〃/a"ow一ew，McGraw柳，NewYork,2001)。異丁醇-水混合物形成異質的共沸混合物，使得可以結合潷析使用蒸餾來分離和純化異丁醇。在該方法中，將含有異丁醇的發酵培養液蒸餾至接近共沸組成。然後，冷凝共沸混合物，並通過潷析從發酵培養基分離異丁醇。可以將潷析過的水相隨著回流返回至第一個蒸餾柱。可以通過在笫二個蒸餾柱中蒸餾來進一步純化富含異丁醇的潷析過的有機相。還可以使用液-液提取結合蒸餾從發酵培養基中分離異丁醇。在該方法中，使用合適的溶劑使用液-液提取從發酵培養液中提取異丁醇。然後蒸餾含有異丁醇的有機相以從溶劑分離異丁醇。還可以使用蒸餾結合吸附以從發酵培養液中分離異丁醇。在該方法中，將含有異丁醇的發酵培養液蒸餾至接近非沸組成，然後使用吸附劑如分子篩除去剩餘的水(Aden等，L/g"oce〃w/owc5/owa^fo涵awo/屍race^Dej/gwEcowowcsCo-CWrewfD//w&爿"c//Ve/zydroAy^awe/￡>72>7wa"c/(yfi^oAs/s/o/*ComSfoveer，ReportNREL/TP-510-32438，NationalRenwableEnergyLaboratory,2002年6月)。此外，可以使用蒸餾結合全蒸發過程從發酵培養基分離和純化異丁醇。在該方法中，將含有異丁醇的發酵培養液蒸餾至接近共沸組成，然後藉由通過親水性膜的全蒸發過程來除去剩餘的水(Guo等，丄她^er245，199-210(2004))。實施例在以下的實施例中進一步限定了本發明。應當理解這些實施例只是通過說明的方式給出，儘管表示了本發明的優選實施方案。從以上的討論和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發明的必要特徵，而沒有脫離其精神和範圍，可以進行本發明的各種改變和改進以使其適於各種用途和條件。總的方法實施例中所用的標準重組DNA和分子克隆技術上本領域公知的並描述於Sambrook,J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Mo/ecw/orC7om"g.'爿Z^6oraM^Ma"wa/(分子克隆實驗室手冊)；ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,NY(1989)(Maniatis)和T.J.Silhavy，M.L.Bennan,和L.W.Enquist，j&cpw'膨""v^'//iGeweF腦'o;w(使用基因融合的實驗)，ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,N.Y.(1984)和Ausubel,F.M.等，Owe/^/Woco/sMo/ecw/wAo/ogy(分子生物學中的通用實馬t方案)，由GreenePublishingAssoc.和Wiley-Interscience(1987)出版。適用於細菌培養物的維持和生長的材料和方法是本領域公知的。適用於以下實施例的技術可以在以下所列的找到，A/awwa/o/Me"oA/orGewera/5a"e〃'o/ogy(—般細菌學的方法手冊)(PhillippGerhardt，R.G.E.Murray,RalphN.Costilow,EugeneW.Nester，WillisA.Wood,NoelR.Krieg和G.BriggsPhillips編輯)，AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC.(1994))或ThomasD.Brock,在爿7kx/^ooA0//wdw5YnWM'cra6/o/ogy(生物技術工業微生物學的教科書),笫二版，SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA(1989)。用於細菌細胞生長和維持的所有試劑，限制酶和材料從AldrichChemicals(Milwaukee,WI)，BDDiagnosticSystems(Sparks,MD),LifeTechnologies(Rockville,MD),或SigmaChemicalCompany(St.Louis,MO)獲得，除非另外指出。從美國典型培養物中心(ATCC)，Manassas,VA獲得微生物菌抹，除非另外指出。表4中給出了以下實施例中使用的寡核苷酸引物。通過Sigma-Genosys(Woodlands,TX)合成所有寡核普酸引物。表4tableseeoriginaldocumentpage43tableseeoriginaldocumentpage44tableseeoriginaldocumentpage45tableseeoriginaldocumentpage46tableseeoriginaldocumentpage47tableseeoriginaldocumentpage48測定培養基中異T醇濃度的方法可以通過本領域已知的各種方法來測定培養基中的異丁醇濃度。例如，特異性高性能液相色謙(HPLC)方法使用了ShodexSH-1011柱和ShodexSH-G保護柱，兩者都購自WatersCorporation(Milford,MA),具有折射率(RI)檢測。使用0.01MH2S04作為移動相獲得色譜分離，使用0.5mL/分鐘的流速和50'C的柱溫。異丁醇在所用的條件下具有46.6分鐘的停留時間。或者，可以用氣相色講(GC)方法。例如，特定的GC方法使用HP-INNOWax柱(30mx0.53mm,同前，lpm膜厚，AgilentTechnologies,Wilmington,DE)，使用火焰電離檢測儀(FID)。栽氣是4.5mL/分鐘流速的氦，在150'C測量，使用恆定的排除壓力；注射器分裂是200'C1:25;烘箱溫度是45'C1分鐘，以10"C/分鐘45升至220°C,和220'C5分鐘；並在240'C使用FID檢測，使用26mL/分鐘氦補充氣體。異丁醇的停留時間是4.5分鐘。縮寫的意思如下"s"表示秒，"min"表示分鐘，"h，，表示小時，"psi"表示每平方英寸的磅數，"nm"表示納米，"d"表示天，'VL"表示微升，"mL"表示毫升，"L"表示升，"mm"表示微米，"nm"表示納米，"mM"表示毫摩爾，VM"表示微摩爾，"M"表示摩爾，"mmol"表示毫摩爾，"jimol"表示微摩爾，"g"表示克，、g，，表示微克和"ng"表示納克，"PCR"表示聚合酶鏈式反應，"OD"表示光密度，"OD6oo"表示在600nm波長測量的光密度，"kDa"表示千道爾頓，"g"表示重力常數，"bp"表示鹼基對，"kbp"表示千鹼基對，"%w/v，，表示重量/體積百分比，"％v/v"表示體積/體積百分比，"IPTG，，表示異丙基-P-D-硫代半乳糖吡喃糖苷，"RBS"表示核糖體結合位點，"HPLC"表示高性能液相色譜，和"GC，，表示氣相色講。術語"摩爾選擇性"是每摩爾消耗的糖底物產生的產物摩爾數，並記錄為百分比。實施例1乙醯乳酸合酶的克隆和表達該實施例的目的是從肺炎克雷伯氏菌克隆6t^^基因並在大腸桿菌BL21-AI中表達。使用PCR從肺炎克雷伯氏菌菌林ATCC25955基因組DNA擴增6w必基因，獲得1.8kbp產物。寸吏用GentraPuregene試劑盒(GentraSystems,Inc.,Minneapolis,MN;目錄編號D-5000A)製備基因組DNA。通過PCR從肺炎克雷伯氏菌基因組DNA擴增6w必基因，使用引物N80和N81(參見表2),各自如SEQIDNO:11和12給出。在製造商的試劑盒中提供了其他PCR擴增試劑，例如，FinnzymesPhusionHigh-FidelityPCRMasterMix(NewEnglandBiolabsInc.,Beverly,MA;目錄no.F-531)並才艮椐製造商的實驗方案來使用。在DNAThermocyclerGeneAmp9700(PEAppliedBiosystems，Fostercity，CA)中進行擴增。為了表達研究，使用Gateway克隆技術(InvitrogenCorp.，Carlsbad,CA)。入門栽體pENTRSDD-TOPO允許定向的克隆並提供了目標基因的Shine-Dalgarno序列。目標栽體pDEST14使用了T7啟動子，用於沒有標記物的基因的表達。正向引物就在轉錄起始密碼子鄰近引入四個鹼基(CACC),以允許定向克隆至pENTRSDD-TOPO(Invitrogen)中來產生質粒pENTRSDD-TOPObudB。根據製造商的推薦將pENTR構建體轉化至大腸桿菌ToplO(Invitrogen)細胞中並塗布。將轉化體生長過夜並根椐製造商的推薦使用QIAprepSpinMiniprep試刑盒(Qiagen，Valencia,CA;目錄no.27106)製備質粒DNA。將克隆測序來證實以正確方向插入了基因並證實序列。SEQIDNO:1和SEQIDNO:2各自給出了用於該基因的開放閱讀框(ORF)的核苷酸序列和預測的酶胺基酸序列。為了形成表達克隆，通過重組將Zn^S基因轉移至pDEST14栽體中來產生pDEST14budB。將pDEST14budB栽體轉化至大腸桿菌BL21-AI細胞中(Invitrogen)。將轉化體接種至補充50pg/mL氨千青黴素的LuriaBertani(LB)培養基中並生長過夜。並將等份的過夜培養物用來接種50mL補充50/^g/mL氨節青黴素的LB。將培養物在37'C振蕩培養直至OD6oo達到0.6-0.8。將培養物分成兩個25-mL培養物，並將阿拉伯糖加入一個燒瓶中至0.2%w/v的終濃度。陰性對照燒瓶沒有用阿拉伯糖來誘導。將燒瓶在37'C振蕩培養4h。通過離心收集細胞並將細胞沉澱物重懸浮於50mMMOPS中，pH7.0緩沖液。通過超聲波或通過FrenchPressureCell破壞細胞。將全細胞裂解產物離心，產生無細胞提取物的上清液或不溶性部分。將等份的每個部分(全細胞裂解產物，無細胞提取物和不溶性部分)重懸浮於SDS(MES)裝栽緩沖液中(Invitrogen),加熱至85。C10分鐘，並接受SDS-PAGE分析(NuPAGE4-12。/。Bis-Tris凝膠，目錄no.NP0322Box，Invitrogen)。在誘導的培養物中存在預期約60kDa分子量的蛋白質，如從核酸序列推導的，但在未誘導的對照中不存在。使用Bauerle等(Aoc編.腳—.勿a92(1):142-149(1964))描述的方法來測量無細胞提取物中的乙醯乳酸合酶活性。實施例2(預測的)乙醯酵酸還原異構酶的克隆和表達該預測實施例的目的是描述怎樣從大腸桿菌K12克隆//vC基因並在大腸桿菌BL21-AI中表達。使用PCR從大腸桿菌基因組DNA擴增WvC基因。以實施例1中所述的6w^9基因相同的方式克隆和表達,7vC基因。使用GentraPuregenei式劑盒(GentraSystems,Inc.,Minneapolis,MN;目錄編號D-5000A)從大腸桿菌製備基因組DNA。通過PCR擴增//vC基因，使用引物N100和N101(參見表2)，各自如SEQIDNO:13和14給出，產生1.5kbp產物。正向引物就在轉錄起始密碼子鄰近引入四個鹼基(CCAC)，以允許定向克隆至pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)中來產生質粒pENTRSDD-TOPOUvC。將克隆測序來證實以正確方向插入了基因並證實序列。SEQIDNO:3和SEQIDNO:4各自給出了用於該基因的開放閱讀框(ORF)的核苷酸序列和預測的酶胺基酸序列。為了形成表達克隆，通過重組將WvC基因轉移至pDEST14(Invitrogen)栽體中來產生pDESTl術C。將pDEST14ilvC載體轉化至大腸桿菌BL21-AI細胞中並通過加入阿拉伯糖誘導從T7啟動子的表達。在誘導的培養物中存在預期約54kDa分子量的蛋白質，如從核酸序列推導的，但在未誘導的對照中不存在。使用Arfin和Umbarger(fi/o/.C/iem.244(5):1118-U27(1969))所迷的方法來測量無細胞提取物中的乙醯醇酸還原異構酶。實施例3(預測的)乙醯醇酸脫水酶的克隆和表達該預測實施例的目的是描述怎樣從大腸桿菌K12克隆//vD基因並在大腸桿菌BL21-AI中表達。使用PCR從大腸桿菌基因組DNA擴增z7v/)基因。以實施例1中所述的6^/S基因相同的方式克隆和表達//vZ)基因。使用GentraPuregenei式劑盒(GentmSystems,Inc.,Minneapolis,MN;目錄編號D-5000A)從大腸桿菌製備基因組DNA。通過PCR擴增//vZ)基因，使用引物N102和N103(參見表2)，各自如SEQIDNO:15和16給出，產生1.9kbp產物。正向引物就在轉錄起始密碼子鄰近引入四個鹼基(CCAC),以允許定向克隆至pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)中來產生質粒pENTRSDD-TOPOilvD。將克隆接受測序來證實以正確方向插入了基因並證實序列。SEQIDNO:5和SEQIDNO:6各自給出了用於該基因的幵放閱讀框(ORF)的核苷酸序列和預測的酶胺基酸序列。為了形成表達克隆，通過重組將；7vD基因轉移至pDEST14(Invitrogen)栽體中來產生pDEST14UvD。將pDEST14iWD栽體轉化至大腸桿菌BL21-AI細胞中並通過加入阿拉伯糖誘導從T7啟動子的表達。在誘導的培養物中存在預期約66kDa分子量的蛋白質，如從核酸序列推導的，但在未誘導的對照中不存在。使用Flint等(/.B/o/.CZem.268(20):14732-14742(1993))描迷的方法來測量無細胞提取物中的乙醯醇酸脫水酶活性。實施例4(預測的)支鏈酮酸脫羧酶的克隆和表達該預測實施例的目的是描述怎樣從乳酸乳球菌克隆hVD基因並在大腸桿菌BL21-AI中表達。從GenScript(Piscataway，NJ)獲得編碼乳酸乳球菌的支鏈酮酸脫羧酶(hvD)的DNA序列。獲得的序列對於在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中的表達是密碼子最佳化的並克隆至pUC57中，來形成pUC57-kWD。SEQIDNO:7和SEQIDNO:8各自給出了用於該基因的開放閱讀框(ORF)的密碼子最佳化核苷酸序列和預測的酶胺基酸序列。為了形成表達克隆，使用AWe/和S^w///限制酶位點將來自pUC57-kivD的1.7kbpkivD片段克隆至栽體pET-3a中(Novagen，Madison,WI)。這形成了表達克隆pET-3a-kivD。將pET-3a-kivD栽體轉化至大腸桿菌BL21-AI細胞中並通過加入阿拉伯糖誘導從T7啟動子的表達。在誘導的培養物中存在預期約61kDa分子量的蛋白質，如從核酸序列推導的，但在未誘導的對照中不存在。使用Smit等(/.Mc油o/.5她c/mo/.64:396-402(2003))描述的方法來測量無細胞提取物中的支鏈鯛酸脫羧酶活性。實施例5(預測的)支鏈酵脫氫酶的克隆和表達該預測實施例的目的是描迷怎樣從大腸桿菌K12克隆;^/^基因並在大腸桿菌BL21-AI中表達。使用PCR從大腸桿菌基因組DNA擴增y一D基因。以實施例1中所迷的6w必基因相同的方式克隆和表達月/zD基因。4吏用GentraPuregenei式劑盒(GentraSystems,Inc.,Minneapolis,MN;目錄編號D-5000A)從大腸桿菌製備基因組DNA。通過PCR擴增^AZ)基因，使用引物N104和N105(參見表2)，各自如SEQIDNO:17和18給出，產生1.2kbp產物。正向引物就在轉錄起始密碼子鄰近引入四個石成基(CCAC)，以允許定向克隆至pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)中來產生質粒pENTRSDD-TOPOyqhD。將克隆接受測序來證實以正確方向插入了基因並證實序列。SEQIDNO:9和SEQIDNO:10各自給出了用於該基因的幵放閱讀框(ORF)的核苷酸序列和預測的酶胺基酸序列。為了形成表達克隆，通過重組將y功D基因轉移至pDEST14(Invitrogen)載體中來產生pDEST14yqhD。將pDEST14yqhD載體轉化至大腸桿菌BL21-AI細胞中並通過加入阿拉伯糖誘導從T7啟動子的表達。在誘導的培養物中存在預期約42kDa分子量的蛋白質，如從核酸序列推導的，但在未誘導的對照中不存在。使用Sulzenbacher等(丄C/i亂342(2):489-502(2004))描迷的方法來測量無細胞提取物中的支鏈醇脫氬酶活性。實施例6(預測的)用於異丁酵生物合成途徑中的基因的轉化載體的構建該預測實施例的目的是描述怎樣構建轉化栽體，該栽體包括編碼異丁醇生物合成途徑中五個步驟的基因。將所有基因置於單個啟動子控制下的單個操縱子中。通過PCR擴增單個基因，使用引入限制位點的引物，用於之後的克隆，並且正向引物含有最佳化的大腸桿菌核糖體結合位點(AAAGGAGG)。將PCR產物TOPO克隆至pCR4Blunt-TOPO栽體中並轉化至大腸桿菌ToplO細胞中(Invitrogen)。從TOPO克隆製備質粒DNA並證實基因的序列。根據製造商的推薦使用限制酶和T4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)。為了克隆實驗，使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)將限制片段凝膠純化。證實序列後，將基因亞克隆至作為克隆平臺的修飾pUC19載體中。通過HindlII/SapI消化來修飾pUC19載體，形成pUC19dHS。該消化除去了鄰接MCS(多克隆位點)的lac啟動子，防止操縱子在栽體中的轉錄。通過PCR從肺炎克雷伯氏菌ATCC25955基因組DNA擴增6w必基因，使用引物對N110和N111(參見表2)，各自如SEQIDNO:19和20給出，形成1.8kbp產物。正向引物引入SphI和AflII限制位點和核糖體結合位點(RBS)。反向引物引入PacI和NsiI限制位點。將PCR產物克隆至pCR4Blvmt-TOPO中，形成pCR4Blunt-TOPO-budB。從TOPO克隆製備質粒DNA並證實基因的序列。通過PCR從大腸桿菌K12基因組擴增//vC基因，使用引物對NU2和NU3(參見表2)，各自如SEQIDNO:21和22給出，形成1.5kbp產物。正向引物引入Sail和Nhel限制位點和RBS。反向引物引入Xbal限制位點。將PCR產物克隆至pCR4Blunt-TOPO中，形成pCR4Blunt-TOPO-ilvC。從TOPO克隆製備質粒DNA並證實基因的序列。，通過PCR從大腸桿菌K12基因組擴增！7vD基因，使用引物對N114和N115(參見表2)，各自如SEQIDNO:23和24給出，形成1.9kbp產物。正向引物引入Xbal限制位點和RBS。反向引物引入BamHI限制位點。將PCR產物克隆至pCR4Blunt-TOPO中，形成pCR4Blunt-TOPO-ilvD。從TOPO克隆製備質粒DNA並證實基因的序列。通過PCR從pUC57-kivD(實施例4中所迷的)擴增hvZ)基因，使用引物對NU6和NU7(參見表2)，各自如SEQIDNO:25和26給出，形成1.7bp產物。正向引物引入BamHI限制位點和RBS。反向引物引入SacI限制位點。將PCR產物克隆至pCR4Blunt-TOPO中，形成pCR4Blunt-TOPO-kivD。從TOPO克隆製備質粒DNA並證實基因的序列。通過PCR從大腸桿菌K12基因組DNA擴增>^/iZ)基因，使用引物對N118和N119(參見表2)，各自如SEQIDNO:27和28給出，形成1.2kbp產物。正向引物引入Sacl限制位點。反向引物引入SpeI和EcoRI限制位點。將PCR產物克隆至pCR4Blunt-TOPO中，形成pCR4Blunt-TOPO-yqhD。從TOPO克隆製備質粒DNA並證實基因的序列。為了構建異丁醇途徑操縱子，用Seal和EcoRI從pCR4Blunt-TOPO-wAD切除yqhD基因，釋放1.2kbp片段。將該片段連接之前已經用Sacl和EcoRI消化過的pUC19dHS。通過限制消化來證實所得到的克隆，pUC19dHS-yqhD。接著，用Sail和Xbal從pCR4Blunt-TOPO-ilvC切除i/vC基因，釋放1.5kbp片段。將該片段連接之前已經用Sail和Xbal消化過的pUC19dHS-yqhD。通過限制消化來證實所得到的克隆，pUC19dHS-ilvC-yqhD。然後用Sphl和Nsil從pCR4Blunt-TOPO-6wc^切除6wc^5基因，釋放1.8kbp片段。用Sphl和Pstl消化pUC19dHS-ilvC-yqhD並連接Sphl/Nsil片段(Nsil和Pstl產生相容性末端)，形成pUC19dHS-budB-ilvC-yqhD。用Xbal和BamHI從pCR4Blunt-TOPO-ilvD切除1.9kbp含有〃vD基因的片段，並連接用這些相同的酶消化過的pUC19dHS-budB-ilvC-yqhD，形成pUC19dHS-budB-UvC-ilvD-yqhD。最後，用BamHI和Sacl從pCR4Bhmt-TOPO-kivD切除hvD,釋放1.7kbp片段。將該片段連接之前已經用BamHI和Sacl消化過的pUC19dHS-budB-ilvC-ilvD-yqhD,形成pUC19dHS-budB-UvC-ilvD-kivD-yqhD。用AflII和Spel消化pUC19dHS-budB-ilvC-ilvD-kivD-yqhD來釋放克隆至pBenAS(大腸桿菌-枯草桿菌穿梭載體)中的8.2kbp操縱子片段。通過修飾pBE93栽體來形成質粒，Nagamjan描迷了這(W093/24631,實施例4)。為了製備pBenAS，用pBE93的Nco細ndIII消化除去解澱粉芽孢桿菌(j5ac/'〃wa/wy/o/^w^bc/e"j)中性蛋白酶啟動子(NPR)，信號序列和；/io力基因。從pBE93PCR擴增NPR啟動子，使用引物BenNF和BenASR，各自如SEQIDNO:29和30給出。引物BenASR在啟動子下遊引入AflH，Spel和HindIII位點。用Ncol和HindIII消化PCR產物，並將片段克隆至栽體中的相應位點中，形成pBenAS。將操縱子片段亞克隆至pBenAS中的AflII和Spel位點中，形成pBen-bu犯"lvC-ilvD-kivD-yqhD。實施例7(預測的)大腸桿菌中異丁酵生物合成途徑的表達該預測實施例的目的是描述怎樣在大腸桿菌中表達異丁醇生物合成途徑。將按照實施例6中所述構造的質粒pBen-budB-ilvC-ilvD-kivD-yqhD轉化至大腸桿菌NM522中(ATCCNo.47000)，來獲得大腸桿菌株NM522/pBen-budB-ilvC-ilvD-kivD-yqhD,並通過SDS-PAGE,酶測試和蛋白質印跡分析來監控操縱子中的基因表達。對於蛋白質印跡，通過Sigma-Genosys(TheWoodlands,TX)引發對合成肽的抗體。將大腸桿菌抹NM522/pBen-budB-i〗vC-HvD-kivD-yqhD接種至含有50mL培養基的250mL搖瓶中並在250rpm和35'C振蕩。培養基組成如下葡萄糖(5g/L)，MOPS(0.05M),硫酸銨(0.01M)，磷酸鉀，單價鹼(0.005M)，S10金屬混合物(l%(v/v))，酵母提取物(0.1%(w/v))，酪蛋白胺基酸(0.1%(w/v)),疏胺素(0.1mg/L)，脯氨酸(0.05mg/L)，和生物素(0.002mg/L)，並用KOH滴定至pH7.0。S10金屬混合物含有MgCl2(200mM)，CaCl2(70mM)，MnCl2(5mM)，FeCl3(O.lmM),ZnCl2(0.1mM)，鹽酸硫胺素(0.2mM)，CuS04(172pM)，CoCl2(253nM)和Na2MoC04(242pM)。18h小時後，通過HPLC或GC分析來檢測異丁醇，使用本領域公知的方法，例如，以上一般方法部分中所述的。實施例8(預測的)枯草芽孢桿菌中異丁酵生物合成途徑的表達該預測實施例的目的是描述怎樣在枯草芽孢桿菌中表達異丁醇生物合成途徑。使用實施例7中所述的相同方法。使用按照實施例6中所迷構造的質粒pBen-budB-ilvC-ilvD-kivD-yqhD。將該質粒轉化至枯草芽孢桿菌BE1010中U.Sa"e"o/.173:2278-2282(1991))來獲得枯草芽孢桿菌株BE1010/pBen-budB-ilvC-iWD-kivD-yqhD，並按照實施例7中所迷的來監控每個操縱子中的基因表達。將枯草芽孢桿菌林BE1010/pBen-budB-ilvC-ilvD-kivD-yqhD接種至含有50mL培養基的250mL搖瓶中並在250rpm和35'C振蕩18h。培養基組成如下葡萄糖(5g/L)，MOPS(0.05M),穀氨酸(0.02M)，硫酸銨(0.01M)，磷酸鉀，單價鹼緩沖劑(0.005M)，S10金屬混合物(和實施例11中所述的一樣，l%(v/v))，酵母提取物(0.1%(w/v))，酪蛋白胺基酸(0.1%(w/v))，色氨酸(50mg/L),甲硫氨酸(50mg/L)和賴氨酸(50mg/L)，並用KOH滴定至pH7.0。18h小時後，通過HPLC或GC分析來檢測異丁醇，使用本領域公知的方法，例如，以上一般方法部分中所迷的。實施例9乙醯乳酸合酶的克隆和表達為了形成另一個乙醯乳酸合酶表達克隆，將6wi^基因克隆至栽體pTrc99A中。首先從pENTRSDD-TOPObudB(實施例1中所述的)擴增budB基因，使用在5'端引入Sacl,印el和A^el位點和3'端引入J36va,4/7/1和^^//1位點的引物(NU0.2和N111.2，各自如SEQIDNO:31和32給出)。將所得到的1.75kbpPCR產物克隆至pCR4-BluntTOPO(Invitrogen)中，並證實了DNA序列(使用N130S叫測序引物Fl-F4和R1-R4,各自如SEQIDNO:40-47給出)。然後使用和從該栽體切除基因並克隆至pTrc99A中(Amann等，Gewe69(2):30卜315(1988)),產生pTrc99A::bu犯。將pTrc99A::budB栽體轉化至大腸桿菌TOP10細胞中並將轉化體接種至補充50//g/mL氨千青黴素的LB培養基中並生長過夜。將等份的過夜培養物用來接種50mL補充50pg/mL氨爺青黴素的LB。將培養物在37'C振蕩培養直至OD600達到0.6-0.8。然後通過加入0.4mMIPTG來諫導從Trc啟動子的^wfJ5表達。還製備了沒有用IPTG誘導的陰性對照搖瓶。將搖瓶在37匸振蕩培養4h。按照實施例1中所迷的製備無細胞培養物。按照實施例1中所述的測量無細胞提取物中的乙醯乳酸合酶活性。用IPTG誘導後三個小時，檢測到8單位/mg的乙醯乳酸合酶活性。只攜帶pTrc99A質粒的對照菌株呈現出0.03單位/mg的乙醯乳酸合酶活性。實施例10乙醯酵酸還原異構酶的克隆和表達該實施例的目的是從大腸桿菌K12克隆z/vC基因並在大腸桿菌TOP10中表達。使用PCR從大腸桿菌菌抹FM5(ATCC53911)擴增z'/vC基因。以以上實施例2中對ilvC的克隆和表達所述的相同方式克隆和表達,7vC基因。使用PCR從大腸桿菌FM5基因組擴增//vC，使用引物Nl12.2和Nl13.2(各自為SEQIDNO:33和34)。引物在5，端形成Sacl和4/7/II位點以及最佳的RBS，在//vC的3，端形成A^I,A^el和^37w//1位點。根據製造商的實驗方案(Invitrogen)將1.5kbpPCR產物克隆至pCR4BluntTOPO中，產生pCR4BluntTOPO::ilvC。使用測序引物(N131SeqFl-F3，和N131SeqR卜R3，各自如SEQIDNO:48-53給出)證實了PCR產物的序列。為了形成表達克隆，使用Sacl和萬am/ZI從pCR4BluntTOPO::ilvC切除//vC基因並克隆至pTrc99A中。將pTrc99A::ilvC栽體轉化至大腸桿菌TOP10細胞中並通過加入IPTG誘導從Trc啟動子的表達，如實施例9中所迷的。按照實施例1中所迷的製備無細胞提取物。按照實施例2中所迷的測量無細胞提取物中的乙醯醇酸還原異構酶活性。用IPTG誘導三小時後，檢測到0.026單位/mg的乙醯醇酸還原異構酶活性。只攜帶pTrc99A質粒的對照菌抹呈現出低於0.001單位/mg的乙醯醇酸還原異構酶活性。實施例11乙醯醇酸脫水酶的克隆和表達該實施例的目的是從大腸桿菌K12克隆！7vD基因並在大腸軒菌TOP10中表達。使用PCR從大腸桿菌菌抹FM5(ATCC53911)擴增《7vD基因。以實施例10中所述的//vC基因相同的方式克隆和表達Z/vD基因。使用PCR從大腸桿菌FM5基因組擴增//vZ),使用引物N114.2和NU5.2(各自為SEQIDNO:35和36)。引物在5'端形成^cl和WAel位點以及最佳的RBS,在的3，端形成屍acl和位點。根據製造商的實驗方案(Invitrogen)將1.9kbpPCR產物克隆至pCR4BluntTOPO中，產生pCR4BluntTOPO::ilvD。證實了PCR產物的序列(測序引物N132SeqFl-F4，和N132SeqRl-R4，各自如SEQIDNO:54-61給出)。為了形成表達克隆，使用5""cl和i5"/w//1從質粒pCR4BluntTOPO::ilvD切除z/vD基因並克隆至pTrc99A中。將pTrc99A::ilvD載體轉化至大腸桿菌TOP10細胞中並通過加入IPTG誘導從Trc啟動子的表達，如實施例9中所述的。按照實施例1中所迷的製備無細胞提取物。按照實施例3中所述的測量無細胞提取物中的乙醯醇酸脫水酶活性。用IPTG誘導三小時後，測量到46單位/mg的乙醯醇酸脫水酶活性。只攜帶pTrc99A質粒的對照菌株沒有呈現出乙醯酵酸脫水酶活性。實施例12支鏈酮酸脫羧酶的克隆和表達該實施例的目的是從乳酸乳球菌克隆yb'vD基因並在大腸桿菌TOP10中表達。以以上實施例10中對z7vC所迷的相同方式克隆和表達hvZ)基因。使用PCR從質粒pUC57-kivD(參見以上的實施例4)擴增ibvZ)，使用引物N116.2和NU7,2(各自為SEQIDNO:37和38)。引物在5，端形成SacI和屍acI位點以及最佳的RBS，在hvZ)的3，端形成爿w11，Sg/II和位點。根據製造商的實驗方案(Invitrogen)將1.7kbpPCR產物克隆至pCR4BluntTOPO中，產生pCR4BluntTOPO::kivD。使用引物N133SeqFl-F4，和N133SeqRl-R4(各自如SEQIDNO:62-69給出)證實了PCR產物的序列。為了形成表達克隆，使用和Saw//I從質粒pCR4BluntTOPO::kivD切除//vD基因並克隆至pTrc99A中。將pTrc99A::kivD栽體轉化至大腸桿菌TOP10細胞中並通過加入IPTG誘導從Trc啟動子的表達，如實施例9中所述的。按照實施例1中所迷的製備無細胞提取物。按照實施例4中所迷的測量無細胞提取物中的支鏈酮酸脫羧酶活性，除了使用P，ld喊劑(Aldrich，目錄No,162892)來檢測和定量眵反應產物。用IPTG誘導三小時後，檢測到高於3.7單位/mg的支鏈酮酸脫羧酶活性。只攜帶pTrc99A質粒的對照菌林沒有呈現出支鏈酮酸脫羧酶活性。實施例13支鏈酵脫氪酶的表達大腸桿菌含有鑑定為1,3-丙二醇脫氫酶的天然基因(:^/zZ))(U.S.專利No.6,5M,733)。YqhD蛋白與來自梭菌的AdhB(由adhB編碼)具有40%同一性，AdhB是推定的NADH-依賴性丁醇脫氯酶。使用人Red技術(Datsenko和Wanner,屍rac.A^".爿cac/.Sc,'.".S,A97:6640(2000))將y一D基因置於大腸桿菌菌株MG16551.6yqhD::Cm(WO2004/033646)中的葡萄糖異構酶啟動子1.6GI(SEQIDNO.70)變體的組成型表達之下。MG16551.6yqhD::Cm含有FRT-CmR-FRT盒，使得可以除去抗生素標記。相似地，由1.5GI啟動子(W2003/089621)(SEQIDN0.71)替代天然啟動子，形成菌抹MG16551.5GI-yqhD::Cm,因此，用1.5GI啟動子替代了MG16551.6yqhD::Cm的1.6GI啟動子。將菌林MG16551.5GI-yqhD::Cm在LB培養基中生長至中-對數期並按照實施例I中所述的製備無細胞提取物。測定細胞提取物時，按照在pH7.5和35。C在340nm的吸收值降低，發現該菌株具有NAPDH-依賴性異丁眵還原酶活性。為了產生第二個含有1.5GIyqhD::Cm的表達菌抹，從MG16551.5GIyqhD::Cm製備Pl裂解物，並通過轉導將盒轉移至BL21(DE3)(Invitrogen),形成BL21(DE3)1.5GIyqhD::Cm。實施例14用於異丁醇生物合成途徑中頭四個基因的轉化栽體的構建該實施例的目的是構建包括異丁醇生物合成途徑中頭四個基因(即，6wc^，z/vC，//vD和hvD)的轉化栽體。為了構建轉化栽體，首先，通過用和Sa;w//1消化從pTrc99A::ilvC(實施例10中所述的)獲得/7vC基因並克隆至pTrc99A::budB中(實施例9中所述的)，將其用和imw//1消化來產生質粒pTrc99A::budB-ilvC。接著，各自通過用廳I和屍acl(UvD)以及屍acl和J5a/M//1(kivD)從pTrc99A::ilvD(實施例11中所述的)和pTrc99A::kivD(實施例12中所述的)獲得//vZ)和A:/vD基因。通過三路(three-way)連接將這些基因引入首先用A^el和消化的pTrc99A::budB-ilvC中。通過PCR篩選和限制消化證實了最後的質粒pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD中的所有四個基因。實施例15生長於葡萄糖之上的大腸桿菌中異丁酵生物合成途徑的表達為了形成大腸桿菌異丁醇生產菌抹，將pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kWD(實施例14中所述的)轉化至大腸桿菌MG16551.5GIyqhD::Cm和大腸桿菌BL21(DE3)1.5GIyqhD::Cm(實施例13中所述的)中。最初將轉化體生長在含有5(Hig/mL卡那黴素和100ng/mL羧千青黴素的LB培養基中。將來自這些培養物的細胞用來接種搖瓶(大約175mL總體積)，搖瓶含有50或170mLTM3a/葡萄糖培養基，各自表示高和低氧條件。TM3a/葡萄糖培養基含有(每升)葡萄糖(10g)，KH2P04(13.6g),檸檬酸一水合物(2.0g)，(NH4)2S04(3.0g),MgS04.7H20(2.0g)，CaCl2'2H20(0.2g)，杆檬酸鐵銨(0,33g),.HCl(l.Omg)，酵母提取物(0.50g),和10mL微量元素溶液。用NH4OH將pH調節至6.8。孩吏量元素溶液含有檸檬酸.H20(4.0g/L)，MnSO4.H2O(3.0g/L)，NaCl(l.Og),FeS04.7H20(0.10g/L)，CoCl2.6H2O(0,10g/L)，ZnS04.7H20(0.10g/L)，CuS04.5H20(0.010g/L)，H3B03(0.010g/L)，和Na2MoS04.2H20(0.010g/L)。在SO.Ol單位的起始OD6oo接種搖瓶並在34。C300rpm振蕩培養。用0.2nm過濾器帽子密封含有50mL培養基的搖瓶；用密封的帽子封閉含有150mL培養基的搖瓶。當細胞達到OD60020.4單位時，加入IPTG至0.04mM的終濃度。大約培養18h後，通過HPLC(ShodexSugarSHlOll柱(ShowaDenkoAmerica,Inc.NY),4吏用折射率(RI)檢測)和GC(VarianCP-WAX58(FFAP)CB,0.25mmx0.2nmx25m(Varian，Inc.,PaloAlto,CA，使用火焰電離檢測(FID))分析等份培養基的異丁醇含量，如一般方法部分中所迷的。在只攜帶pTrc99A栽體的對照菌抹中沒有檢測到異丁醇(結果未顯示)。表5中顯示了通過攜帶pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD的菌株產生的異丁醇摩爾選擇性和滴定度。在低氧條件下生長的培養物中獲得顯著較高的異丁醇滴定度。生長於葡萄糖之上的大腸桿菌菌林產生的異丁醇tableseeoriginaldocumentpage61承通過HPLC測定的實施例16生長於蔗糖之上的大腸桿菌中異丁酵生物合成途徑的表達因為實施例15中所迷的菌株不能夠生長於蔗糖之上，構建另外的質粒以允許利用蔗糖用於異丁醇生產。從源自ATCC菌抹13281的利用蔗糖的大腸桿菌菌林的基因組DNA分離蔗糖利用基因簇wcS^4，如SEDIDNO:39所給出的。蔗糖利用基因(cj"，"c尺和c"5)編碼蔗糖水解酶(CscA),如SEQIDNO:139所給出的，D-果糖激酶(CscK)，如SEQIDNO:140所給出的，和蔗糖透性酶(CscB)，如SEQIDNO:141所給出的。沒有包括蔗糖特異性阻遏基因c化凡使得三個基因c"S/C4在大腸桿菌中從它們的天然啟動子組成型表達。用5flm/ZI和消化來自蔗糖利用大腸桿菌菌抹的基因組DNA。從瓊脂糖凝膠分離具有約4kbp平均大小的片段並連接用^w^！和五co尺I消化的質粒pLitmus28(NewEnglandBiolabs)，並轉化至超感受態大腸桿菌TOP10F，細胞中(Invitrogen)。將轉化體在含有1%蔗糖和氨爺青黴素(100ng/mL)的MacConkey瓊脂平板上劃線並篩選紫色菌落的外觀。從紫色轉化體分離質粒DNA,並用M13正向和反向引物(Invitrogen)以及Scrl-4(各自如SEQIDNO:72-75中所給出的)測序。將含有"cS，c化AT和"c」(cjc^A:」)基因的質粒命名為pScrl。為了形成與異丁醇途徑質粒(實施例14)相容的蔗糖利用質粒，將來自pScrl的操縱子亞克隆至pBHRl中(MoBiTec，Goettingen，Germany)。通過用ZAoI消化pScrl(接著用Klenow酶培養來產生鈍末端)，然後用爿gel消化來分離c^^/^基因。將所得到的4.2kbp片段連接已經用A^ad和」gd消化的pBHRl中，形成9.3kbp質粒pBHRl::cscBKA。通過電穿孔將蔗糖質粒pBHRl::cscBKA轉"化至大腸桿菌BL21(DE3)1.5yqhD/pTrc99A::bu犯-ilvC-ilvD-kivD和大腸桿菌MG16551.5yqhD/pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD中(實施例15中所述的)。首先在含有10(Hig/mL氨苄青黴素和50ng/mL卡那黴素的LB培養基上選擇轉化體，然後在MacConkey蔗糖(1%)平板上篩選來證實蔗糖操縱子的功能表達。為了異丁醇的生產，將菌抹生長於含有替代葡萄糖的1%蔗糖的TM3a最小限定培養基中(實施例15中所述的)，分析培養基中所產生的異丁醇含量，如實施例15中所迷的，除了在培養14h後取樣。再者，在只攜帶pTrc99A載體的對照菌林中沒有檢測到異丁醇(結果未顯示)。表6中顯示了通過攜帶pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD的MG16551.5yqhD產生的異丁醇的摩爾選擇性和滴定度。表6tableseeoriginaldocumentpage63"^通過HPLC測定的實施例17釀酒酵母中異丁酵途徑基因的表達為了在釀酒酵母中表達異丁醇途徑基因，構建多個大腸桿菌-酵母穿梭栽體。使用PCR方法(Yu等，Fw"ga/5zo/.41:973-981(2004))來融合具有酵母啟動子和終止子的基因。特別地，將GPD啟動子(SEQIDNO:76)和CYC1終止子(SEQIDNO:77)融合來自枯草芽孢桿菌的fl"S基因(SEQIDNO:78),將FBA啟動子(SEQIDNO:79)和CYC1終止子融合來自釀酒酵母的ILV5基因(SEQIDNO:80),將ADHl啟動子(SEQIDNO:81)和ADHl終止子(SEQIDNO:82)融合來自釀酒酵母的ILV3基因(SEQIDNO:83)，將GPM啟動子(SEQIDNO:84)和ADHl終止子融合來自乳酸乳球菌的h'vD基因(SEQIDNO:7)。將表7中給出的引物設計來包括限制位點，用於將啟動子/基因/終止子產物克隆至來自pRS400系列的大腸桿菌-酵母穿梭栽體中(Christianson等，110:119-122(1992))，並用於交換構建體之間的啟動子。用於ILV5和ILV3的5'端的引物(各自為N138和N155,各自如SEQIDNO:95和107給出的)產生新的起始密碼子來消除這些酶的線粒體靶向。首先通過TOPO克隆反應(Invitrogen)將所有融合的PCR產物克隆至pCR4-Blunt中，並證實了序列(使用M13正向和反向引物(Invitrogen)以及表7中提供的測序引物)。通過TOPO反應將另外兩個啟動子(CUP1和GAL1)克隆至pCR4-Bhmt中，並通過測序來證實；表7中顯示了引物序列。表8中描迷了構建的質粒。將質粒轉化至釀酒酵母BY4743(ATCC201390)或YJR148w(ATCC4036939)中，以使用實施例1-4和實施例9-12中所述的酶測試來測定酶特異性活性。為了測定酶活性，將培養物在缺少表達質粒選擇需要的任何代謝物的合成完全培養基(M"AoA,";TeaWGe"e"cs，2005，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,pp.201-202)中生長至1.0的OD60Q,通過離心收集(在4'C2600xg8分鐘)，用緩沖液洗滌，再次離心，並冷凍於-80'C。將細胞融化，重懸浮於20mMTris-HClpH8.0中至2mL的終體積，然後使用1.2g玻璃珠(0.5mm大小)使用珠子攪拌器來破壞。將每個樣品在高速處理總的3分鐘時間(每分鐘攪打後在水上孵育)。通過離心將提取物清除細胞碎片(在4'C,20,000xg10分鐘)。用於釀酒酵母表達栽體的克隆和測序的引物序列tableseeoriginaldocumentpage64tableseeoriginaldocumentpage65tableseeoriginaldocumentpage66tableseeoriginaldocumentpage67表8攜帶異丁醇途徑基因的大腸桿菌-酵母穿梭栽體tableseeoriginaldocumentpage67tableseeoriginaldocumentpage6845mL培養基加入用有波紋的帽子密封的60mL血清瓶中來製備低氣培養物。按照需要，無菌注射器用來取樣和加入誘導劑。接種後大約24h，將誘導劑CuS04加入至0.03M終濃度。還製備了每個菌株沒有添加CuS04的對照培養物。通過GC和HPLC分析CuS04加入後18或19h和35h的培養物上清液的異丁醇含量，如以上實施例15中所述的。表9中呈現了生長於葡萄糖之上的S良酒酵母YJR148w/pSR423::CUPl-alsS+FBA-ILV3/pHR81::FBA-ILV5+GPM-kivD的結果。對於表9中給出的結果，在35h從好氧培養物取樣，在19h從低氧培養物取樣，並通過HPLC測量。表10中呈現了生長於蔗糖之上的釀酒酵母YJR148w/pSR423::CUPl-alsS+FBA-ILV3/pHR81::FBA-ILV5+GPM-kivD的結果。用18h取的樣並通過HPLC測量來獲得該表中的結果。41通過生長於葡萄糖之上的釀酒酵母YJR148w/DSR423::CUPl-alsS+FBA-ILV3/oHR81::FBA-ILV5+GPM-kivD的異丁酵生產tableseeoriginaldocumentpage70腦通過生長千蔗糖之上的釀酒酵母YJR148w/DSR423::CUPl-aisS+FBA-ILV3/pHR81::FBA-ILV5+GPM-kivD的異丁醇生產tableseeoriginaldocumentpage71菌株後綴"a，，,"b"和"c"表示分開的分離物。結果顯示了，在好氧和低氧條件下在葡萄糖或蔗糖上生長，菌林YJR148w/pSR423::CUP1-alsS+FBA-ILV3/pHR81::FBA-ILV5+GPM-ldvD—致地生產出比對照菌株更高水平的異丁醇。實施例19通過重組釀酒酵母的異丁醇生產將質粒pRS425::CPUl-alsS+FBA-ILV3和pRS426::GALl-ILV5+GPM-kivD(實施例17中所迷的)轉化至釀酒酵母YJR148w中來產生菌抹YJR148w/pRS425::CPU1-alsS+FBA-ILV3/pRS426::GAL1-ILV5+GPM-kivD。通過將栽體pSR425和pRS426(實施例17中所述的)轉化至釀酒酵母YJR148w中製備對照菌抹(YJR148w/pSR425/pRS426)。將菌林維持於合成完全培養基上，如實施例18中所述的。為了異丁醇生產，將細胞轉移至含有2%半乳糖和1%棉子糖而缺少尿嘧啶和亮氨酸的合成完全培養基中。按照實施例18中所迷的製備好氧和低氧培養物。接種後大約12h，將誘導劑CuS04加入高達至0.5mM的終濃度。還製備了每個菌林沒有添加CuS04的對照培養物。在CuS04加入後23h將培養物上清液取樣，如實施例18中所述的。表11中呈現了結果。由於觀察到的最終光密度非常不同並與定量殘留的碳源相關，表中提供了每OD600單位的異丁醇濃度(替代摩爾選擇性)，以允許將含有異丁醇生物合成途徑基因的菌株與對照相比較。ill通過生長於半乳糖和棉子糖之上的釀酒酵母YJR148w/dRS425::CPU1-alsS+FBA-ILV3/dRS426::GAL1曙ILV5+GPM-kivD的異丁__酵生產_tableseeoriginaldocumentpage73tableseeoriginaldocumentpage74菌抹後綴"a"，"b"，"c"，"d"和"e"表示分開的分離物。結果表示總的說來，在好氧和低氧條件下，與對照菌抹相比較，YJR148w/pRS425::CPU1-alsS+FBA-ILV3/pRS426::GAL1-ILV5+GPM-kivD菌抹產生的每光密度單位的異丁醇水平更高。實施例20枯草芽孢桿菌中異丁醇生物合成途徑的表達該實施例的目的是在枯草芽孢桿菌中表達異丁醇生物合成途徑。將異丁醇途徑的五個基因(圖1中的途徑步驟(a)至(e))分成兩個用於表達的操縱子。將各自編碼乙醯乳酸合酶，乙醯醇酸脫水酶和支鏈酮酸脫羧酶的三個基因6wfi仏//v￡>和A:/vZ)整合至枯草芽孢桿菌BE1010的染色體中(Payne和Jackson,Sa"e"o/.173:2278-2282(1991))。將各自編碼乙醯醇酸異構還原酶和丁醇脫氫酶的兩個基因桿菌菌抹中。、'、'i三個基因6z^仏//vD和A:/vD整合至枯草芽孢桿菌BE1010的染色體中。芽孢桿菌整合栽體pFP988DssPspac和pFP988DssPgroE用於三個基因6wa^(SEQIDNO:1)，//vD(SEQIDNO:5)和hvZ)(SEQIDNO:7)的染色體整合。兩個質粒都含有來自pBR322的大腸桿菌複製子，用於在大腸桿菌中選擇的氨節青黴素抗生素標記和兩個與枯草芽孢桿菌染色體中的^cS基因同源的指導栽體整合的片段，以及通過同源重組的插入序列。在sacB同源片段之間是pFP988DssPspac上的spac啟動子(PgroE)或pFP988DssPgroE上的groEL啟動子(PgroE),和用於芽孢桿菌的選擇標記，紅黴素。啟動子片段還含有/acO序列，用於調節/ac/阻遏蛋白的表達。pFP988DssPspac(6,341bp)和pFP988DssPgroE(6,221bp)的序列各自如SEQIDNO:142和SEQIDNO:143給出的。通過從質粒pTrc99abudB-ilvC-ilvD-kivD刪除VvC基因來構建具有三個基因6w6S-z7vZ)-h'vZ)的盒。實施例14中描述了質粒pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD的構建。用AflII和Nhel消化質粒pTrc99A::budB-iWC-ilvD-kivD,用DNA聚合酶的Klenow片段處理來製備鈍末端，並凝膠純化含有pTrc99a栽體，6w^5,z'/vD和yb'vD的所得到的9.4kbp片段。將9.4kbp栽體片段自我連接來形成pTrc99A::budB-ilvD-kivD，並轉化至DH5a感受態細胞(Invitrogen)中。通過限制性作圖證實pTrc99a::budB-ilvD-kivD克隆的//vC基因刪除。用Sacl消化所得到的質粒pTrc99A::budB"lvD-kivD並用DNA聚合酶的Klenow片段處理來製備鈍末端。然後用BamHI消化質粒並將所得到的5,297bp6wc^-,7vZ)-/b'vD片段凝膠純化。將5，297bp6t^^-z7vZ)-A:/vD片段連接整合栽體pFP988DssPspac的Smal和BamHI位點。將連接混合物轉化至DH5a感受態細胞中。通過5.3kbp6w必"/v/)-hvD片段的PCR擴增來篩選轉化體，使用引物T-budB(BamHI)(SEQIDNO:144)和B-kivD(BamHI)(SEQIDNO:145)。將正確的克隆稱為pFP988DssPspac-bu犯-ilvD-kivD。從大腸桿菌轉化體製備質粒pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD，並轉化至按照Doyle等所迷製備的枯草芽孢桿菌BE1010感受態細胞中(J.Bacteriol.144:957(1980))。通過離心收集感受態細胞並將細胞沉澱物重懸浮於小體積的上清液中。將兩體積的SPII-EGTA培養基加入一體積的感受態細胞中(A^e/Zzoo^/brGe"era/am/AYo/ecw/or5<2"w'o/ogy,P.Gerhardt等,編輯，AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC(1994))。將等份(0.3mL)細胞分散於試管中，然後將2至3pg質粒pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD加入試管中。將試管在37。C振蕩培養30分鐘，此後將O.lmL10°/。酵母提取物加入每個試管中，然後進一步培養60分鐘。將轉化體生長於用於選擇的含有紅黴素(1.(Hig/mL)的LB平板上，使用雙重瓊脂覆蓋方法(Mef/joA/orGenem/Mo/ecw/ar5a"eno/ogy,丄X)。通過PCR擴增篩選轉化體，對於使用引物N130S叫F1(SEQIDNO:40)和N130S叫R1(SEQIDNO:44),對於hvZ)使用引物N133S叫Fl(SEQIDNO:62)和N133SeqRl(SEQIDNO:66)。陽性整合體顯示出預期的1.7kbp6w必和1.7kbpA:/vDPCR產物。鑑定了兩個陽性整合體並命名為枯草芽孢桿菌BEIOIO△sacB::Pspac-budB-ilvD-kivD#2-3-2和枯草芽孢桿菌BE1010厶sacB::Pspac-budB曙ilvD-kivD#6-12-7。整合體枯草芽孢桿菌BE1010AsacB::Pspac-budB-ilvD-kivD#2-3-2和枯草芽孢桿菌BE1010AsacB::Pspac-budB-iivD-kivD#6-12-7中的酶活性測定表明BudB，IlvD和KivD在spac啟動子(Pspac)的控制下是低的。為了提高功能性酶的表達，由來自質粒pHTOl(MoBitec，Goettingen，Germany)的PgroE啟動子替代Pspac啟動子。通過Xhol和BamHI限制性消化從不相關的質粒切除6,039bppFP988Dss栽體片段，如SEQIDNO:146給出的，並凝膠純化。從質粒pHTOlPCR擴增PgroE啟動子，使用引物T-groE(Xhol)(SEQIDNO:147)和B曙groEL(Spel,BamHI)(SEQIDNO:148)。用Xhol和BamHI消化PCR產物，連接6,039bppFP988Dss栽體片段，並轉化至DH5a感受態細胞中。通過PCR擴增篩選轉化體，使用引物T-groE(Xhol)和B-groEL(Spel，BamHI)。陽性克隆顯示出預期的174bpPgroEPCR產物並稱為pFP988DssPgroE。還通過DNA測序證實了質粒pFP988DssPgroE。用Spel和Pmel消化質粒pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD並將所得到的5,313bpbu犯-ilvD-kivD片段凝膠純化。將budB-ilvD-kivD片段連接pFP988DssPgroE的Spel和Pmel位點並轉化至DH5a感受態細胞中。通過PCR擴增篩選陽性克隆的1，6卯bpPCR產物，使用引物T-groEL(SEQIDNO:149)和Nlll(SEQIDNO:20)。將陽性克隆稱為pFP988DssPgroE-budB-ilvD-kivD。從大腸桿菌轉化體製備質粒pFP988DssPgroE-budB-ilvD-kivD，並轉化至枯草芽孢桿菌BE1010感受態細胞中，如上所迷。通過PCR擴增篩選轉化體，對於6w必使用引物N130SeqFl(SEQIDNO:40)和N130S叫R1(SEQIDNO:44)，對於A/vD使用引物N133S叫F1(SEQIDNO:62)和N133SeqRl(SEQIDNO:66)。陽性整合體顯示出預期的1.7kbp6w必和1.7kbp/b'vZ)PCR產物。分離了兩個陽性整合體並命名為枯草芽孢桿菌BE1010AsacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#1-7和枯草芽孢桿菌BE1010厶sacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#8-16。!7vC和6d/^基因的質粒表達。從質粒表達兩個剩餘的異丁酵基因，z/vC和Z^/2S。將質粒pHT01(MoBitec)，芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭栽體，用於將來自枯草芽孢桿菌的Z/vC基因與PgroE啟動子融合，使得Z/vC基因從含有/acO序列的PgroE啟動子表達。從枯草芽孢桿菌BR151(ATCC33677)基因組DNAPCR擴增,7vC基因，如SEQIDNO:186給出的，使用引物T-ilvCB.s.(BamHI)(SEQIDNO:150)和B-ilvCB.s.(SpelBamHI)(SEQIDNO:151)。用BamHI消化l,067bp//vCPCR產物並連接pHTOl的BamHI位點。將連接混合物轉化至DH5a感受態細胞中。通過PCR擴增篩選陽性克隆的l，188bpPCR產物，使用引物T-groEL和B-ilvB.s(SpelBamHI)。將陽性克隆稱為pHT01-ilvC(B.s)。將質粒pHTOl-ilvC(B.s)用作PgroE-ilvC融合片段的PCR擴增的才莫板。質粒pBD64(Minton等，Wwc/e/c爿c/A18'.1651(1990))是相當穩定的載體，用於在枯草芽孢桿菌中表達外源基因，並含有repB基因以及氯黴素和卡那黴素抗性基因，用於在枯草芽孢桿菌中的選擇。該質粒用於！7vC和6d/zfi在PgroE啟動子控制下的表達。為了將PgroE-i/vC，和/ac/阻遏基因克隆至質粒pBD64中，使用一步裝配方法(Tsuge等，A^c/e/c爿c/^尺仏31:e133(2003))。從pBD64PCR擴增3,588bppBD64片段，該片段含有^/7i5基因，其包括複製功能，和卡那黴素抗生素標記，使用引物T-BD64(DraIII)(SEQIDNO:152),其引入DraIII序列(CACCGAGTG),和B-BD64(DraIII)(SEQIDNO:153)，其引入Drain序列(CACCTGGTG)。從pMUTIN4PCR擴增1，327bp/ac/阻遏基因(Vagner等，Mcra6/。/.144:3097-3104(1988)),使用T-lacIq(DraIII)(SEQIDNO:154)，其引入了DraIII序列(CACCAGGTG),和B-lacIq(DraIII)(SEQIDNO:155),其引入了DmIII序列(CACGGGGTG)。從p謂l-ilvC(B,s)PCR擴增l,224bpPgroE-ilvC融合的盒，使用T-groE(DraIII)(SEQIDNO:156),其引入了Drain序列(CACCCCGTG),和B-B.s.ilvC(DraIII)(SEQIDNO:157)，其引入了DraIH序列(CACCGTGTG)。從丙醇丁酮梭菌(ATCC824)基因組DNAPCR擴增1.2kbpW/^基因(SEQIDNO:158)，使用引物T-bdhB(DraIII)(SEQIDNO:159),其引入了DmIII序列(CACACGGTG)，和B-bdhB(rrnBTlDraIII)(SEQIDNO:160),其引入了DraIII序列(CACTCGGTG)。Dralll識別序列的可變區中的三個下劃線字母是為了特異性鹼基配對而設計的，以pBD64-/ac/-PgroE,7vC-Z^//^的次序裝配四個片段。用Drain分開消化兩個末端的每個具有Dralll的PCR產物，將所得到的Dralll片段，3,588bppBD64,/ac/，PgroE/7vC和凝膠純化，使用QIAGEN凝膠提取試劑盒(QIAGEN)。製備含有等摩爾濃度的每個片段的混合物，用於連接，總DNA濃度為30至50ng/100fiL。然後將連接溶液在16'C孵育過夜。連接產生高分子量串聯重複DNA。將連接的長線性DNA混合物直接轉化至感受態枯草芽孢桿菌BEIOIO中，按照以上所迷的來製備。枯草芽孢桿菌優選採用長的重複的線性DNA形式，而不是環狀DNA來建立質粒。轉化後，將培養物塗布在含有1(Hig/mL卡那黴素的LB平板上，用於選擇。通過Dralll消化篩選陽性重組質粒，獲得四個具有預期大小3，588bp(pBD64)，l,327bp(/ac/)，1'244bp(PgoE々/vC)和1,194bp(W/^)的片段。將陽性質粒稱為pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB。通過枯草芽孢桿菌BEIOIOAsacB::PgroE-budB-ilvD-kivD/DBDPgroE-ilvC(B.s.VbdhB從葡菊糖或蔗糖生產異丁醇的證明。為了構建表達異丁醇生物合成途徑的五個基因的重組枯草芽孢桿菌，如上所迷製備兩個整合體枯草芽孢桿菌BEIOIOAsacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#1-7和枯草芽孢桿菌BEIOIO厶sacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#8-16的感受態細胞，並用質粒pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB轉化，產生枯草芽孢桿菌BEIOIOAsacB::PgroE-budB-UvD-kivD#l-7/pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB和枯草芽孢桿菌BEIOIOAsacB::PgroE-budB曙ilvD-kivD#8-16/pBDPgroE-UvC(B.s.)-bdhB。將兩個重組菌林在125mL燒瓶中的25mL或100mL含有卡那黴素(lOpg/mL)的葡萄糖培養基中培養，來各自模擬高氧和低氧條件，並在37。C200rpm振蕩好氧生長。培養基由10mM(NH4)2S04,5mM磷酸鉀緩衝液(pH7.0),100mMMOPS/KOH緩衝液(pH7.0),20mM穀氨酸/KOH(pH7.0),2。/。S10金屬混合物，1%葡萄糖，0.01%酵母提取物，0.01%酪蛋白胺基酸以及各自50ng/mL的L-色氨酸，L-甲硫氨酸和L-賴氨酸組成。S10金屬混合物由200mMMgCl2,70mMCaCl2，5mMMnCl2，O.lmMFeCl3,O.lmMZnCl2，0.2mM鹽酸硫胺素，0.172mMCuS04,0.253mMCoCl2和0.242mMNa2MoC04組成。在早對數期(大約0.2的OD600)用l.OmM異丙基-P-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)誘導細胞。接種後24h，通過HPLC(ShodexSugarSHlOll柱)使用折射率(RI)檢測分析等份培養液的異丁醇含量，如一般方法部分中所述。表12中顯示了HPLC結果。表12通過枯草芽孢桿菌BE1010AsacB::PgroE-budB-UvD-kivD/pBDPgroE-ilvC(B.s.VbdhB菌株從葡菊糖生產異丁酵tableseeoriginaldocumentpage79枯草芽孢桿菌a是枯草芽孢桿菌BE1010△sacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#l-7/pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB枯草芽孢桿菌b是枯草芽孢桿菌BE1010△sacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#8-16/pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB還檢測了枯草芽孢桿菌BE1010AsacB::PgroE-budB-iWD-kivD#l-7/pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB分離物從蔗糖的異丁醇生產，基本上如上所述。將重組菌林在125mL燒瓶中的25mL或75mL含有卡那黴素(lOpg/mL)的蔗糖培養基中培養，來模擬高氧和中等氧水平，並在37°C200rpm振蕩生長。除了用10g/L蔗糖替代葡萄糖(10g/L)，蔗糖培養基與葡萄糖培養基相同。細胞沒有誘導，或在早對數期(大約0.2的OD600)用l.OmM異丙基-卩-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)誘導。接種後24h,通過HPLC(ShodexSugarSHlOll柱)使用折射率(RI)檢測分析等份培養液的異丁醇含量，如一般方法部分中所述。表13中顯示了HPLC結杲。表13通過枯草芽孢桿菌BE1010AsacB::PgroE-bu犯-ilvD-kivD/DBDPgroE-ilvC(B.s.VbdhB菌株從蔗糖生產異丁酵菌林02水平異丁醉，mM摩爾選擇性，％枯草芽孢桿菌a(未諸導)高未測出未測出枯草芽孢軒菌a(誘導的)高0.444.9枯草芽孢桿菌a(誘導的)中等0.838.6枯草芽孢桿菌a是枯草芽孢桿菌BE1010△sacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#1-7/pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB實施例21(預測的)植物乳桿菌中異丁酵生物合成途徑的表達該預測實施例的目的是描述怎樣在植物乳桿菌中表達異丁醇生物合成途徑。將異丁醇途徑的編碼五個酶活性的五個基因分至用於表達的兩個操縱子中。通過同源重組將各自編碼乙醯乳酸合酶，乙醯醇酸脫水酶和支鏈a-酮酸脫羧酶的基因6waf仏/7vD和/fc/vD整合至植物乳桿菌的染色體中，使用Hols等所述的方法(^p/.Em;!'nw.A^cra6〖o/.60:1401-1413(1994))。將剩餘的兩個基因(!7vC和M/i仏各自編碼乙醯醇酸還原異構酶和丁醇脫氫酶)克隆至表達質粒中並轉化至攜帶整合異丁醇基因的乳桿菌菌株中。將植物乳桿菌生長於37'CMRS培養基(DifcoLaboratories,Detroit,MI)中，並分離染色體DNA,如Moreira等所述的(SMCM/cro6/0/.5:15(2005))。整合。通過同源重組將合成Pll啟動子(Rud等，M/cTo6/o/ogy152:1011-1019(2006))控制下的Zm必-歸-ybvD盒在/W丄/基因座整合至植物乳桿菌ATCCBAA-793(NCIMB8826)的染色體中。為了構建/說乙整合靶向栽體，將來自植物乳桿菌的具有/^丄同源性的DNA片段(GenbankNC—004567)PCR擴增，使用引物IDHEcoRVF(SEQIDNO:161)和IDHAatIIR(SEQIDNO:162)。將1986bpPCR片段克隆至pCR4Blunt-TOPO中並測序。用EcoRV和AatII消化pCR4Blunt-TOPO-IdhLl克隆，釋放1982bpIdhLl片段，將其凝膠純化。用HmdIII消化整合栽體pFR988,如SEQIDNO:177給出的，用KlenowDNA聚合酶處理來鈍化末端。然後用AatII消化線性化的質粒，並將293lbp載體片段凝膠純化。將EcoRV/AatllIdhLl片段連接pFP988栽體片段並轉化至大腸桿菌ToplO細胞中。在含有氨爺青黴素(100fig/mL)的LB瓊脂平板上選擇轉化體並通過菌落PCR篩選來證實pFP988-IdhL的構建。為了將選擇標記添加至整合DNA,從pC194(GenBankNC—002013,SEQIDNO:267)PCR擴增具有啟動子的Cm基因，使用引物CmF(SEQIDNO:163)和CmR(SEQIDNO:164)，擴增了836bpPCR產物。將該PCR產物克隆至pCR4Bhmt-TOPO中並轉化至大腸桿菌ToplO細胞中，形成pCR4Bhmt-TOPO-Cm。測序後證實了通過PCR沒有引入錯誤，從pCR4Bhmt-TOPO-Cm將Cm盒消化為828bpMluI/Swal片段並凝膠純化。用Mlul和Swal消化含有IdhL同源性的整合栽體pFP988-IdhL，並將4740bp栽體片段凝膠純化。將Cm盒片段連接pFP988-IdhL栽體，形成pFP988-DIdhL::Cm。最後，用合成的PU啟動子替代澱粉酶啟動子來修飾實施例20中所述的來自pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD的6wfi^-!7vD-hvZ)盒。然後，將整個操縱子轉移至pFP988-DIdhL::Cm中。通過用引物PllF-Stul(SEQIDNO:165)和PUR-Spel(SEQIDNO:166)退火寡核苷酸來構建Pll啟動子。將退火的寡核苷酸在6°/。UltraPAGE凝膠上凝膠純化(EmbiTec，SanDiego，CA)。用Stul和Spel消化含有澱粉酶啟動子的質粒pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD，並將所得到的10.9kbp栽體片段凝膠純化。將分離的Pll片段連接消化的pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD形成pFP988-PU-budB-ilvD-kivD。然後用Stul和BamHI消化質粒pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD,並將所得到的5.4kbpPll-budB-UvD-kivD片段凝膠純化。用Hpal和BamHI消化pFP988-DldhL::Cm並分離5.5kbp栽體片段。將bu犯-ilvD-kivD操縱子連接整合載體pFP988-DIdhL::Cm形成pFP988-DIdhL-P11-budB-ilvD-kivD::Cm。將pFP988-DIdhL-Pll-budB-ilvD-kivD::Cm整合至植物乳桿菌BAA-793中形成包括外源6"d仏i/vD，hvD基因的植物乳桿菌AIdhLl::budB-ilvD-ldvD::Cm。按照Aukrust,T.W.等所述的製備植物乳詳幹菌的電感受'態細胞(在￡7e"ro/7on3〃ow/Vofoco/j/brA/z'croorgaw"/7w;Nickoloff，J.A編輯；A^/Zcxisz力A/o/ecw/ar5/o/ogy，Vol.47;HumanaPress,Inc.,Totowa,NJ,1995,pp201-208)。電穿孔後，按照上文中Aukrust等所述的將細胞在MRSSM培養基中(補充0.5M蔗糖和0.1MMgCh的MRS培養基)37。C生長2h,沒有振蕩)。將電穿孔的細胞塗布於用於選擇的含有氯黴素(10ng/mL)的MRS平板上並在37匸培養。最初通過菌落PCR擴增來篩選轉化體以證實整合，然後通過PCR使用一組引物來更嚴格地篩選最初的陽性克隆。Z/vC和6c//^基因的質粒表達。在植物乳桿菌IdhL啟動子的控制下(Ferain等，S餘"W.176:596-601(1994))從質粒pTRKH3(O，SulHvanDJ和KlaenhammerTR，Ge"e137:227-231(1993))表達剩餘的兩個異丁醇基因。使用引物PIdhLF-HindIII(SEQIDNO:167)和PIdhLR-BamHI(SEQIDNO:168)從植物乳桿菌ATCCBAA-793的基因組PCR擴增IdhL啟動子。將411bpPCR產物克隆至pCR4Blunt-TOPO中並測序。用HindIII和BamHI消化所得到的質粒pCR4Blunt-TOPO-PIdhL,釋放PIdhL片段。用HindIII和Sphl消化質粒pTRKH3，並將凝膠純化的栽體片段以三通方式連接PIdhL片段和來自芽孢桿菌表達質粒pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB的凝膠純化的含有ilvC(B.s.)-bdhB的2.4kbpBamHI/Sphl片段(實施例20)。將連接混合物轉化至大腸桿菌Top10細胞中並將轉化體生長於含有紅黴素(150mg/L)的腦心浸液(BHI，DifcoLaboratories,Detroit,MI)平板上。通過PCR篩選轉化體來證實構建。通過電穿孔將所得到的表達質粒pTRKH3-ilvC(B.s.)-bdhB轉化至植物乳桿菌△IdhLl:bu犯-iWD-kivD::Cm中，如上所迷。將含有pTRKH3-ilvC(B.s.)-bdhB的植物乳桿菌△IdhLl::budB-ilvD-kivD::Cm接種至含有50mL添加紅黴素(10|iig/mL)的MRS培養基的250mL燒瓶中並在37'C生長18至24h，沒有振蕩，此後，通過HPLC或GC分析檢測異丁醇，如一般方法部分所述的。實施例22(預測的)糞腸球菌中異丁酵生物合成途徑的表達該預測實施例的目的是描述怎樣在糞腸球菌中表達異丁醇生物合成途徑。已經公開了糞腸球菌菌株V583的完整基因組序列(Paulsen等，Scie"ce299:2071-2074(2003))，將其用作該實施例中表達異丁醇生物合成途徑的宿主菌株。將大腸桿菌革蘭氏陽性穿梭栽體，質粒pTRKH3(O，SullivanDJ和KlaenhammerTR，137:227-231(1993))，用於異丁醇途徑的五個基因(6"仏〃vC，//v￡>，h'vD，涵S)在一個操縱子中的表達。pTRKH3含有大腸桿菌質粒pl5A複製起點，pAM|31複製子，以及用於四環素和紅黴素的兩個抗生素抗性選擇標記。四環素抗性只在大腸桿菌中得到表達，而紅黴素抗性在大腸桿菌和革蘭氏陽性細菌中都得到表達。質粒pAMpi衍生物可以在糞腸球菌中複製(Poyart等，F5"MSM.，編.156:193-198(1997))。將誘導型nisA啟動子(PnisA)用於控制編碼異丁醇生物合成途徑的酶的五個所需基因的表達，該啟動子已經用於基因表達的有效控制，通過各種革蘭氏陽性細菌包括糞腸球菌中的乳酸鏈球菌肽(Eichenbaum等，々y/.E"v,ro".M/cra6/'o/.64:2763-2769(1998))。將含有異丁醇途徑操縱子的質粒pTrc99A::budB-ilvC-UvD-kivD(實施例14中所迷的)進行修飾，用枯草芽孢桿菌//vC基因(SEQIDNO:)替代大腸桿菌,7vC基因(SEQIDNO:3)。此外，將來自丙醇丁酮梭菌的bdhB基因(SEQIDNO:158)添加至操縱子的末端。首先，使用引物F-bdhB-AvrII(SEQIDNO:169)和R-bdhB-BamHI(SEQIDNO:170)擴增來自pBDPgroE-ilvC(B.s.)德B(實施例20中所述的)的Z>^2基因，然後TOPO克隆並測序。通過用AvrII和BamHI消化接著凝膠純化分離了1194bp6d/^片段。將6cZ/^片段連接之前已經用AvrII和BamHI消化的pTrc99A::budB-ilvC-"vD-kivD,並將所得到的片段凝膠純化。通過電穿孔將連接混合物轉化至大腸桿菌ToplO細胞中並在含有氨苄青黴素(100ng/mL)的LB瓊脂平板上37'C生長過夜後選擇轉化體。然後通過菌落PCR篩選轉化體以證實含有pTrc99A::budB-iWC-ilvD-kivD-bdhB的正確克隆。接著，使用引物F-ilvC(B.s.)-AflII(SEQIDNO:171)和R-ilvC(B.s.)-NotI(SEQIDNO:172)擴增來自pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB(實施例20中所迷的)的//vC(B.s)。將PCR產物克隆並測序。通過用AflII和Notl消化接著凝膠純化分離了1051bp/7vC(及J.)片段。將該片段連接已經用AflII和Notl切割釋放了大腸桿菌Z/vO(在連接i/vC(及s.)之前凝膠純化了10.7kbp栽體條帶)的pTrc99A::bu犯-ilvC-ilvD-kivD-bdhB。通過電穿孔將連接混合物轉化至大腸桿菌ToplO細胞中並在含有氨節青黴素(lOO^g/mL)的LB瓊脂平板上37'C生長過夜後選擇轉化體。然後通過菌落PCR篩選轉化體以證實含有pTrc99A::budB-ilvC(B.s.)-"vD-kivD-bdhB的正確克隆。為了提供用於大腸桿菌革蘭氏陽性穿梭栽體pTRKH3的啟動子，使用引物F-PnisA(HindIII)(SEQIDNO:173)和R-PnisA(SpelBamHI)(SEQIDNO:174)從乳酸乳球菌基因組DNAPCR擴增"/W啟動子(Chandrapati等，Mo/.Mc油'o/.46(2):467-477(2002)),然後TOPO克隆。測序後，通過用HindIII和BamHI消化接著凝膠純化分離了213bpnisA啟動子片段。用HindIII和BamHI消化質粒pTRKH3並將栽體片段凝膠純化。將線性化pTRKH3連接PnisA片段並通過電穿孔轉化至大腸桿菌ToplO細胞中。在含有紅黴素(25ng/mL)的LB瓊脂平板上37'C生長過夜後選擇轉化體。然後通過菌落PCR篩選轉化體以證實pTRKH3-PnisA的正確克隆。用Spel和BamHI消化質粒pTRKH3-PnisA，並將載體凝膠純化。用Spel和BamHI消化上述的質粒pTrc99A::budB畫ilvC(B.s.)-ilvD-kivD-bdhB,並將7.5kbp片段凝膠純化。將7.5kbp6wc^w7vCYA1sv)-//vZ>A:zvD-W/^片段在Spel和BamHI位點連接pTRKH3-PnisA。通過電穿孔將連接混合物轉化至大腸桿菌ToplO細胞中並在含有紅黴素(25ng/mL)的LB瓊脂平板上37。C生長過夜後選擇轉化體。然後通過菌落PCR篩選轉化體。將所得到的質粒稱為pTRKH3-PnisA-budB-ilvC(B.s.)-ilvD-kivD-bdhB。從大腸桿菌轉化體製備該質粒並使用本領域已知的方法轉化至電感受態糞腸球菌V583細胞中(Aukrust，T.W.等，在￡7e"ro/on3〃'ow屍wfoco/s/orM'craorgaw/s脂(微生物的電穿孔方案)；Nickoloff,J.A.編輯；iW^/ioA/"A/o/ecw/arS/o/ogy(分子生物學方法)，Vol.47;HumanaPress,Inc,，Totowa,NJ.,1995,pp.217-226)，得到糞腸球菌V583/pTRKH3-PnisA-budB-i1vC(Bs.)-i1vD-kivD-bdhB。通過電穿孔將含有w/"調控基因，"/W和m'jAT，ac/必壯觀黴素抗性基因和pSH71複製起點的第二個質粒轉化至糞腸球菌V583/pTRKH3-PnisA-budB-ilvC(B.s.)-ilvD-kivD-bdhB中含有pSH71複製起點的質粒與糞腸球菌中的pAMpi衍生物相容(Eichenbaum等，J:X)。在37'C生長的含有紅黴素(25ng/mL)和壯觀黴素(100ng/mL)的LB瓊脂平板上選擇雙藥物抗性轉化體。將所得到的帶有兩個質粒(即表達質粒(pTRKH3-PnisA-budB-ilvC(B.s.)-ilvD-kivD-bdhB)和調控質粒(pSH71-nisRK))的糞腸球菌株V583B接種於含有50mL補充酵母提取物(0.2%)(Fischetti等，丄161:1384-1401(1985)),乳酸鏈球菌肽(20ng/mL)(Eichenbaum等，丄X)，紅黴素(25嗎/mL)和壯觀黴素(lOOpg/mL)的Todd-Hewitt培養液的250mL燒瓶中。將燒瓶在37'C培養18-24h，沒有振蕩，該時間後，通過HPLC或GC分析測量異丁醇產生，如一般方法部分中所述的。權利要求1.重組微生物宿主細胞，其包括至少一個編碼多肽的DNA分子，該多肽催化選自以下的底物至產物的轉化i)丙酮酸至乙醯乳酸(途徑步驟a)，ii)乙醯乳酸至2，3-二羥基異戊酸(途徑步驟b)，iii)2，3-二羥基異戊酸至α-酮基異戊酸(途徑步驟c)，iv)α-酮基異戊酸至異丁醛(途徑步驟d)，和v)異丁醛至異丁醇(途徑步驟e)；其中至少一個DNA分子對於所述微生物宿主細胞是異源的，並且其中所述微生物宿主細胞產生異丁醇。1.180185190ProAspAspAlalieAspGinValAlaLysLeulieAlaGinAlaLys195200205AsnProliePheLeuLeuGlyLeuMetAlaSerGinProGluAsnSer210215220LysAlaUuArgArgUuLeuGluThrSerHislieProValThrSer225230235240ThrTyrGinAlaAlaGlyAlaValAsnGinAspAsnPheSerArgPhe245250255AlaGlyArgValGlyLeuPheAsnAsnGinAlaGlyAspArgLeuLeu260265270GinLeuAlaAspLeuVallieCyslieGlyTyrSerProValGluTyr275280285GluProAlaMetTrpAsnSerGlyAsnAlaThrLeuValHislieAsp290295300ValLeuProAlaTyrGluGluArgAsnTyrThrProAspValGluLeu1.tableseeoriginaldocumentpage0imageseeoriginaldocumentpage921476<212〉畫<213〉大腸桿菌<400〉3atggctaactacttcaatacactgaatctgcgccagcagctggcacagctgggcaaatgt60cgctttatgggccgcgatgaattcgccgatggcgcgagctaccttcagggtaaaaaagta120gtcatcgtcggctgtggcgcacagggtctgaaccagggcctgaacatgcgtgattctggt180ctcgatatctcctacgctctgcgtaaagaagcgattgccgagaagcgcgcgtcctggcgt240aaagcgaccgaaaatggttttaaagtgggtacttacgemgaactgatcccacaggcggat300ctggtgattaacctgacgccggacaagcagcactctgatgtagtgcgcaccgtacagcca360ctgatgaaagacggcgcggcgctgggctactcgcacggtttcaacatcgtcgaagtgggc420gagcagatccgtaaagatatcaccgtagtgatggttgcgccgaaatgcccaggcaccgaa480gtgcgtgaagagtacaaacgtgggttcggcgtaccgacgctgattgccgttcacccggaa540aacgatccgaaaggcgaaggcatggcgattgccaaagcctgggcggctgcaaccggtggt600caccgtgcgggtgtgctggaatcgtccttcgttgcggaagtgaaatctgacctgatgggc660gagcaaaccatcctgtgcggtatgttgcaggctggctctctgctgtgcttcgacaagctg720gtggaagaaggtaccgatccagcatacgcagaaaaactgattcagttcggttgggaaacc780atcaccgaagcactgaaacagggcggcatcaccctgatgatggaccgtctctctaacccg840gcgaaactgcgtgcttatgcgctttctgaacagctgaaagagatcatggcacccctgttc900cagaaacatatggacgacatcatctccggcgaattctcttccggtatgatggcggactgg960gccaacgatgataagaaactgctgacctggcgtgaagagaccggcaaaaccgcgtttgaa1020accgcgccgcagtatgaaggcaaaatcggcgagcaggagtacttcgataaaggcgtactg1080atgattgcgatggtgaaagcgggcgttgaactggcgttcgaaaccatggtcgattccggc1140atcattgaagagtctgcatattatgaatcactgcacgagctgccgctgattgccaacacc1200atcgcccgtaagcgtctgtacgaaatgaacgtggttatctctgataccgctgagtacggt1260aactatctgttctcttacgcttgtgtgccgttgctgaaaccgtUatggcagagctgcaa1320ccgggcgacctgggtaaagctattccggaaggcgcggtagataacgggcaactgcgtgat1380gtgaacgaagcgattcgcagccatgcgattgagcaggtaggtaagaaactgcgcggctat1440atgacagatatgaaacgtattgctgttgcgggttaa14764491〈212〉PRT<213〉大腸桿菌4MetAlaAsnTyrPheAsnThrLeuAsnLeuArgGinGinLeuAlaGin151015LeuGlyLysCysArgPheMetGlyArgAspGluPheAlaAspGlyAla202530SerTyrLeuGinGlyLysLysValVallieValGlyCysGlyAlaGin354045GlyLeuAsnGinGlyLeuAsnMetArgAspSerGlyLeuAsplieSer505560TyrAlaLeuArgLysGluAlalieAlaGluLysArgAlaSerTrpArg65707580LysAlaThrGluAsnGlyPheLysValGlyThrTyrGluGluLeulie859095ProGinAlaAspLeuVallieAsnLeuThrProAspLysGinHisSer100105110AspValValArgThrValGinProLeuMetLysAspGlyAlaAlaLeu115120125GlyTyrSerHisGlyPheAsnlieValGluValGlyGluGinlieArgtableseeoriginaldocumentpage0formulaseeoriginaldocumentpage97formulaseeoriginaldocumentpage97385390395400lieAlaArgLysArgLeuTyrGluMetAsnValVallieSerAspThr405410415AlaGluTyrGlyAsnTyrLeuPheSerTyrAlaCysValProLeuLeu420425430LysProPheMetAlaGluLeuGinProGlyAspLeuGlyLysAlalie435440445ProGluGlyAlaValAspAsnGlyGinLeuArgAspValAsnGluAla450455460lieArgSerHisAlalieGluGinValGlyLysLysLeuArgGlyTyr465470475480MetThrAspMetLysArglieAlaValAlaGly485490<210〉5<211〉1851DNA<213〉大腸桿菌〈400〉5atgcctaagtaccgttccgccaccaccactcatggtcgtaatatggcgggtgctcgtgcg60ctgtggcgcgccaccggaatgaccgacgccgatttcggtaagccgattatcgcggttgtg120aactcgttcacccaatttgtaccgggtcacgtccatctgcgcgatctcggtaaactggtc180gccgaacaaattgaagcggctggcggcgttgccaaagagttcaacaccattgcggtggat240gatgggattgccatgggccacggggggatgctttattcactgccatctcgcgaactgatc300gctgattccgttgagtatatggtcaacgcccactgcgccgacgccatggtctgcatctct360aactgcgacaaaatcaccccggggatgctgatggcttccctgcgcctgaatattccggtg420atctttgtttccggcggcccgatggaggccgggaaaaccaaactttccgatcagatcatc480aagctcgatctggttgatgcgatgatccagggcgcagacccgaaagtatctgactcccag540agcgatcaggttgaacgttccgcgtgtccgacctgcggttcctgctccgggatgtttacc600gctaactcaatgaactgcctgaccgaagcgctgggcctgtcgcagccgggcaacggctcg660ctgctggcaacccacgccgaccgtaagcagctgttccttaatgctggtaaacgcattgtt720gaattgaccaaacgttattacgagcaaaacgacgaaagtgcactgccgcgtaatatcgcc780agtaaggcggcgtttgaaaacgccatgacgctggatatcgcgatgggtggatcgactaac840accgtacttcacctgctggcggcggcgcaggaagcggaaatcgacttcaccatgagtgat900atcgataagctttcccgcaaggttccacagctgtgtaaagttgcgccgagcacccagaaa960taccatatggaagatgttcaccgtgctggtggtgttatcggtattctcggcgaactggatcgcgcggggttactgaaccgtgatgtgaaaaacgtacttggcctgacgttgccgcaaacgctggaacaa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