轉基因玉米品系cbh351pcr-dhplc檢測引物及檢測方法
2023-05-19 02:57:46
專利名稱：轉基因玉米品系cbh351 pcr-dhplc檢測引物及檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種轉基因產品的檢測，特別是涉及一種轉基因玉米品系的PCR-DHPLC檢測弓I物及檢測方法。
背景技術：
目前對轉基因玉米的檢測方法主要採用常規PCR、實時螢光PCR、PCR-基因晶片等 檢測方法。傳統的常規PCR檢測方法在平臺擴展方面具有一定的局限性，隨著待檢目標的增加，需要對體系中的每套引物的用量及比例重新進行優化，並且兼顧擴增效率等因素，工作量較大；另一方面，通常採用的凝膠電泳分析擴增產物的方法，區分效率不高，檢測結果不理想。實時螢光PCR雖然在檢測靈敏度等方面較多重常規PCR檢測方法有優勢，但是由於目前儀器自身及螢光染料研製的限制，僅能同時提供互不幹擾的4個螢光通道，也限制了該技術在檢測通量擴展。PCR-基因晶片檢測方法，操作步驟繁瑣，並不適合大規模的高通量檢測。變性高效液相色譜技術(Denaturing High-performance Liquid Chromatography,DHPLC)是一種簡單、快速、非凝膠的核酸分析方法，具有擴展性強、解析度好、靈敏度高等優點。該方法在50°C條件下分析樣品，樣品峰的洗脫只由鹼基對的數量決定洗脫順序，當過柱的乙腈濃度提高，核酸片段會根據分子量從小到大的順序被洗脫出來。通過得到的洗脫峰與marker比較確定分子量大小，判定是否含有目標檢測基因。目前，尚沒有轉基因玉米品系CBH351的PCR結合DHPLC的檢測技術(PCR-DHPLC)。
發明內容
本發明的目的是提供一種用於轉基因玉米品系CBH351的PCR-DHPLC檢測的引物。本發明的另一目的是提供一種基於上述引物的擴展性能好、靈敏度和解析度高的轉基因玉米品系CBH351的PCR-DHPLC檢測方法。為實現上述目的，本發明採用了以下技術方案本發明公開了用於轉基因玉米品系CBH351的PCR-DHPLC檢測的引物，所述引物的上遊引物含有Seq ID No. I所示序列，下遊引物含有Seq ID No. 2所示序列；Seq ID No.I :5』 -CCCGCAATTATACATTTAATACGC-3』Seq ID No. 2 :5』 -GTTATTTCCCAAGGACTTGCC-3』。需要指出的是，上述Seq ID No. I和Seq ID No. 2是與轉基因玉米品系CBH351的檢測靶標序列互補配對的特異序列，具有很強的特異性識別性。進一步的，所述上遊引物的5』端還包括Seq ID No. 3所示序列，所述下遊引物的5』端還包括Seq ID No. 4所示序列；Seq ID No. 3 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACT-3』Seq ID No. 4 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGA-3，。需要指出的是，上述Seq ID No. 3和Seq ID No. 4是分別在上遊引物和下遊引物的5 』端添加的與檢測靶標序列無關的一段序列，該序列可以是與檢測靶標序列同源性很遠的其它物種的序列，也可以是一段隨機生成的序列。該序列可以用於調控PCR擴增產物的大小，以便於PCR擴增產物的進一步分析。本發明中，優選的，所述上遊引物具有Seq ID No. 5所示序列，下遊引物具有SeqID No. 6所示序列； Seq ID No. 5 :5』 -CGTGGCCTCGCGATCTGACTCCCGCAATTATACATTTAATACGC-3』Seq ID No. 6 :5』 -CTCAGCGGCGGAGCTACAGAGTTATTTCCCAAGGACTTGCC-3』。需要說明的是，所述Seq ID No. 5和Seq ID No. 6序列是由上述Seq ID No. I和Seq ID No. 2序列分別在其5』端添加調控序列而成，儘管上述已經說明Seq ID No. 3和SeqID No. 4所示調控序列可以是隨機生成的序列，但是，並不是任意序列都可以添加，具體到本發明中，需要考慮調控序列與Seq ID No. I和Seq ID No. 2所示序列的理化性質的統一協調，並且還需要考慮添加調控序列後的Seq ID No. 3和Seq ID No. 4所示序列作為檢測引物的整體性能。本發明還公開了一種用於轉基因玉米品系CBH351的PCR-DHPLC檢測方法，所述檢測方法包括採用上述引物，以玉米DNA為模板進行PCR擴增，對PCR擴增產物進行變性高效液相色譜分析。進一步的,所述檢測方法還包括以marker為參考標準進行變性高效液相色譜分析，將PCR擴增產物的變性高效液相色譜分析結果與marker的變性高效液相色譜分析結果進行比對。優選的上述檢測方法包括如下步驟(A)採用上述引物，以玉米DNA為模板，進行PCR擴增；(B)以步驟(A)的PCR擴增產物為樣品進行DHPLC分析，同時以marker為參考標準進行DHPLC分析；(C)將步驟⑶中樣品的DHPLC分析結果與marker的DHPLC分析結果進行比較，確定樣品的分子量大小，從而判斷是否含有檢測的靶標序列。由於採用以上技術方案，本發明的有益效果在於本發明的轉基因玉米品系CBH351檢測引物具有較強的特異性，能夠用於後續的多重PCR擴增以及DHPLC分析。本發明針對傳統的電泳分析PCR擴增結果不理想的問題，將PCR與DHPLC相結合，提供了一種操作簡便、擴展性能好、靈敏度和解析度高的轉基因玉米品系CBH351檢測方法。利用DHPLC對PCR擴增產物進行分析，對不同大小的PCR產物片段區分率可達數個鹼基，甚至能夠區分出I個鹼基大小差異的片段。本發明的引物和檢測方法為轉基因玉米品系CBH351檢測提供了一種簡單、方便、有效、可靠的檢測方法，特別適合用於口岸檢驗檢疫等部門使用。
圖為本發明實施例中DHPLC分析的部分結果；圖中自上而下的曲線分別標記為M、1-19，M為marker、I為非轉基因玉米DNA、2為玉米M0N88017DNA、3為玉米MIR604DNA、4為玉米CBH176DNA、5 為玉米BtllDNA、6 為玉米M0N810DNA、7 為玉米GA21DNA、8 為玉米NK603DNA、9 為玉米 M0N863DNA、10 為玉米 M0N89034DNA、11 為玉米 Τ2 ΝΑ、12 為玉米 CBH351DNA、13 為大豆 A2704-12DNA、14 為大豆 A5547-12DNA、15 為油菜 DNA、16 為棉花 LLcotton2roNA、17 為非轉基因棉花DNA、18為Bt63DNA、19為土豆EH92-527-1DNA ；marker的各峰值從左至右依次為 80bp、102bp、174bp、257bp、267bp、296bp、434bp、458bp、587bp。
具體實施例方式本發明公布了用於轉基因玉米品系CBH351的PCR-DHPLC檢測的引物，該引物針對轉基因玉米CBH351品系的特異序列進行設計。進一步的，還在引物的上遊和下遊分別添加了一段與檢測靶標序列無關或者同源性很遠的調控序列，用於實現對擴增產物的片段大小的調控。需要指出的是，所述調控序列的加入只是為了獲得更優異的檢測效果，因此，本發明優選的，用於轉基因玉米品系CBH351的PCR結合DHPLC技術檢測的引物是加入了調控序列的引物，分別具有Seq ID No. 5至Seq ID No. 6所示序列。 本發明還公開了一種用於轉基因玉米品系CBH351的PCR-DHPLC檢測方法，所述檢測方法包括採用所述引物，以玉米DNA為模板進行PCR擴增，對PCR擴增產物進行變性高效液相色譜分析。進一步的，所述檢測方法還包括以marker為參考標準進行變性高效液相色譜分析，將PCR擴增產物的變性高效液相色譜分析結果與marker的變性高效液相色譜分析結果進行比對，根據比對結果判斷PCR擴增產物的大小，從而判斷是否含有檢測的靶標序列。本發明中，所述引物擴增產物的DHPLC洗脫峰為275bp。下面通過具體實驗例並結合附圖對本發明作進一步詳細說明。以下實驗例僅僅對本發明進行進一步的說明，不應理解為對本發明的限制。實施例I DNA提取 採用CTAB法提取樣品DNA，具體如下a)稱取樣品5g，在研缽中加入液氮研磨至樣品呈O. 5mm左右大小的粉末；b)稱取300mg磨碎的樣品，迅速轉入2mL離心管中，加65°C預熱的CTAB提取液700 μ L，混勻，放入65°C水浴鍋中水浴30min ；c)力口 5 μ L RNase (10mg/mL)，37°C 水浴 30min ；d)加入等體積Tris飽和酹,充分混勻，12000r/min離心15min ；e)取上清,加入等體積的氯仿/異戍醇(24 I)混勻，12000r/min離心15min ；f)取上清,加入等體積的氯仿/異戍醇(24 I)混勻，12000r/min離心15min ；g)加入等體積預冷的異丙醇，輕輕搖晃，置於_20°C冰箱靜置30min，12000r/min離心15min ；h)棄上清,加70%乙醇500 μ L, 12000r/min離心3min,去上清,重複2次；i)得到DNA沉澱，用冷凍乾燥儀進行乾燥，加入50 μ L 100 μ L TE或無菌去離子水，充分溶解後，測量DNA的純度和濃度後置於_20°C冰箱中保存。實施例2 DNA濃度測定對提取的樣品DNA進行濃度和純度測定；採用紫外分光光度計測定260nm和280nm處吸收值，分別計算核酸的純度和濃度，計算公式如下DNA 純度=0D260/0D280DNA 濃度=50 X 0D260mg/mLDNA的純度比值在I. 7 L 9之間，濃度大於IOng/μ L。實施例3 PCR擴增
根據轉基因玉米CBH351品系設計特異性檢測引物的結合位點，並在特異性檢測引物結合位點的5』端添加調控序列，合成含有調控序列的檢測引物(表I)，採用添加調控序列的上/下遊引物進行PCR擴增，樣品設置包括非轉基因玉米DNA、玉米品系M0N88017的DNA、玉米品系MIR604的DNA、玉米品系Btl76的DNA、玉米品系CBH351的DNA、玉米品系Btl I的DNA、玉米品系M0N810的DNA、玉米品系GA21的DNA、玉米品系NK603的DNA、玉米品系M0N863的DNA、玉米品系M0N89034的DNA、玉米品系T25的DNA、大豆品系A2704-12的DNA、大豆品系A5547-12的DNA、非轉基因油菜的DNA、LLcotton25品系的DNA、非轉基因棉花 DNA、Bt63 品系的 DNA、土豆品系 EH92-527-1 的 DNA。表I轉基因玉米品系CBH351檢測引物結合位點及引物
權利要求
1.用於轉基因玉米品系CBH351PCR-DHPLC檢測的引物，其特徵在於所述引物的上遊引物含有Seq ID No. I所示序列,下遊引物含有Seq ID No. 2所示序列；Seq ID No.I :5』 -CCCGCAATTATACATTTAATACGC-3』 Seq ID No. 2 :5』 -GTTATTTCCCAAGGACTTGCC-3』。
2.根據權利要求I所述的引物，其特徵在於所述上遊引物的5』端還包括SeqID No. 3所示序列，所述下遊引物的5』端還包括Seq ID No. 4所示序列；Seq ID No. 3 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACT-3』Seq ID No. 4 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGA-3，。
3.根據權利要求2所述的引物，其特徵在於所述上遊引物具有SeqID No. 5所示序列，下遊引物具有Seq ID No. 6所示序列；Seq ID No. 5 :5』 -CGTGGCCTCGCGATCTGACTCCCGCAATTATACATTTAATACGC-3』Seq ID No. 6 :5』 -CTCAGCGGCGGAGCTACAGAGTTATTTCCCAAGGACTTGCC-3』。
4 一種用於轉基因玉米品系CBH351的PCR-DHPLC檢測方法，其特徵在於所述檢測方法包括採用權利要求1-3任一項所述的引物，以玉米DNA為模板進行PCR擴增，對PCR擴增產物進行變性高效液相色譜分析。
5.根據權利要求4所述的檢測方法，其特徵在於所述檢測方法還包括以marker為參考標準進行變性高效液相色譜分析，將PCR擴增產物的變性高效液相色譜分析結果與marker的變性高效液相色譜分析結果進行比對。
全文摘要
本發明公開了一種轉基因玉米品系CBH351的PCR-DHPLC檢測引物及檢測方法，所述引物具有較強的特異性，能夠用於PCR擴增以及DHPLC分析。所述檢測方法提供了一種操作簡便、擴展性能好、靈敏度高的轉基因玉米品系CBH351檢測方法。利用DHPLC對PCR擴增產物進行分析，其片段大小區分率可達數個鹼基，解析度高。本發明的引物和檢測方法為轉基因玉米品系CBH351檢測提供了一種簡單、方便、有效、可靠的檢測方法，特別適合用於口岸檢驗檢疫等部門使用。
文檔編號C12N15/11GK102952859SQ20111024831
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月26日 優先權日2011年8月26日
發明者章桂明, 向才玉, 凌杏園, 潘廣, 程穎慧, 康林, 李鶴遙 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心