糖尿病鑑別試劑盒及其製作方法
2023-12-09 04:18:11 2
專利名稱：糖尿病鑑別試劑盒及其製作方法
糖尿病鑑別試劑盒及其製作方法，涉及利用卡介苗(BCG)65KD熱休克蛋白作為抗原，運用ELISA法檢測糖尿病患者血清中64KD抗體，在臨床上鑑別診斷糖尿病型別的一種試劑盒及其製作方法。
目前臨床上鑑別糖尿病的指標主要有胰島細胞抗體(ICA)，胰島素自身抗體(IAA)，以及64KD抗體。ICA和IAA存Ⅰ型糖尿病患者血清中陽性檢出率低，發病後檢出率下降，並且ICA和IAA還存在於其他內分泌疾病；所以臨床上未能推廣應用。檢測64KD抗體在現有技術中有運用穀氨酸脫羧酶(GAD)作為抗原，因價格高昂，難以推廣到臨床使用。本發明的檢測64KD抗體的ELISA試劑盒及其製備方法是生產出一種新技術產品的新的技術方法。用本發明製備的檢測64KD抗體(65KDHSP抗體)試劑盒檢測了30例Ⅰ型糖尿病，30例Ⅱ型糖尿病，5例系統性工斑狼瘡，8例甲亢，44例健康人，64KD抗體陽性檢出率分別為83．3％，13．3％，0．00％，0．00％，2．27％；24例64KD抗體陽性的Ⅱ型糖尿病有22(91．7％)例需要胰島素治療，所以從Ⅱ型糖尿病中可識別出成人遲發性自身免疫性糖尿病。對Ⅰ型糖尿病診斷的特異性為94．6％，診斷的敏感性為83．3％，診斷指數為177．9％。
本發明的目的在於提供一種以卡介苗(BCG)65KD熱休克蛋白作為抗原，並以ELISA法檢測糖尿病患者血清中64KD抗體的試劑盒，用於臨床上鑑別診斷糖尿病型別；此試劑盒不僅能診斷Ⅰ型糖尿病，而且能從Ⅱ型糖尿病中識別成人遲發性自身免疫性糖尿病(LADA)。抗原卡介苗(BCG) 65KD熱休克蛋白製備簡單，成本較低。
本發明的試劑盒及其製備方法的技術方案如下1)製備卡介苗(BCG) 65KD熱休克蛋白BCG接種於培養基中培養10～14天，設備使用恆溫振蕩培養箱，(上海躍進醫療器械二廠)容量500ml三角燒瓶9個；在恆溫水浴箱(型號ZB11241-89)中，40～45℃水浴1～4小時；用離心機(北京醫用離心機廠產LD4-2型)收集上清液；用硫酸胺沉澱法濃縮蛋白質，濃度為1～500mg／ml；用蛋白質回收槽(北京六一儀器廠產DYY-Ⅲ43型)純化，或者用Waters層析儀(層析法)純化卡介苗(BCG)65KD熱休克蛋白；用SDS-PAGE法鑑定其分子量，用免疫動物(家兔或小白鼠)鑑定其免疫(抗原)活性；
合格後即生產出本發明所需用的卡介苗(BCG)65KD熱休克蛋白；數量為每人每月製備大約0．5克；三人合作大約每月製備3克。
2)製備酶聯反應板將卡介苗(BCG) 65KD熱休克蛋白用PH(8-10)的碳酸鹽緩衝液定量至1μg～1000μg／ml；包被酶聯反應板0．1～50μg／孔；用含1～5％BSA(小牛血清白蛋白)的磷酸鹽緩衝液封閉，封閉條件是37℃下1小時，或4℃下12小時；洗滌；洗滌液為含0．1％的吐溫-20的PH7．4，0．01mol／L磷酸鹽緩衝液洗滌3次，每次5分鐘；經自然乾燥，用聚氯乙烯塑膠袋消毒密閉封裝，在4℃下保存備用；1克卡介苗(BCG)65KD熱休克蛋白可包被10萬人份。
3)製備試劑盒已包被卡介苗(BCG)65KD熱休克蛋白的酶聯反應板，板型兩種可拆96孔或可拆48孔；HRP-羊抗人IgG(辣根過氧化物標記的羊抗人IgG)，1∶800稀釋，管裝兩種規格15μl或7．5μl；洗滌液，瓶裝30ml或15ml，20倍濃縮含0．05％的吐溫-20的PH7．4，0．01mol／L磷酸鹽緩衝液；(使用時稀釋20倍)酶標抗體稀釋液；(洗滌液加1％～2％的小牛血清白蛋白200μl)底物稀釋液；(0．1mol／L的磷酸氫二鈉10．28ml加上0．05mol／L枸櫞酸9．72ml)底物OPD；(鄰苯二胺，片狀， 3片，進口產品，Sigma公司出品)終止液2mol／L硫酸；陽性血清，50μl。
本發明用於臨床檢測64KD抗體過程1)酶聯反應板加待檢血清(1∶10)-(1∶100)100μl，37℃孵育1小時，洗板；2)加HRP標記的抗人IgG(軍事醫學科學院產品)，37℃孵育1小時，洗板；3)加底物OPD液100μl，37℃閉光顯色10～20分鐘；4)加終止液2mol／LH2SO450μl；5)492nm處比色(使用南京華東電子儀器廠產酶聯免疫檢測儀)。
本發明的好處有(1)由於採取預包被抗原板技術措施，特別適於臨床推廣使用，操作方便簡單(2)製備工藝簡單成熟，原料易得，成本較低，有特定的新技術創新內容，產品附加值高；(3)對Ⅰ型糖尿病診斷特異性達94％以上，診斷敏感性達83％以上，對Ⅱ型糖尿病可識別出成人遲發性自身免疫性糖尿病。
本發明敘述的試劑盒及製作方法在技術方案中已詳細說明，按其說明可以用本發明敘述的製作方法生產出本發明敘述的試劑盒。
權利要求
1)檢測64KD抗體的ELISA試劑盒，包括(a)酶聯反應板，(b)HRP-羊抗人IgG，(c)洗滌液，(d)酶標抗體稀釋液，(e)底物稀釋液，(f)底物0PD，(g)終止液，(h)陽性血清，其特徵是將卡介苗(BCG)65KD熱休克蛋白包被(a)酶聯反應板；(b)HRP-羊抗人IgG(辣根過氧化物標記的羊抗人IgG)，1∶800稀釋，管裝兩種規格15μl或7．5μl；(c)洗滌液，瓶裝30ml或15ml，20倍濃縮含0．05％的吐溫-20的PH74，0．01 mol／L磷酸鹽緩衝液(使用時稀釋20倍)；(d)酶標抗體稀釋液(洗滌液加1％～2％的小牛血清白蛋白200μl)；(e)底物稀釋液(0．1mol／L的磷酸氫二鈉10．28ml加上0．05mol／L枸櫞酸9．72ml)；(f)底物OPD(鄰苯二胺，片狀，3片，進口產品，Sigma公司出品)；(g)終止液2mol／l硫酸；(h)陽性血清，50μl。
2)根據權利要求1所述的檢測64KD抗體的ELISA試劑盒，其特徵是酶聯反應板上包被的卡介苗(BCG)65KD熱體克蛋白用PH(8-10)的碳酸鹽緩衝液定量至1μg～1000μg／ml，包被酶聯反應板0．1～50μg／孔，用含1～5％的小牛血清自蛋白的磷酸鹽緩衝液封閉。
3)根據權利要求1或權利要求2所述的檢測64KD抗體的ELISA試劑盒，其特徵是用磷酸緩衝液封閉的條件為37℃下1小時。
4)根據權利要求1或權利要求2所述的檢測64KD抗體的ELISA試劑盒，其特徵是用磷酸緩衝液封閉的條件為4℃下12小時。
5)一種製造權利要求1所述試劑盒的製作方法，其特徵是酶聯反應板上包被的卡介苗(BCG)65KD熱休克蛋白以如下方法製得BCG接種於培養基中10～14天，40℃～45℃條件下水浴1～4小時。
全文摘要
糖尿病鑑別試劑盒及其製作方法,試劑盒由本發明製備的卡介苗(BCG)65KD熱休克蛋白包被的酶聯反應板、HRP－羊抗人IgG、洗滌液、酶標抗體稀釋液、底物稀釋液、底物OPD、終止液以及陽性血清組成。本發明預包被抗原板用於臨床操作方便,對Ⅰ型糖尿病診斷特異性達94%以上,診斷敏感性達83%以上,對Ⅱ型糖尿病可識別出成人遲發性自身免疫性糖尿病。本發明製備容易,成本較低,附加值較高。
文檔編號G01N33/535GK1279399SQ9911308
公開日2001年1月10日 申請日期1999年7月5日 優先權日1999年7月5日
發明者楊廷彬, 王鴻 申請人:楊廷彬, 王鴻