一種檢測禽流感病毒的表面增強拉曼光譜基底物及其應用的製作方法

2023-05-09 11:21:46

一種檢測禽流感病毒的表面增強拉曼光譜基底物及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測禽流感病毒的表面增強拉曼光譜基底物及其應用。本發明所提供的應用具體為偶聯有α(2，3)唾液酸寡糖的納米金顆粒在作為用於檢測禽流感病毒的表面增強拉曼光譜基底物中的應用。實驗證明，該基底物可以特異的捕獲待檢樣品中的禽流感病毒，通過離心收集，即可實現樣品中禽流感病毒的富集，進而用於SERS光譜檢測。由於病毒富集有效去除了樣品雜質導致的幹擾波峰，而且納米金顆粒可有效放大光譜信號，因此該基底物可用於禽流感病毒的SERS光譜檢測。該基底物對禽流感病毒的快速檢測和鑑別具有重要意義。
【專利說明】一種檢測禽流感病毒的表面增強拉曼光譜基底物及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於病毒檢測領域，涉及一種檢測禽流感病毒的表面增強拉曼光譜基底物 及其應用。

【背景技術】
[0002] 1928年印度物理學家C. V. Raman發現當單色光入射到樣品以後，樣品中的分子 會對入射光產生散射，散射光除了有與入射光頻率相同的譜線外，還存在發生位移的譜線， 我們稱這種散射為拉曼（Raman)散射。拉曼光譜屬於分子轉動和振動光譜範疇，現有的 分子結構信息大多是從分子光譜學中獲得的。因此拉曼光譜學在物理、化學、生命科學、 醫學、材料科學等領域有重要的應用價值。但是自發拉曼散射信號很弱，因此限制了其應 用。當一些分子吸附於或靠近某些粗糙的金屬表面時，他們的拉曼信號強度會增加IO2-IO7倍，這種拉曼信號強度顯著增強的現象稱為表面增強拉曼散射（Surface-enhanced Raman Scattering，SERS)效應。SERS光譜以其高解析度、高靈敏度、溶液幹擾性小、穩定性好等特 點在很多領域得到了應用。
[0003] 實驗證明，出現SERS效應現象的金屬材料只有少數幾種，目前已經發現能產生 SERS效應的有貴金屬金、銀、銅等和一些常用的過渡金屬（如鐵、鈷、鎳）等。金屬電極是最 早研究的一項SERS基底製備技術，也是目前技術相對成熟、使用範圍較為廣泛的襯底製備 技術。貴金屬溶膠顆粒法也是一種較常用的SERS基底製備方法。此樣品優點是可以較長 時間放置在空氣中，而且比較穩定，比金屬電極活性襯底具有更廣闊的使用範圍。好的基底 的選擇和製備是獲得SERS信號的前提。
[0004] 禽流感病毒是一種以野禽為天然宿主的RNA病毒，可以感染家禽，是影響我國養 禽業最為嚴重的病毒，每年導致經濟損失達數百億元。禽流感病毒偶爾也會感染人，1918年 的西班牙大流感造成了超過4千萬人的死亡，後證明該病毒來源於禽流感病毒，1997年和 2003年的H5N1病毒以及2013年的H7N9病毒導致我國上百人死亡，也都是禽流感病毒。可 見，禽流感病毒對家禽業養殖業和人類健康構成極大的威脅。表面增強拉曼光譜技術可被 應用於禽流感病毒的檢測，然而由於待檢測的臨床樣品多為糞便或洩殖腔拭子，樣品成分 複雜，而且病毒含量較低，因此SERS光譜的雜峰會掩蓋有效波峰，造成假陰性結果。


【發明內容】

[0005] 本發明的一個目的是提供偶聯有a (2, 3)唾液酸寡糖的納米金顆粒的一種新用 途。
[0006] 本發明所提供的偶聯有a (2, 3)唾液酸寡糖的納米金顆粒的新用途，具體為偶聯 有a (2, 3)唾液酸寡糖的納米金顆粒在作為用於檢測禽流感病毒的表面增強拉曼光譜基 底物中的應用。
[0007] 本發明的另一個目的是提供一種利用表面增強拉曼光譜檢測或輔助檢測待測樣 品中是否含有禽流感病毒的試劑盒。
[0008] 本發明所提供的利用表面增強拉曼光譜檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有禽 流感病毒的試劑盒，含有偶聯有a (2, 3)唾液酸寡糖的納米金顆粒和說明書；
[0009] 所述說明書中記載有如下內容：
[0010] 用所述偶聯有a (2,3)唾液酸寡糖的納米金顆粒檢測待測樣品中是否含有禽流 感病毒的方法，包括如下步驟：
[0011] (al)實驗組：將所述表面增強拉曼光譜基底物與待測樣品按照10:1的體積比進 行混合，20-25°C (如25°C )靜置IOmin ;8000g離心30min，取沉澱用PBS (pH7. 4)重懸後進 行表面增強拉曼光譜檢測；
[0012] 其中，"離心-PBS重懸"的步驟可以重複操作一次；重懸沉澱所用的PBS的量均可 為所述待測樣品的10倍體積用量。
[0013] 所述PBS的溶劑為水，溶質及濃度如下：0. 274M氯化鈉，0. 005M氯化鉀，0. 012M磷 酸氫二鈉，〇. 004M磷酸二氫鉀，pH7. 4。
[0014] 對照組：與所述實驗組相比，僅將所述待測樣品替換為等量的水，其餘均相同；
[0015] (a2)根據步驟（al)的檢測結果，按照如下確定所述待測樣品中是否含有禽流感 病毒：若所述實驗組的表面增強拉曼光譜信號強於所述對照組的表面增強拉曼光譜信號， 則所述待測樣品中含有或候選含有禽流感病毒；若所述實驗組的表面增強拉曼光譜信號不 強於所述對照組的表面增強拉曼光譜信號，則所述待測樣品中不含有或候選不含有禽流感 病毒
[0016] 在實際應用中，判斷所述實驗組的表面增強拉曼光譜信號和所述對照組的表面增 強拉曼光譜信號的強弱具體可根據表面增強拉曼光譜圖的峰高進行確定。具體如下：若所 述實驗組的表面增強拉曼光譜圖的峰高高於相同拉曼位移下所述對照組的表面增強拉曼 光譜圖的峰高，則所述實驗組的表面增強拉曼光譜信號強於所述對照組的表面增強拉曼光 譜信號；反之，則所述實驗組的表面增強拉曼光譜信號不強於所述對照組的表面增強拉曼 光譜信號。
[0017] 所述（al)中，進行所述表面增強拉曼光譜檢測時的參數具體如下：拉曼測定功率 為80mW，波長為785nm，積分時間為20s ;
[0018] 在本發明中，步驟（al)中進行所述表面增強拉曼光譜檢測時採用的儀器具體為 RamTracer-200-HS高靈敏度雷射拉曼光譜儀。
[0019] 在如上所述應用或試劑盒中，所述偶聯有a (2, 3)唾液酸寡糖的納米金顆粒為在 表面通過S-Au共價鍵連接了式I所示化合物和式II所示化合物的金納米顆粒：
[0020] 式 I :

【權利要求】
1. 偶聯有a(2, 3)唾液酸寡糖的納米金顆粒在作為用於檢測禽流感病毒的表面增強 拉曼光譜基底物中的應用。
2. -種利用表面增強拉曼光譜檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有禽流感病毒的試 劑盒，含有偶聯有a(2, 3)唾液酸寡糖的納米金顆粒和說明書； 所述說明書中記載有如下內容： 用所述偶聯有a(2,3)唾液酸寡糖的納米金顆粒檢測待測樣品中是否含有禽流感病 毒的方法，包括如下步驟： (al)實驗組：將所述偶聯有a(2,3)唾液酸寡糖的納米金顆粒與所述待測樣品按照 10:1的體積比進行混合，20-25°C靜置lOmin;8000g離心30min，取沉澱用PBS重懸後進行 表面增強拉曼光譜檢測； 對照組：與所述實驗組相比，僅將所述待測樣品替換為等量的水，其餘均相同； (a2)根據步驟（al)的檢測結果，按照如下確定所述待測樣品中是否含有禽流感病毒： 若所述實驗組的表面增強拉曼光譜信號強於所述對照組的表面增強拉曼光譜信號，則所述 待測樣品中含有或候選含有禽流感病毒；若所述實驗組的表面增強拉曼光譜信號不強於所 述對照組的表面增強拉曼光譜信號，則所述待測樣品中不含有或候選不含有禽流感病毒。
3. 根據權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於：所述（al)中，進行所述表面增強拉曼 光譜檢測時的參數如下：拉曼測定功率為80mW，波長為785nm，積分時間為20s;
4. 根據權利要求1所述的應用或權利要求2或3所述的試劑盒，其特徵在於：所述偶 聯有a(2, 3)唾液酸寡糖的納米金顆粒為在表面通過S-Au共價鍵連接了式I所示化合物 和式II所示化合物的金納米顆粒：
II：H0(CH2CH20)m(C0)n(CH2)k(CH)pSR； 所述式I和所述式II中，X為1-3的整數，m為0-6的整數，n為0-1的整數，k為0-11 的整數，P為0或2,R為S或H,Ac為乙醯基，R1為輕基或乙醯胺基，R2為氫或L-巖藻糖， R3為氫或硫酸酯，R4為輕基或乙醯胺基。
5. 根據權利要求4所述的應用或試劑盒，其特徵在於：所述式I和所述式II中，X為 1，m為3,n為1，k為4,p為1，R為S，R1為輕基，R2為氫，R3為氫，R4為輕基。
6. 根據權利要求1-5中任一所述的應用或試劑盒，其特徵在於：所述納米金顆粒的直 徑為 10-30nm。
7. 根據權利要求6所述的應用或試劑盒，其特徵在於：所述納米金顆粒的直徑為 10_15nm〇
8. 根據權利要求1-7中任一所述的應用或試劑盒，其特徵在於：構成所述偶聯有a(2， 3)唾液酸寡糖的納米金顆粒的所述式I所示化合物、所述式II所示化合物和所述金納米顆 粒的摩爾比為10000?80000 :2000?16000 :1。
9. 根據權利要求8所述的應用或試劑盒，其特徵在於：構成所述偶聯有a(2,3)唾液 酸寡糖的納米金顆粒的所述式I所示化合物、所述式II所示化合物和所述金納米顆粒的摩 爾比為 40000 :8000 :1。
【文檔編號】G01N21/65GK104406954SQ201410697470
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月26日 優先權日:2014年11月26日
【發明者】劉文軍, 李學兵, 楊利敏, 李晶, 賈曉娟, 孫蕾 申請人:中國科學院微生物研究所