三聚氰胺與載體蛋白偶聯產物和三聚氰胺抗體的製備方法及用途的製作方法

2023-11-06 19:40:42 1

專利名稱：三聚氰胺與載體蛋白偶聯產物和三聚氰胺抗體的製備方法及用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於免疫化學生物技術領域，尤其是涉及一種三聚氰胺與載體蛋白 偶聯產物和三聚氰胺抗體的製備方法及用途。
背景技術：
三聚氰胺(mdamine)簡稱三胺，學名三氨三嗪，別名蜜胺、氰尿醯胺、三聚 醯胺，分子式C3N6H6、 C3N3(NH2)3 。分子量126.12，是一種重要的氮雜 環有機化工原料。三聚氰胺顯弱鹼性，能夠與各種酸反應生成三聚氰胺鹽。在 強酸或強鹼液中，三聚氰胺發生水解，胺基逐步被羥基取代，生成三聚氰酸二 醯胺、三聚氰酸一醯胺和三聚氰酸。三聚氰胺與醛類反應生成加成化合物。三 聚氰胺與醛反應製成樹脂，三聚氰胺樹脂是一種多種用途的材料，防火耐熱且 有很高的穩定性，用於生產塑料、廚房用具、防火纖維、商業濾膜、膠水和阻 燃劑，部分亞洲國家，也被用來製造化肥。三聚氰胺不是食品原料，也不是食 品添加劑，三聚氰胺作為一種結晶粉末，與奶粉- -樣同為白色，也沒什麼味道。 三聚氰胺之所以被廣泛的摻雜進入奶粉中，是因為目前凱氏(Kjeldahl)定氮法 是檢測奶粉中蛋白質含量的惟一方法。所謂凱氏定氮法，就是指通過測量氮元 素的含量，並利用氮元素與蛋白質換算係數，來計算奶粉中所含蛋白質總量的 方法。在分析過程中，所有含氮物質均被統計成蛋白質總量；也就是說，這一 方法不能有效地辨別食品中的其他含氮物質。三聚氰胺是一種合成機含氮雜環 化合物，含氮量很高(66%)，加之其生產工藝簡單、成本很低， 一旦被攙雜 進奶粉中，在採用凱氏定氮法測定粗蛋白時，可提高表觀粗蛋白含量。"三鹿牌 嬰幼兒奶粉事件"的發生，是不法分子在原料乳中摻水，以增加重量牟取非法利 益。奶摻水後會造成原料乳中蛋白質含量下降，為掩蓋非法行為，虛增牛奶中 蛋白質檢出量，不法分子人為在原料乳中加入三聚氰胺。臨床調查發現，三聚 氰胺對人體的影響是有可能在泌尿系統形成泥沙樣結晶或結石。如果攝入的三 聚氰胺量大、時間長，可能會在泌尿系統如膀胱和腎臟形成泥沙樣結晶或結石， 會造成生殖、泌尿系統的損害，並可進一步誘發膀胱癌。
三聚氰胺事件變成社會熱點話題是在07年3月份，美國大量召回被三聚氰 胺汙染的寵物飼料，起因於寵物飼料致死貓狗的事件。據不完全統計，北美地 區僅美國因食用有毒飼料而死亡的寵物就有上萬隻，相關投訴不計其數，美國食 品藥品管理局調査顯示，在回收的寵物食品、死亡動物的尿液結晶和腎臟細胞
4中都發現有三聚氰胺，研究人員還發現，回收寵物食品所用的小麥谷蛋白添加物 中有較高濃度的三聚氰胺存在。某些不法廠商添加三聚氰胺主要是為了增加產
品的表觀蛋白質含量，三聚氰胺被廣泛的添加到澱粉、谷朊粉、蛋白粉中。2008 年9月確定，石家莊的三鹿集團股份有限公司生產摻入三聚氰胺的"三鹿"嬰幼兒 配方奶粉導致嬰幼兒泌尿系統結石。截至9月17日已有三例腎結石患兒死亡病 例，中國各地共報告臨床診斷患兒6244例。國內知名奶粉生產企業-伊利、蒙牛 和光明等乳業巨頭相繼道歉，承諾召回其"問題奶粉"並賠償損失。
2008年10月7日，國家質量監督檢驗檢疫總局、國家標準化管理委員會批 準發布了《原料乳與乳製品中三聚氰胺檢測方法》(GB/T 22388-2008)國家標 準，規定了三聚氰胺的檢測方法的檢測定量限。目前我國對三聚氰胺檢測規定 了三種方法，分別是高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜一質譜法(GC-MS) 和液相色譜一質譜/質譜法(LC-MS/MS)，其定量限(精確度)分別為2毫克 /千克、0.05毫克/千克和0.01毫克/千克。只要檢驗樣品中三聚氰胺真實含 量在檢測方法定量限以上，檢測方法就能準確檢出。標準適用於原料乳、乳制 品以及含乳製品中三聚氰胺的定量測定。衛生部等五部門聯合發布公告，確定 了乳與乳製品中三聚氰胺臨時管理限量值，即嬰幼兒配方乳粉中三聚氰胺的限 量值為l毫克/千克，液態奶(包括原料乳)、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰 胺的限量值為2.5毫克/千克。
最近，澳大利亞、紐西蘭、歐盟、加拿大、香港等國家和地區對食品中三 聚氰胺採取了相應的控制措施。如澳大利亞和紐西蘭規定，嬰幼兒配方乳粉中 三聚氰胺的最高含量不超過1毫克/千克；乳製品和含有乳成分的食品中三聚 氰胺的最高含量不超過2.5毫克/千克。歐盟規定從中國進口的乳含量超過1 5 %的所有食品(如巧克力、糖果等)中三聚氰胺的最高含量為2.5毫克/千克。 加拿大的規定是嬰兒配方乳粉和其他作為唯一營養來源的食品，包括膳食替代 食品三聚氰胺最高含量不超過1毫克/千克；其他乳和含有乳成分的食品三聚 氰胺最高含量不超過2.5毫克/千克。香港規定了奶類以及供36個月以下嬰幼 兒和孕婦及哺乳婦女食用的食物中三聚氰胺最高含量為1毫克/千克，其他食 物中三聚氰胺的最高含量為2.5毫克/千克。
目前三聚氰胺殘留的檢測主要有儀器分析和免疫分析兩種方法,其中儀器分 析法主要用高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜(GC)，由於其存在儀器昂貴、 操作煩瑣、費時費力、費用高、不能大規模現場檢測等問題，也要求技術人員 具有一定的操作和分析技能，因而不能很好推廣應用。酶聯免疫吸附分析(ELISA)具有簡便、快捷、能大規模檢測、靈敏和成本低廉及現場檢測的優點，
尤其適合在生產和流通過程中對食品及水產品中三聚氰胺等抗生素殘留進行檢 測。膠體金免疫層析試紙條應用廣泛，已有多種可檢測人、動物、植物病原、
癌症抗原、激素、藥物與農藥殘留的試紙條，該方法具有如下優點操作簡單、
方便、快速，幾乎人人都會使用；不需任何設備；結果準確可靠、特異性強、 靈敏度高；低成本高效益；保存方便等。因此免疫層析試紙條目前已成為多種 物質免疫學檢測的發展方向之一。本專利應用雜交瘤技術建立能穩定分泌抗三 聚氰胺單克隆抗體的雜交瘤細胞株，並製備具有高親和力、高特異性、高靈敏度 的三聚氰胺單抗，以該單抗為核心開發具有自主智慧財產權、廉價的三聚氰胺殘 留檢測試劑盒及膠體金免疫層析試紙條，為我國動物源食品中三聚氰胺殘留的 快速檢測服務。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種三聚氰胺與載體蛋白偶聯 產物和三聚氰胺抗體的製備方法及用途。
三聚氰胺與載體蛋白偶聯產物的製備方法包括如下步驟
a) 三聚氰胺3-1000mg溶於l-10mL體積比為l:l:2的二甲基甲醯胺/l,4-二氧六 環/0.1MpH7.2 PBS溶液中；
b) 2-卯0mg載體蛋白溶於l-10mL0.1MpH7.2PBS中；c) 將上述三聚氰胺溶液緩慢加入載體蛋白溶液中，再逐滴加入10-1000uL 25%戊二醛溶液，加畢在4-35。C攪拌反應l-36h,合成三聚氰胺-載體蛋白偶聯產 物；
d) 三聚氰胺-載體蛋白偶聯產物放入透析袋中，用0.01MpH7.2的磷酸鹽緩 衝液在4"C透析l-3天；
e) 透析後的三聚氰胺-載體蛋白偶聯產物進行紫外掃描，分析鑑定偶聯產物 及濃度測定，分裝後於-2(TC冰箱保存備用。
所述的載體蛋白為匙孔血藍蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛丙種 球蛋白、酶或卵清蛋白。
三聚氰胺-載體蛋白偶聯產物可免疫動物製備抗體及作為人工抗原應用於食 品中三聚氰胺檢測的免疫學方法。
抗三聚氰胺單克隆抗體的製備方法包括如下步驟
1) 三聚氰胺-載體蛋白偶聯產物作為免疫原免疫BALB/C小鼠；
2) 取免疫鼠的脾細胞與SP2/0鼠骨髓瘤細胞在50%聚乙二醇融合劑下融合，HAT篩選培養基篩選雜交瘤細胞，用間接ELISA方法檢測分泌抗三聚氰胺抗體 的細胞；
3) 採用有限稀釋法進行細胞克隆，經間接ELISA篩選陽性克隆，獲得能穩
定傳代並分泌抗三聚氰胺特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株；雜交瘤細胞注射 入BALB/C小鼠腹腔製備單抗腹水；
4) 釆用直接競爭ELISA方法測定抗三聚氰胺單抗與三聚氰酸、三嗪、三嗪 二銨的交叉反應率在優化的條件下，將三聚氰胺標準品、三聚氰酸、三嗪、 三嗪二銨作系列稀釋，分別與單抗進行直接競爭ELISA,製作標準曲線，並在 曲線上找出三聚氰胺50%抑制率的濃度，以及上述其它幾種物質50%抑制率的 濃度，根據交叉反應率01% =三聚氰胺ICW其它物質IC5QxlOO計算出各種物質 的交叉反應率，選擇與三聚氰酸、三嗪二銨、三嗪的交叉反應率在3%以上，且 檢測靈敏度達到1.1 ng/mL的單抗。
所述的免疫原是三聚氰胺-載體蛋白偶聯產物。免疫原的載體蛋白為匙孔血 藍蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛丙種球蛋白、酶或卵清蛋白。
所述的免疫方法為..用三聚氰胺-載體蛋白偶聯產物免疫四周齡體重18-20g BALB/C雌性小鼠1 mg/ml抗原0.5-0.7 ml與等體積福氏完全佐劑混合，充 分乳化後，經背腹部皮下多點注射0.2-0.3 m/只，間隔3-4周，取與一免等量抗 原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化後，第二次腹腔注射0.2-0.3 ml/只，共進 行4-6次加強免疫，末免用不加佐劑的加倍劑量抗原進行腹腔注射，3天後取脾 細胞進行融合。
所述的單抗腹水製備方法為取6-10周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射 0.3-0.5 ml降植烷，7-10天後腹腔注入5-1(^105個雜交瘤細胞，注射後7-10天 可見小鼠腹部明顯膨大，採取腹水，3000-5000 rpm離心3-5 min，收集上清液， 即為單克隆抗體腹水。
三聚氰胺單克隆抗體用於檢測食品中三聚氰胺殘留的免疫學方法。所述的 用於檢測食品中三聚氰胺殘留的免疫學方法為競爭ELISA或免疫檢測試紙條。
一種製備抗三聚氰胺多抗的製備方法包括如下步驟
1) 初次免疫採用0.1-5mg偶聯產物抗原與等體積弗氏完全佐劑充分乳化後 皮下或皮內或肌肉小量、多點注射免疫；
2) 每間隙2-4周，用弗氏不完全佐劑與偶聯產物抗原充分乳化後皮下或皮 內或肌肉小量、多點注射，進行2-5加強免疫；
3) 末免不加佐劑，加倍劑量肌肉注射免疫，末免後7-10天後採血，離心分離血清；
4)用蛋白A/G親和柱純化IgG,純化的IgG凍乾冰箱保存。 本發明的優點是1)本發明提供一種能製備檢測食品中三聚氰胺殘留的抗
體的三聚氰胺免疫原偶聯方法，其操作簡單方便；2)提供了一種能獲得檢測三
聚氰胺殘留的抗體的製備方法，其方法簡單有效；3)利用本發明所製備的抗體，
可有效地用於食品中三聚氰胺類物質殘留的檢測。


圖1偶聯產物的紫外掃描結果。MEL為三聚氰胺水溶液；BSA為牛血清白 蛋白溶液；MEL-BSA為三聚氰胺與BSA偶聯產物。
具體實施例方式
本發明提供了一種三聚氰胺與載體蛋白偶聯產物和三聚氰胺抗體的製備方 法及用途。用製備的免疫原製備三聚氰胺的特異性強、靈敏度高、穩定性好、 能大量生產的單克隆抗體和多抗，並用這些抗體建立了檢測食品中三聚氰胺殘 留具有高度特異性、靈敏性和正確性的快速診斷方法一競爭ELISA及免疫層析 試紙條，可有效地用於食品中三聚氰胺殘留的檢測，為我國的食品安全服務。
1. 一種三聚氰胺與載體蛋白偶聯產物的製備方法包括如下步驟
a) 三聚氰胺3mg溶於lmL體積比為l:l:2的二甲基甲醯胺/l，4-二氧六環/0.1M pH7.2 PBS溶液中；
b) 2mg載體蛋白即牛血清白蛋白(BSA)溶於lmL 0.1MpH7.2 PBS中；
c) 將上述三聚氰胺溶液緩慢加入BSA溶液中，再逐滴加入10uL25。/。戊二醛 溶液，加畢在4-35。C攪拌反應l-36h，合成三聚氰胺-BSA偶聯產物；
d) 三聚氰胺-BSA偶聯產物放入透析袋中，用0.01MpH7.2的磷酸鹽緩衝液 在4。C透析l-3天；
e) 透析後的三聚氰胺-BSA偶聯產物、三聚氰胺、BSA溶液進行紫外掃描， 分析鑑定偶聯產物及濃度測定，分析發現偶聯產物的紫外掃描圖形與BSA及三 聚氰胺的掃描圖形明顯不同(如圖l)，說明三聚氰胺已與BSA偶聯成功，偶聯 產物分裝後於-2(TC冰箱保存，用於免疫動物製備抗體及作為三聚氰胺人工抗原 應用於食品中三聚氰胺檢測的免疫學方法。
2. —種三聚氰胺與載體蛋白偶聯產物的製備方法包括如下步驟
a) 三聚氰胺1000mg溶於10mL體積比為l:l:2的二甲基甲醯胺/l,4-二氧六環 /0.1MpH7.2PBS溶液中；
b) 900mg載體蛋白即牛血清白蛋白(BSA)溶於10mL 0.1MpH7.2 PBS中；c) 將上述三聚氰胺溶液緩慢加入BSA溶液中，再逐滴加入1000uL25。/。戊二 醛溶液，加畢在4-35。C攪拌反應l-36h，合成三聚氰胺-BSA偶聯產物；
d) 三聚氰胺-BSA偶聯產物放入透析袋中，用0.01MpH7.2的磷酸鹽緩衝液 在4'C透析l-3天；
e) 透析後的三聚氰胺-BSA偶聯產物、三聚氰胺、BSA溶液進行紫外掃描， 分析鑑定偶聯產物及濃度測定，分析發現偶聯產物的紫外掃描圖形與BSA及三 聚氰胺的掃描圖形明顯不同(如圖O ，說明三聚氰胺已與BSA偶聯成功，偶聯 產物分裝後於-2(TC冰箱保存，用於免疫動物製備抗體及作為三聚氰胺人工抗原 應用於食品中三聚氰胺檢測的免疫學方法。 3.三聚氰胺單克隆抗體的製備方法
1) 免疫動物
用三聚氰胺與BSA偶聯物免疫四周齡體重18-20 g BALB/C雌性小鼠1 mg/ml提取三聚氰胺與BSA偶聯物0.5-0.7 ml與等體積福氏完全佐劑混合，充 分乳化後；經背腹部皮下多點注射0.2-0.3ml/只，間隔3-4周，取與一免等量抗 原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化後，第二次腹腔注射0.2-0.3ml/只，共進 行5次加強免疫，末免用不加佐劑的加倍劑量抗原進行腹腔注射，3天後取脾細 胞進行融合。
2) 細胞融合
取上述免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)按5-10: 1的比例，在 無血清的RPMI-1640 (Gibco)培養基中混勻，1500 rpm離心5 min，去除培養 基，用5(P/。PEG(聚乙二醇，Sigma)作為融合劑，在37nC下水浴下加入0.5-0.7ml， 使其融合2 min，用無血清的RPMI-1640培養基終止融合後1500 rpm離心5 min， 沉澱用HAT篩選培養基(Sigma)懸浮，分裝到96孔含有飼養細胞的細胞板中， 37°C， 5 % C02的細胞培養器皿中培養。
3) 雜交瘤細胞、陽性孔的篩選及其克隆
細胞在培養器皿中培養5天後，用HAT篩選培養基換液一次，第10天用 HT培養基換液，等到融合細胞覆蓋孔底5%-50%時，用三聚氰胺偶聯卵清蛋白 (Mel-OVA)作為包被抗原進行間接ELISA方法篩選陽性孔，共獲200多個對 三聚氰胺有反應的陽性孔，陽性率為5%。選擇180個呈強陽性反應的細胞孔， 進行有限稀釋法克隆，獲得2H1株能分泌抗三聚氰胺的特異性抗體的雜交瘤細 胞株。經6個月以上體外傳代和多次凍存復甦後，細胞株均能良好生長，並穩 定分泌抗體。經擴大培養後，用於腹水製備和液氮保存。4) 單克隆抗體腹水製備及純化
取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5 ml降植烷(Sigma)， 7-10 天后腹腔注入5-10><105個雜交瘤細胞，注射後7-10天可見小鼠腹部明顯膨大， 採取腹水，3000-5000 rpm離心3-5 min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。取 1倍體積腹水加2倍體積0.06 M pH 4.8醋酸緩衝液稀釋，加辛酸(30 ul/ml腹水)， 室溫下邊加邊攪拌，4。C澄清小時，12000 rpm離心20 min，收集上清，再用 50%飽和硫酸銨沉澱免疫球蛋白，4'C放置2小時，3000-5000 rpm離心20 min， 沉澱用2倍體積的PBS溶液溶解，在4"C流動透析24小時後即獲純化的腹水抗 體，-7CTC保存。
5) 單克隆抗體的亞類鑑定和腹水效價測定
將純化的單抗腹水與Sigma公司的標準抗BALB/C小鼠IgG、 IgGi、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3、 IgM抗體，作雙向瓊脂擴散試驗，結果為，2m的抗體類型及亞 類為IgGp單克隆抗體的輕鏈為K鏈。用常規間接ELISA方法檢測單抗腹水效 價，結果為上述腹水效價均在10—6以上。 4.檢測三聚氰胺殘留的直接競爭ELISA方法的建立
1) 辣根過氧化物酶(HRP)-三聚氰胺結合物的製備
a) 三聚氰胺10mg溶於lmL體積比為l:l:2的二甲基甲醯胺/l，4-二氧六環/0.1M 卩117.2 88溶液中；
b) 20mgHRP溶於lmL0.1MpH7.2PBS中；
c) 將上述三聚氰胺溶液緩慢加入HRP溶液中，再逐滴加入10uL 25%戊二醛溶液， 加畢在4-35°C攪拌反應1-36h，合成三聚氰胺-HRP偶聯產物；
d) 三聚氰胺-HRP偶聯產物放入透析袋中，用0.01]\4 117.2的磷酸鹽緩衝液在4匸 透析l-3天；
e) 透析後的偶聯產物、三聚氰胺、HRP溶液進行紫外掃描，鑑定偶聯產物，分 析發現偶聯產物的紫外掃描圖形與HRP及三聚氰胺的掃描圖形明顯不同，說明 三聚氰胺已與HRP (酶標三聚氰胺半抗原)偶聯成功，偶聯產物分裝後於-20'C 冰箱保存，用於檢測三聚氰胺的直接競爭ELISA方法。
2) 直接競爭ELISA方法條件優化
用方陣試驗法對抗體和酶標三聚氰胺半抗原的進行一系列濃度的稀釋，確 定直接競爭ELISA法抗體和酶標半抗原的最適工作濃度。OD45。值約為1.0，抗 體抗原用量較少的濃度組合，即為抗體-抗原的最佳工作濃度。首先，將單抗用 PBS (0.01 M,pH7.4)稀釋成一系列濃度，分別依次加入96孔酶標板
10(lOOpL/well), 37 。C下溫育2 h, PBST洗滌3次；用含2.0%脫脂奶的PBS封 閉，每孔300 pL， 37 'C溫育0.5 h，後用PBST洗滌3次；加入預先以PBS稀釋 成不同濃度的酶標半抗原，在微量震蕩器上混勻，37 。C下溫育1 h， PBST洗滌3 次；加入底物溶液(函nL/we11)， 37 。C溫育15min，加入終止液(50 ^L/wel1)，
用酶標儀測定各孔的OD450值。
3) 抗體親和性及檢測靈敏度
在優化的條件下，在預先包被好單抗的酶標板上，加入系列濃度的三聚氰
胺標樣，每濃度3孔重複，設不加三聚氰胺對照和溶劑空白對照，50pL/wel1，再
加入0.89呢/ml酶標半抗原50pL，震蕩l min後37 。C下溫育l h， PBST洗滌4次；
加入TMB底物溶液(100 (xL/wel1)， 37 'C溫育15 min，加入2M硫酸終止液(50
(IL/Wdl)，用酶標儀測定各孔的OD45。值。以抑制率與三聚氰胺濃度的半對數繪
制標準曲線。抑制率I計算公式如下
(ODmax-ODmin)國(ODx-ODmin) I%=-(ODmax-OD—-禱
式中ODn^-不加三聚氰胺時的吸光值；ODx-三聚氰胺濃度為X時的吸光值； ODi空白對照孔的吸光值。
以抑制率達到50。/。的三聚氰胺濃度(IC5o)來表示抗體對三聚氰胺的親和性， 以ICn)作為ELISA方法的檢測靈敏度。在優化的ELISA分析條件下，對三聚氰 胺建立標準曲線，以考察其在最優化的反應體系中的檢測靈敏度。根據競爭 ELISA反應標準曲線計算得2H1單抗的IC5。為20.5 ng/ml， IC10為1.1 ng/ml。
4) 三聚氰胺單抗的特異性
採用直接競爭ELISA方法測定抗三聚氰胺單抗與三聚氰酸、三嗪、三嗪二 銨的交叉反應率。在優化的條件下，將三聚氰胺標準品、三聚氰酸、三嗪、三 嗪二銨作系列稀釋，分別與2H1單抗進行直接競爭EUSA，製作標準曲線，並 在曲線上找出抑制率50%的濃度，以及上述幾種物質50%抑制率的濃度，然後 計算出各類抗生素的交叉反應率。交叉反應率CR計算方法為CR。/。^三聚氰胺 ICW其它物質ICsQxl00。結果表明，2H1單抗與三聚氰酸、三嗪二銨、三嗪的交 叉反應率分別為71%、 310%和5%。說明該單抗可以用於食品中三聚氰胺類物 質的檢測
5.三聚氰胺多抗的製備
用三聚氰胺與載體蛋白偶聯產物免疫鼠、兔子、羊、驢、牛、禽等動物制 備多抗。初次免疫採用偶聯產物人工抗原(0.1-5mg)與等體積弗氏完全佐劑(complete freund，sadjvant,CFA)充分乳化，然後皮下或皮內或肌肉小量、多點 注射；間隙2-4周後，再用弗氏不完全佐劑(incomplete freund，s adjvant， IFA)
與抗原充分乳化，然後皮下或皮內或肌肉小量、多點注射進行加強免疫；間隙
2-4周，進行2-5加強免疫；末免不加佐劑，直接肌肉注射，末免後7-10天後採
血。每次免疫後4-8採少量血，進行ELISA效價的測定，效價滿意後大量採血，
離心分離血清。用蛋白A/G親和柱純化IgG,純化的IgG用於食品中三聚氰胺檢
測的免疫學方法。
6.免疫層析試紙條的製備
膠體金的製備及單抗的金標記
膠體金顆粒製備在100ml去離子水中加入l。/。檸檬酸三鈉lml，煮沸後迅 速加入l。/。氯金酸lml，繼續煮沸15min，冷卻後，4"C下保存備用。通常情況下， 製備好的膠體金顆粒的大小平均為30 nm。 單抗的金標記
取已製備好的膠體金溶液100ml，用O.l mol/L碳酸鉀溶液調pH到8.0。邊攪 拌邊加入單抗2 mg，攪拌15 min，再逐滴加入2.5 ml 25 mg/ml聚乙二醇20000(PEG 20000)，攪拌20min。 20 000 r/min離心20 min，棄上清液，力口入IO ml pH 7.4 PBS 緩衝液(含0.4mg/mlPEG)清洗2次。將沉澱用5ml含2。/。BSA的PBS緩衝液 (pH7.4)溶解，用0.22pm無菌過濾器過濾後，4"C保存備用。
免疫層析試紙條的組裝
用點膜機把適當濃度的三聚氰胺-BSA抗原及羊抗鼠IgG噴在NC膜上，分 別作為檢測線(T)和控制線(C)，在37"C烘箱乾燥8h。以同樣方法，將製備 好的金標記三聚氰胺單抗包被在膠體金結合墊上。將樣品墊、膠體金結合墊、 硝酸纖維素膜及吸水墊依次粘貼在底板上，從而組成一個連續的微濾體系。將 貼好的板切割成4mm寬的條，裝入模板中製成檢測試劑板，避光、密閉、常溫 保存備用。
用滴管吸取待檢樣品溶液，滴加3滴(約100ul)於上述試劑板的加樣孔中， 加樣後開始計時；結果應在3-5分鐘內讀取，其他時間判讀無效；根據觀察區的 T、 C線的顏色比對來確定結果，T線顯色比C線深或者相等時，結果判定為陰性。 當T線顏色顯色比C線淺時，檢測結果為陽性。
將三聚氰胺標準品配置成不同濃度的分析試樣溶液0、 1、 3、 5、 7、 10、 15、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100 ng/ml，用檢測試紙條進行測定， 每個試樣做3個重複，5min後觀察結果，檢測結果表明，當樣品中三聚氰胺殘留藥物的含量達到或超過lng/ml，由於大多數單克隆抗體被樣品中的三聚氰胺殘 留競爭結合，T線的包被抗原結合到的三聚氰胺單克隆抗體就很少或者沒有，T 線的顯色明顯比C線淺或不顯色，結果為陽性；當樣品中三聚氰胺殘留的含量低 於3ng/ml時，T線呈色與C線一致或比C線淺，結果為陰性；無論是陽性還是陰 性結果，膠體金-三聚氰胺單抗結合物總能與C線處的羊抗鼠IgG結合，形成一條 紫紅色的條帶。如果，C線不顯色，無論是T線有無，這時的結果均無效。 檢測試劑板的穩定性試驗
用同一批次不同檢測試劑板檢測同一樣品，及用不同批次檢測試劑板測定 同一樣品，其質控線、檢測線的顯色時間及顏色深淺和最終結果判讀基本相同。 將相同批次的試劑板置於37'C、室溫、4'C密閉保存3個月，每2周各檢測陽性和 陰性奶樣各20份，結果顯示隨著時間和溫度的變化，檢測結果未發生大的變化。 根據37'C下一天相當於1周估算，本試劑板可以在室溫下保存12個月。
權利要求
1. 一種三聚氰胺與載體蛋白偶聯產物的製備方法，其特徵在於包括如下步驟a)三聚氰胺3-1000mg溶於1-10mL體積比為1∶1∶2的二甲基甲醯胺/1，4-二氧六環/0.1M pH7.2PBS溶液中；b)2-900mg載體蛋白溶於1-10mL0.1M pH7.2PBS中；c)將上述三聚氰胺溶液緩慢加入載體蛋白溶液中，再逐滴加入10-1000uL25％戊二醛溶液，加畢在4-35℃攪拌反應1-36h，合成三聚氰胺-載體蛋白偶聯產物；d)三聚氰胺-載體蛋白偶聯產物放入透析袋中，用0.01M pH7.2的磷酸鹽緩衝液在4℃透析1-3天；e)透析後的三聚氰胺-載體蛋白偶聯產物進行紫外掃描，分析鑑定偶聯產物及濃度測定，分裝後於-20℃冰箱保存備用。
2. 根據權利要求l所述一種三聚氰胺與載體蛋白偶聯產物的製備方法，其特 徵在於所述的載體蛋白為匙孔血藍蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛丙 種球蛋白、酶或卵清蛋白。
3. —種如權利要求l所述方法製備的三聚氰胺與載體蛋白偶聯產物的用途， 其特徵在於所述的三聚氰胺-載體蛋白偶聯產物可免疫動物製備抗體及作為人工 抗原應用於食品中三聚氰胺檢測的免疫學方法。
4. 一種抗三聚氰胺單克隆抗體的製備方法，其特徵在於包括如下步驟1) 三聚氰胺-載體蛋白偶聯產物作為免疫原免疫BALB/C小鼠；2) 取免疫鼠的脾細胞與SP2/0鼠骨髓瘤細胞在50。/。聚乙二醇融合劑下融合， HAT篩選培養基篩選雜交瘤細胞，用間接ELISA方法檢測分泌抗三聚氰胺抗體 的細胞；3) 採用有限稀釋法進行細胞克隆，經間接ELISA篩選陽性克隆，獲得能穩 定傳代並分泌抗三聚氰胺特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株，雜交瘤細胞注射 入BALB/C小鼠腹腔製備單抗腹水；4) 採用直接競爭ELISA方法測定抗三聚氰胺單抗與三聚氰酸、三嗪、三嗪 二銨的交叉反應率在優化的條件下，將三聚氰胺標準品、三聚氰酸、三嗪、 三嗪二銨作系列稀釋，分別與單抗進行直接競爭ELISA，製作標準曲線，並在 曲線上找出三聚氰胺50%抑制率的濃度，以及上述其它幾種物質50%抑制率的 濃度，根據交叉反應率CR。/。-三聚氰胺化5/其它抗生素ICsoxlOO計算出各種物質的交叉反應率，選擇與三聚氰酸、三嗪二銨、三嗪的交叉反應率在3%以上， 且檢測靈敏度達到1.1 ng/mL的單抗。
5. 根據權利要求4所述的一種抗三聚氰胺單克隆抗體的製備方法，其特徵在 於所述的免疫原是根據權利要求1所述方法偶聯的三聚氰胺-載體蛋白偶聯產 物。
6. 根據權利要求4所述的一種抗三聚氰胺單克隆抗體的製備方法，其特徵在 於所述的免疫原的載體蛋白為匙孔血藍蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、 牛丙種球蛋白、酶或卵清蛋白。
7. 根據權利要求4所述的一種抗三聚氰胺單克隆抗體的製備方法，其特徵在 於所述的免疫方法為用三聚氰胺-載體蛋白偶聯產物免疫四周齡體重18-20g BALB/C雌性小鼠lmg/ml抗原0.5-0.7ml與等體積福氏完全佐劑混合，充分 乳化後，經背腹部皮下多點注射0.2-0.3 m/只，間隔3-4周，取與一免等量抗原 和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化後，第二次腹腔注射0.2-0.3 ml/只，共進行 4-6次加強免疫，末免用不加佐劑的加倍劑量抗原進行腹腔注射，3天後取脾細 胞進行融合。
8. 根據權利要求4所述的一種抗三聚氰胺單克隆抗體的製備方法，其特徵在 於所述的單抗腹水製備方法為取6-10周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5 ml降植垸，7-10天後腹腔注入5-1(^105個雜交瘤細胞，注射後7-10天可見小鼠 腹部明顯膨大，採取腹水，3000-5000 rpm離心3-5 min，收集上清液，即為單克 隆抗體腹水。
9. 一種如權利要求4方法製備的三聚氰胺單克隆抗體的用途，其特徵在於， 三聚氰胺單克隆抗體用於檢測食品中三聚氰胺殘留的免疫學方法，所述的用於 檢測食品中三聚氰胺殘留的免疫學方法為競爭ELISA或免疫檢測試紙條。
10. —種用權利要求1所述方法製備的三聚氰胺與載體蛋白偶聯產物免疫 鼠、兔子、羊、驢、牛或禽製備抗三聚氰胺多抗的製備方法，其特徵在於包括 如下步驟1) 初次免疫採用0.1-5mg偶聯產物抗原與等體積弗氏完全佐劑充分乳化後 皮下或皮內或肌肉小量、多點注射免疫；2) 每間隙2-4周，用弗氏不完全佐劑與偶聯產物抗原充分乳化後皮下或皮 內或肌肉小量、多點注射，進行2-5加強免疫；3) 末免不加佐劑，加倍劑量肌肉注射免疫，末免後7-10天後採血，離心分 離血清；4) 用蛋白A/G親和柱純化IgG,純化的IgG凍乾冰箱保存。
全文摘要
本發明公開了一種三聚氰胺與載體蛋白偶聯產物和三聚氰胺抗體的製備方法及用途。載體蛋白與三聚氰胺偶聯產物作為人工抗原應用於三聚氰胺檢測的免疫學方法；偶聯產物免疫動物，製備用於三聚氰胺檢測的抗體；偶聯產物免疫的BALB/C小鼠脾細胞與SP2/0鼠骨髓瘤細胞融合，經陽性雜交瘤細胞篩選、細胞克隆獲得能穩定傳代並分泌抗三聚氰胺特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞，並製備腹水單抗。利用製備的單抗建立了對三聚氰胺具有高度特異性、靈敏性和精確性的直接競爭ELISA方法及免疫膠體金試紙條。本發明提供的三聚氰胺與載體蛋白的偶聯及三聚氰胺抗體的製備方法，為快速檢測食品中三聚氰胺類物質殘留提供服務。
文檔編號C07K16/44GK101429243SQ200810162590
公開日2009年5月13日 申請日期2008年12月4日 優先權日2008年12月4日
發明者吳建祥, 張少恩 申請人:浙江大學