一種豬瘟疫苗生產用/牛病毒性腹瀉病毒抗體陰性新生牛血清生產工藝的製作方法
2023-12-09 03:36:01
專利名稱：一種豬瘟疫苗生產用/牛病毒性腹瀉病毒抗體陰性新生牛血清生產工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新生牛血清生產工藝，更具體地說，涉及一種豬瘟疫苗生產用/BVDV抗體陰性新生牛血清生產工藝。
背景技術：
新生牛血清是將出生14小時以內未進食的健康小牛採集到的血液，經分離收集、過濾除菌而製成的淺黃色澄清稍粘稠的上清液，是目前生物技術領域中生產疫苗(如豬瘟疫苗)不可缺少的原材料之一。而目前豬瘟疫苗生產用BVDV抗體陰性新生牛血清生產工藝為將出生14小時以內未吃初乳的健康新生小牛體表清洗乾淨後，固定到採血臺上，經採血、分離、混合、過濾除菌等工藝。由於牛群中BVDV抗體陽性率高，造成混合血清中BVDV陰性的可能性很小，滿足不了生產高質量豬瘟疫苗的需求。
因為牛病毒性腹瀉病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus BVDV)也稱牛病毒性腹瀉—黏膜病毒(BVDV/MDV)，與豬瘟病毒(CSFV)同屬黃病毒科瘟病毒屬，親緣關係密切，在血清學上有交叉反應，新生牛血清中如含有BVDV抗體，將嚴重影響豬瘟疫苗的效價與保護率。BVDV病又呈全球性分布，在《國外獸醫學—畜禽疾病》Ames R..Vet.Med.1990，101140-1145中報導牛群中BVDV血清抗體陽性高達50％～90％。而目前包括豬瘟疫苗在內的所有生物製品製造業都渴望其所用的原材料要批量大、批間差小，因此只有將幾百頭甚至幾千頭新生牛的血清混合，才能實現這一願望，並且這也是目前所有新生牛血清生產廠家的研發方向。因為牛群中BVDV抗體陽性率高，無法實現成品新生牛血清中BVDV抗體陰性，這一現實長期困擾著豬瘟疫苗生產企業和用戶，這也是豬瘟疫苗提高質量和效益的最大障礙。
發明內容
本發明的目的是提供一種豬瘟疫苗生產用/BVDV抗體陰性新生牛血清生產工藝，能保證BVDV抗體陰性，批量大，便於溯源，提高豬瘟疫苗的質量、效價和保護率。
本發明生產工藝流程包括全封閉無菌採血、靜置凝固、低溫分離、BVDV抗體陰性原料血清篩選，大規模混合、現代膜過濾，還包括(a)將非疫區出生14h以內未吃初乳，經檢疫合格的健康小牛，建立有利於溯源母牛健康檔案，根據小牛健康狀況、出生時間進行分類編號，實行頸動脈全封閉無菌採血，靜置凝固，低溫分離收集血清，每1頭或2頭小牛的血清單獨裝入專門的血清桶，每桶取樣，分別檢測BVDV抗體；(b)樣品經γ射線或水浴滅活，用病毒中和試驗原理，用牛腎或牛睪丸原代細胞在96孔細胞培養板上進行檢測；(c)由檢測樣品、平衡鹽、10-6BVDV標準株製成的中和液中和1h，吸附2h後加維持液，在5％CO237℃中培養5天，根據細胞病變情況篩選出BVDV抗體陰性的樣品，根據其編號挑選出BVDV抗體陰性的血清；(d)將挑選出BVDV抗體陰性的血清，解凍後用現代膜過濾，加入細胞加強劑，然後用大規模混合罐混合、再進行分裝。其中所說的靜置凝固是在冰浴中靜置保存10～12h。其中所說的中和液，其比例為檢測樣品∶平衡鹽∶10-6BVDV標準株＝1∶1∶1。
本發明的優點是採用96孔細胞培養板，篩選出BVDV抗體陰性的粗製血清進行加工生產，工作效率高、結果可靠、低成本、適用於工業化生產，提高了豬瘟疫苗的質量、效價和保護率，為養豬業的迅速、健康發展提供了保障。
具體實施例方式
將非疫區出生14h以內(必須保證從出生到採血的時間不能超過14h)未吃初乳，經檢疫合格的健康小牛，建立有利於溯源母牛健康檔案，檔案內容主要包括所屬地(飼養場)、畜主、編號和近期的疫病防疫情況。根據小牛健康狀況、出生時間進行分類編號。出生2小時以內的健康小牛用綠牌(F)表示，同一天收購的分別以F1、F2、F3……表示。出生4小時以內的健康小牛用藍牌(G)表示，同一天收購的分別以G1、G2、G3……表示。出生14小時以上的健康小牛用黃牌(Y)表示，同一天收購的分別以Y1、Y2、Y3……表示。小牛精神不振、拉稀或進食的用紅牌(R)表示，同一天收購的分別以R1、R2、R3……表示，被編入R類的小牛，只能將皮進行利用，肉加工後可以作為動物飼料肉粉添加劑，血液不能利用，必須當場高壓滅菌後廢棄。
採血所有的器具處理方法如下儘量去除或減低採血過程中外源性細菌內毒素汙染，所用器具用清潔劑清泡在熱水中約10min，然後進行刷洗，用自來水衝洗5遍以上，再用蒸餾水涮洗3～4次，最後用蒸餾水涮洗1～2遍，低溫烘乾後用牛皮紙封口。如果器具為塑料橡膠製品，用較低的溫度和壓力，長時間蒸汽滅菌，如115℃(007Mpa)20min。如果器具為金屬和玻璃製品，用較高的溫度和壓力，短時間蒸汽滅菌，如126℃(0.14Mpa)30min，玻璃製品還要用乾熱滅菌即180℃維持2.5h。
做好準備工作後，將小牛用自來水清洗乾淨，然後固定在局部空氣淨化達到100級的工作檯上，將小牛編號朝接血方向以便記錄，接血人員登記小牛編號和類別，準備好離心管並編號，從採血孔中輸出採血管；小牛頸部先剪毛，75％酒精棉球做大面積消毒後，再用75％酒精棉球在切口處消毒一次，做皮膚切口，用鈍性分離找出頸總動脈，向腦端用線繩解扎，向心端用止血鉗解扎，再用75％酒精棉球對頸總動脈消毒，兩解扎間做切口，向心方向插入採血針頭解除止血鉗解扎，血液在採血管內流向潔淨室層流罩下已準備好的離心杯中，調整採血管的位置，使血液沿管壁流入，用解扎線繩的末端固定採血針(管)，接血離心的地方必須與固定小牛和採血的地方分室進行，接血所在環境必須在萬級背景下的局部百級中進行。
採得的血液在自然狀態冰浴中靜止10～12h，然後放入低溫離心機中(溫度控制在2～8℃下，3600～4000r/min)離心20～30min，離心應在萬級環境中進行，收集血清，將每1頭或每2頭小牛的血清單獨裝入專門的血清桶，每桶取樣，分別檢測BVDV抗體，樣品和桶均編一個相同的編號，桶中的血清在一15℃～-18℃中貯存，樣品送實驗室進行BVDV抗體檢測。
樣品用56℃水浴30min或60Coγ射線進行滅活，其劑量為10Kgy。用病毒中和試驗原理，在96孔細胞培養板上用牛腎或牛睪丸原代細胞進行實驗，其細胞要符合西北民族大學生物工程與技術實驗室《鑑定用原代細胞的製備、鑑定與靈敏度實驗規程》的要求。細胞長成單層後，加中和1h的中和液100μl/孔，中和液成份為檢測樣品、平衡鹽、10-6BVDV標準株，其比例為檢測樣品平衡鹽∶10-6BVDV標準株＝1∶1∶1。吸附2h後換加維持液200μl/孔，在5％CO237℃中培養5天，根據細胞病變的情況篩選出BVDV抗體陰性的樣品，根據其編號挑選出BVDV抗體陰性的血清。將BVDV抗體陰性血清解凍後用現代膜過濾，加入細胞加強劑，其有效成分在血清中最終濃度0.12mmol/L，然後用15轉/h的轉速在大規模混合罐中混合併分裝。
終產品按上述方法經BVDV抗體檢驗結果為陰性的，即為BVDV抗體陰性新生牛血清，其它指標檢測執行《中國生物製品主要原輔材料質控標準》(2000年版)。
在本工藝中生產BVDV抗體陰性血清時，每1～2頭的血清單獨包裝，並挑選BVDV抗體陰性的血清專門生產，在生產過程中不存在BVDV抗體汙染環節，能保證終產品中BVDV抗體陰性。按此法生產的2批產品共2500升，送中國獸醫診斷中心，用進口的檢測試劑盒檢測，結果均為陰性，得到的檢測數據特別理想。
權利要求
1.一種豬瘟疫苗生產用/BVDV抗體陰性新生牛血清生產工藝，其工藝流程包括全封閉無菌採血、靜置凝固、低溫分離、BVDV抗體陰性原料血清篩選、大規模混合、現代膜過濾，其特徵在於(a)將非疫區出生14h以內未吃初乳，經檢疫合格的健康小牛，建立有利於溯源母牛健康檔案，根據小牛健康狀況、出生時間進行分類編號，實行頸動脈全封閉無菌採血，靜置凝固，低溫分離收集血清，每1頭或2頭小牛的血清單獨裝入專門的血清桶，每桶取樣，分別檢測BVDV抗體；(b)樣品經γ射線或水浴滅活，用病毒中和試驗原理，用牛腎或牛睪丸原代細胞在96孔細胞培養板上進行檢測；(c)由檢測樣品、平衡鹽、10-6BVDV標準株製成的中和液中和1h，吸附2h後加維持液，在5％CO237℃中培養5天，根據細胞病變情況篩選出BVDV抗體陰性的樣品，根據其編號挑選出BVDV抗體陰性的血清；(d)將挑選出BVDV抗體陰性的血清，解凍後用現代膜過濾，加入細胞加強劑，然後用大規模混合罐混合、再進行分裝。
2.根據權利要求1所述的一種豬瘟疫苗生產用/BVDV抗體陰性新生牛血清生產工藝，其中所說的靜置凝固是在冰浴中靜置保存10～12h。
3.根據權利要求1所述的一種豬瘟疫苗生產用/BVDV抗體陰性新生牛血清生產工藝，其中所說的中和液其比例為檢測樣品∶平衡鹽∶10-6BVDV標準株＝1∶1∶1。
全文摘要
本發明涉及一種新生牛血清生產工藝，更具體地說，涉及一種豬瘟疫苗生產用/BVDV抗體陰性新生牛血清生產工藝。本發明生產工藝，其工藝流程包括全封閉無菌採血、靜置凝固、低溫分離、BVDV抗體陰性原料血清篩選、大規模混合、現代膜過濾。本發明的優點是採用96孔細胞培養板，篩選出BVDV抗體陰性的粗製血清進行加工生產，工作效率高、結果可靠、低成本、適用於工業化生產，提高了豬瘟疫苗的質量、效價和保護率，為養豬業的迅速、健康發展提供了保障。
文檔編號A61K39/187GK1748712SQ20051004271
公開日2006年3月22日 申請日期2005年5月19日 優先權日2005年5月19日
發明者馬忠仁, 侯蘭新, 喬自林, 馮玉萍, 馮若飛, 李明生, 王茂林 申請人:蘭州民科生物技術中心