一種聚乙二醇化生物素衍生物的製備方法與流程

2023-05-09 16:23:26 2

本發明屬於藥物合成領域，具體涉及一種聚乙二醇化生物素衍生物的製備方法。

背景技術：

聚乙二醇(polyethyleneglycol，peg)是由環氧乙烷與水或乙二醇逐步發生加成聚合而得到的一類分子量較低的水溶性聚醚。小分子量的低聚聚乙二醇為無色、無臭有吸溼性的粘稠液體，分子中既有醚鏈，又有羥基,故具有獨特的溶解性能,能與水、醇混溶，微溶於醚。單分散長鏈聚乙二醇聚合度一定，分子量一定，結構一定，在醫藥、材料和工程等領域具有很重要的應用前景。例如，在藥物製劑領域，聚乙二醇化的藥物、多肽以及蛋白質等可以對藥物的穩定性，免疫原性及藥代動力學性質產生顯著的影響。

生物素又稱維生素h、輔酶r，是水溶性維生素，也屬於維生素b族，b7。它是合成維生素c的必要物質，是脂肪和蛋白質正常代謝不可或缺的物質，是一種維持人體自然生長、發育和正常人體機能健康必要的營養素。生物素是20世紀30年代在研究酵母生長因子和根瘤菌的生長與呼吸促進因子時，從肝中發現的一種可以防治由於餵食生雞蛋蛋白誘導的大鼠脫毛和皮膚損傷的因子。其在肝、腎、酵母、牛乳中含量較多，是生物體固定二氧化碳的重要因素。生物素容易同雞蛋白中一種蛋白質結合，大量食用生蛋白可阻礙生物素的吸收導致生物素缺乏，如脫毛、體重減輕、皮炎等。生物素在脂肪合成、糖質新生等生化反應途徑中扮演重要角色。

維生素h對於糖原的異生，脂肪酸的綜合作用以及某些胺基酸的新陳代謝，都是一個關鍵的調控元件，並且能夠通過幫助能量的產生對某些蛋白質的合成起到促進作用；同時可協助細胞生長、製造脂肪酸、代謝糖類、脂肪及蛋白質，且有助於維他命b群的利用；促進汗腺、神經組織，骨髓、男性性腺的健康；維護皮膚及毛髮的正常運作和生長，減輕溼疹、皮炎症狀；預防白髮及脫髮，有助於治療禿頂；緩和肌肉疼痛；對憂鬱、失眠確有一定助益；還參與維生素b12、葉酸、泛酸的代謝；促進尿素合成與排洩；提高人體的免疫功能。

一方面，將peg與生物素相連接，使得生物素更有益於人體吸收，延長有效期；另一方面，基於生物素為羧化酶的輔酶，參與體內脂肪代謝和其他羧化反應，腫瘤細胞的快速增長需要大量生物素，因而在細胞表面會過量表達生物素受體，生物素與生物素受體結合力強，而生物素受體在某些腫瘤細胞表面高度表達，遠高於正常細胞中的水平，因而具有良好的腫瘤組織特異性。

基於上述，將靶向分子生物素與短鏈peg相結合，以擴大在生命健康領域及治療腫瘤領域的應用，而現有技術中很少有文獻報導聚乙二醇化生物素衍生物的製備方法及條件。

技術實現要素：

本發明將提供一種聚乙二醇化生物素衍生物及其製備方法，該製備方法peg-生物素的合成路線簡單，並得了具有較高的收率和純度聚乙二醇化生物素衍生物。

一種聚乙二醇化生物素衍生物的製備方法，其特徵在於，所述製備方法包括以下步驟：1)雙羥基聚乙二醇和金屬鹼溶於第一有機溶劑中，滴入丙烯酸叔丁酯，製得羥基聚乙二醇丙酸叔丁酯；2)將得到的羥基聚乙二醇丙酸叔丁酯和鹼溶於第一有機溶劑中，滴加對甲苯磺醯氯進行磺醯化反應得到對甲苯磺酸酯聚乙二醇丙酸叔丁酯；3)將對甲苯磺酸酯聚乙二醇丙酸叔丁酯溶於第二有機溶劑中，加入氫氧化銨反應得到氨基聚乙二醇丙酸叔丁酯；4)將生物素溶於第三有機溶劑中，加入n-羥基琥珀醯亞胺，二環己基碳二亞胺，反應得到活化的生物素，生物素-n-琥珀醯亞胺基酯；5)將氨基聚乙二醇丙酸叔丁酯和生物素-n-琥珀醯亞胺基酯溶於第三有機溶劑，加入鹼，反應得到生物素-聚乙二醇丙酸叔丁酯；6)將生物素-聚乙二醇丙酸叔丁酯溶於第三有機溶劑中，加入三氟乙酸，反應得到生物素聚乙二醇丙酸，所述生物素聚乙二醇丙酸的結構式為：其中n為1-20的整數。

進一步地，所述第一有機溶劑為四氫呋喃、二氯甲烷、二氧六環中的一種。

進一步地，所述第二有機溶劑為二氯甲烷、甲醇、乙醇中的一種。

進一步地，所述第三有機溶劑為二甲基甲醯胺、二氧六環、二氯甲烷中的一種。

進一步地，所述鹼為三乙胺、氫氧化鈉、吡啶中的一種。

進一步地，所述步驟1)中聚乙二醇、丙烯酸叔丁酯和金屬鹼的摩爾比為1：0.55～0.82：0.02～0.04。

進一步地，所述步驟1)中金屬鹼為鈉、鉀、鋰中的一種。

進一步地，所述步驟2)中的磺醯化反應是於溫度為20℃～40℃，反應時間為10～15h的條件下進行的。

進一步地，所述步驟3)中由對甲苯磺酸酯聚乙二醇丙酸叔丁酯製得氨基聚乙二醇丙酸叔丁酯的反應過程是於溫度為20～50℃，時間為24～48h的條件下進行的。

本發明中，以聚乙二醇和生物素為原料，經過6步反應，將靶向分子生物素與短鏈peg相結合，得到最終純品，具有製備方法簡單，原料簡單易得，純化簡單等有益效果。

具體實施步驟

一種聚乙二醇化生物素衍生物的製備方法，所述製備方法包括以下步驟：1)peg和金屬鹼溶於第一有機溶劑中，滴入丙烯酸叔丁酯，製得羥基聚乙二醇丙酸叔丁酯(oh-peg-tbu)；其中聚乙二醇、丙烯酸叔丁酯和金屬鹼的摩爾比為1：0.55～0.82：0.02～0.04；所述金屬鹼為鈉、鉀、鋰中的一種。2)將得到的羥基聚乙二醇丙酸叔丁酯和鹼溶於第一有機溶劑中，滴加對甲苯磺醯氯於溫度為20℃～40℃，反應時間為10～15h的條件下進行磺醯化反應得到對甲苯磺酸酯聚乙二醇丙酸叔丁酯(toso-peg-tbu)；3)將對甲苯磺酸酯聚乙二醇丙酸叔丁酯(toso-peg-tbu)溶於第二有機溶劑中，加入氫氧化銨於溫度為20～50℃，時間為24～48h的條件下反應得到氨基聚乙二醇丙酸叔丁酯(nh2-peg-tbu)；4)將生物素溶於第三有機溶劑中，加入n-羥基琥珀醯亞胺，二環己基碳二亞胺，反應得到活化的生物素，生物素-n-琥珀醯亞胺基酯(biotin-nhs)；5)將氨基聚乙二醇丙酸叔丁酯(nh2-peg-tbu)和生物素-n-琥珀醯亞胺基酯(biotin-nhs)溶於第三有機溶劑，加入鹼，反應得到生物素-聚乙二醇丙酸叔丁酯(biotin-peg-tbu)；6)將biotin-peg-tbu溶於第三有機溶劑中，加入三氟乙酸，反應得到生物素聚乙二醇丙酸(biotin-peg-cooh)，所述生物素聚乙二醇丙酸的結構式為：其中n為1-20的整數，其中所述第一有機溶劑為四氫呋喃、二氯甲烷、二氧六環中的一種；所述第二有機溶劑為二氯甲烷、甲醇、乙醇中的一種；所述第三有機溶劑為二甲基甲醯胺、二氧六環、二氯甲烷中的一種；鹼為三乙胺、氫氧化鈉、吡啶中的一種。

具體的製備路線如下：

,其中n為1-20的整數。

實施例1

(1)將100g三甘醇加入至400ml四氫呋喃中，稱取0.36g碎的金屬鈉加入上述溶液中，並室溫攪拌1h。稱取50g丙烯酸叔丁酯滴加到上述反應液中，室溫攪拌12h。tlc顯示反應結束，加20ml水淬滅反應，旋除溶劑四氫呋喃，再加入300ml水，然後用400ml二氯甲烷萃取3次。無水硫酸鈉乾燥二氯甲烷相，旋幹，得到約100g粗產物(ho-peg3-tbu)；

(2)將步驟(1)得到的100g粗產物，38g三乙胺加入到400ml二氯甲烷中，攪拌，稱取55g對甲苯磺醯氯溶於150ml二氯甲烷，在冰水浴條件下滴加至反應體系中，滴畢，30℃反應12h。tlc顯示反應結束，加300ml水洗，分液，無水硫酸鈉乾燥有機相，旋幹，得到約150g磺醯化的粗產物(toso-peg3-tbu)；

(3)將步驟(2)得到的150g磺醯化的粗產物加入到200ml二氯甲烷中，再加入100ml氫氧化銨，20g四丁基溴化銨，升溫到50℃，攪拌24h。反應結束，旋幹，分別用3m鹽酸和氫氧化鈉溶液處理，再用二氯甲烷300ml萃取3次，無水硫酸鈉乾燥，旋幹，得到22g氨基端的產物(nh2-peg3-tbu)。核磁數據如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：3.702(t，j＝6.4hz，2h)；3.652～3.615(m，10h)；3.330(t，j＝4.8hz，2h)；2.853(t，j＝6.8hz，2h)；1.974(s，2h)；1.442(s，9h)；

(4)將50g生物素和24gnhs溶於400ml二甲基甲醯胺中，在冰浴下，分批緩慢加入46g二環己基碳二亞胺。升溫至50℃，攪拌10h。反應結束，冷卻至室溫，反應液緩慢倒入3l飽和食鹽水中，析出白色固體，抽濾，濾餅用甲醇洗2次，乾燥後得到40g產品(biotin-nhs)。核磁數據如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.499(s，1h)；6.429(s，1h)；4.350(t，j＝6.4hz，1h)；4.189(t，j＝4.8hz，1h)；3.156～3.109(m，1h)；2.880(t，j＝4.8hz，1h)；2.720(t，j＝7.2hz，2h)；2.621(d，j＝12.8hz，1h)；2.531(s，1h)；1.707～1.434(m，6h)；

(5)將23gbiotin-nhs和22gnh2-peg3-tbu溶於250ml二甲基甲醯胺中，加入8.8g三乙胺，並室溫攪拌12h。反應結束，反應液緩慢倒入1l飽和食鹽水中，500ml二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉乾燥，旋幹，粗產品用矽膠柱層析分離，得到27g產品，白色固體(biotin-peg3-tbu)。核磁數據如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.953(s，1h)；6.668(s，1h)；4.546(t，j＝6.4hz，1h)；4.354(t，j＝4.8hz，1h)；3.761(t，j＝6.0hz，2h)；3.629～3.435(m，12h)；3.189(t，j＝4.8hz，1h)；2.946(t，j＝4.8hz，2h)；2.780(d，j＝12.8hz，1h)；2.547(t，j＝5.2hz，2h)；2.282(t，j＝7.2hz，2h)；1.805～1.661(m，4h)；1.440(s，11h)；

(6)將27gbiotin-peg3-tbu溶於300ml二氯甲烷中，加入60ml三氟乙酸，並室溫攪拌5h。反應結束，用飽和碳酸鈉調ph為中性，再用二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉乾燥，旋幹，粗產品用矽膠柱層析分離，得到16g產品，白色固體(biotin-peg3-cooh)。核磁數據如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：7.870(s，1h)；6.465(s，1h)；6.402(s，1h)；4.346(t，j＝6.4hz，1h)；4.187(t，j＝4.8hz，1h)；3.651(t，j＝6.0hz，2h)；3.607～3.396(m，12h)；3.358(t，j＝4.8hz，1h)；3.180(t，j＝4.8hz，2h)；2.868(d，j＝12.8hz，1h)；2.616(t，j＝5.2hz，2h)；2.108(t，j＝7.2hz，2h)；1.661～1.271(m，6h)。

實施例2

(1)將100g六甘醇加入至400ml二氧六環中，稱取0.16g碎的金屬鉀加入上述溶液中，並室溫攪拌1h。稱取25g丙烯酸叔丁酯滴加到上述反應液中，室溫攪拌12h。tlc顯示反應結束，加20ml水淬滅反應，旋除溶劑二氧六環，再加入300ml水，然後用400ml二氯甲烷萃取3次。無水硫酸鈉乾燥二氯甲烷相，旋幹，得到約90g粗產物(ho-peg6-tbu)；

(2)將步驟(1)得到的90g粗產物，19g吡啶加入到400ml二氧六環中，攪拌，稱取25g對甲苯磺醯氯溶於100ml二氧六環，在冰水浴條件下滴加至反應體系中，滴畢，20℃反應15h。tlc顯示反應結束，加300ml水洗，dcm萃取，分液，無水硫酸鈉乾燥有機相，旋幹，得到約120g磺醯化的粗產物(toso-peg6-tbu)；

(3)將步驟(2)得到的120g磺醯化的粗產物加入到200ml甲醇中，再加入100ml氫氧化銨，20g四丁基溴化銨，升溫到35℃，攪拌36h。反應結束，旋幹，分別用3m鹽酸和氫氧化鈉溶液處理，再用二氯甲烷300ml萃取3次，無水硫酸鈉乾燥，旋幹，得到40g氨基端的產物(nh2-peg6-tbu)。核磁數據如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：3.712(t，j＝6.4hz，2h)；3.662～3.610(m，22h)；3.320(t，j＝4.8hz，2h)；2.833(t，j＝6.8hz，2h)；1.955(s，2h)；1.440(s，9h)；

(4)將50g生物素和24gnhs溶於400ml二甲基甲醯胺中，在冰浴下，分批緩慢加入46g二環己基碳二亞胺。升溫至50℃，攪拌10h。反應結束，冷卻至室溫，反應液緩慢倒入3l飽和食鹽水中，析出白色固體，抽濾，濾餅用甲醇洗2次，乾燥後得到40g產品，biotin-nhs。核磁數據如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.499(s，1h)；6.429(s，1h)；4.350(t，j＝6.4hz，1h)；4.189(t，j＝4.8hz，1h)；3.156～3.109(m，1h)；2.880(t，j＝4.8hz，1h)；2.720(t，j＝7.2hz，2h)；2.621(d，j＝12.8hz，1h)；2.531(s，1h)；1.707～1.434(m，6h)；

(5)將12gbiotin-nhs和20gnh2-peg6-tbu溶於250ml二甲基甲醯胺中，加入4.5g三乙胺，並室溫攪拌12h。反應結束，反應液緩慢倒入1l飽和食鹽水中，500ml二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉乾燥，旋幹，粗產品用矽膠柱層析分離，得到21g產品，白色固體(biotin-peg6-tbu)。核磁數據如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.951(s，1h)；6.663(s，1h)；4.536(t，j＝6.4hz，1h)；4.332(t，j＝4.8hz，1h)；3.721(t，j＝6.0hz，2h)；3.609～3.431(m，24h)；3.180(t，j＝4.8hz，1h)；2.926(t，j＝4.8hz，2h)；2.763(d，j＝12.8hz，1h)；2.527(t，j＝5.2hz，2h)；2.262(t，j＝7.2hz，2h)；1.790～1.641(m，4h)；1.441(s，11h)；

(6)將21gbiotin-peg6-tbu溶於300ml二氯甲烷中，加入60ml三氟乙酸，並室溫攪拌5h。反應結束，用飽和碳酸鈉調ph為中性，再用二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉乾燥，旋幹，粗產品用矽膠柱層析分離，得到17g產品，白色固體(biotin-peg6-cooh)。核磁數據如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：7.880(s，1h)；6.455(s，1h)；6.395(s，1h)；4.336(t，j＝6.4hz，1h)；4.180(t，j＝4.8hz，1h)；3.641(t，j＝6.0hz，2h)；3.600～3.390(m，24h)；3.348(t，j＝4.8hz，1h)；3.178(t，j＝4.8hz，2h)；2.860(d，j＝12.8hz，1h)；2.607(t，j＝5.2hz，2h)；2.101(t，j＝7.2hz，2h)；1.651～1.269(m，6h)。

實施例3

(1)將10g十二甘醇加入至100ml二氯甲烷中，稱取13mg碎的金屬鈉加入上述溶液中，並室溫攪拌1h。稱取1.9g丙烯酸叔丁酯滴加到上述反應液中，室溫攪拌12h。tlc顯示反應結束，加20ml水淬滅反應，旋除溶劑二氯甲烷，再加入100ml水，然後用200ml二氯甲烷萃取3次。無水硫酸鈉乾燥二氯甲烷相，旋幹，得到約9g粗產物(ho-peg12-tbu)；

(2)將步驟(1)得到的9g粗產物，2g氫氧化鈉加入到100ml四氫呋喃中，攪拌，稱取3.7g對甲苯磺醯氯溶於20ml四氫呋喃，在冰水浴條件下滴加至反應體系中，滴畢，40℃反應10h。tlc顯示反應結束，加100ml水洗，分液，無水硫酸鈉乾燥有機相，旋幹，得到約12g磺醯化的粗產物(toso-peg12-tbu)；

(3)將步驟(2)得到的12g磺醯化的粗產物加入到50ml乙醇中，再加入100ml氫氧化銨，2g四丁基溴化銨，升溫到20℃，攪拌48h。反應結束，旋幹，分別用3m鹽酸和氫氧化鈉溶液處理，再用二氯甲烷200ml萃取3次，無水硫酸鈉乾燥，旋幹，得到5g氨基端的產物(nh2-peg12-tbu)。核磁數據如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：3.652(t，j＝6.4hz，2h)；3.612～3.555(m，46h)；3.301(t，j＝4.8hz，2h)；2.783(t，j＝6.8hz，2h)；1.915(s，2h)；1.422(s，9h)；

(4)將50g生物素和24gnhs溶於400ml二甲基甲醯胺中，在冰浴下，分批緩慢加入46g二環己基碳二亞胺。升溫至50℃，攪拌10h。反應結束，冷卻至室溫，反應液緩慢倒入3l飽和食鹽水中，析出白色固體，抽濾，濾餅用甲醇洗2次，乾燥後得到40g產品，biotin-nhs。核磁數據如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.499(s，1h)；6.429(s，1h)；4.350(t，j＝6.4hz，1h)；4.189(t，j＝4.8hz，1h)；3.156～3.109(m，1h)；2.880(t，j＝4.8hz，1h)；2.720(t，j＝7.2hz，2h)；2.621(d，j＝12.8hz，1h)；2.531(s，1h)；1.707～1.434(m，6h)；

(5)將1.5gbiotin-nhs和3gnh2-peg12-tbu溶於30ml二甲基甲醯胺中，加入0.7g三乙胺，並室溫攪拌12h。反應結束，反應液緩慢倒入200ml飽和食鹽水中，100ml二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉乾燥，旋幹，粗產品用矽膠柱層析分離，得到2.5g產品，白色固體(biotin-peg12-tbu)。核磁數據如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.961(s，1h)；6.653(s，1h)；4.516(t，j＝6.4hz，1h)；4.325(t，j＝4.8hz，1h)；3.710(t，j＝6.0hz，2h)；3.619～3.423(m，48h)；3.170(t，j＝4.8hz，1h)；2.915(t，j＝4.8hz，2h)；2.749(d，j＝12.8hz，1h)；2.518(t，j＝5.2hz，2h)；2.260(t，j＝7.2hz，2h)；1.788～1.638(m，4h)；1.445(s，11h)；

(6)將2.5gbiotin-peg12-tbu溶於50ml二氯甲烷中，加入10ml三氟乙酸，並室溫攪拌5h。反應結束，用飽和碳酸鈉調ph為中性，再二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉乾燥，旋幹，粗產品用矽膠柱層析分離，得到1.5g產品，白色固體(biotin-peg12-cooh)。核磁數據如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：7.860(s，1h)；6.450(s，1h)；6.390(s，1h)；4.322(t，j＝6.4hz，1h)；4.169(t，j＝4.8hz，1h)；3.634(t，j＝6.0hz，2h)；3.589～3.376(m，48h)；3.338(t，j＝4.8hz，1h)；3.170(t，j＝4.8hz，2h)；2.851(d，j＝12.8hz，1h)；2.601(t，j＝5.2hz，2h)；2.105(t，j＝7.2hz，2h)；1.641～1.260(m，6h)。

實施例4

(1)將10g十八甘醇加入至100ml四氫呋喃中，稱取11.4mg碎的金屬鈉加入上述溶液中，並室溫攪拌1h。稱取1.3g丙烯酸叔丁酯滴加到上述反應液中，室溫攪拌12h。tlc顯示反應結束，加20ml水淬滅反應，旋除溶劑四氫呋喃，再加入300ml水，然後用400ml二氯甲烷萃取3次。無水硫酸鈉乾燥二氯甲烷相，旋幹，得到約10g粗產物(ho-peg18-tbu)；

(2)將步驟(1)得到的10g粗產物，1.5g三乙胺加入到100ml二氯甲烷中，攪拌，稱取2.5g對甲苯磺醯氯溶於10ml二氯甲烷，在冰水浴條件下滴加至反應體系中，滴畢，30℃反應12h。tlc顯示反應結束，加100ml水洗，分液，無水硫酸鈉乾燥有機相，旋幹，得到約11g磺醯化的粗產物(toso-peg18-tbu)；

(3)將步驟(2)得到的11g磺醯化的粗產物加入到150ml二氯甲烷中，再加入50ml氫氧化銨，2g四丁基溴化銨，升溫到50℃，攪拌24h。反應結束，旋幹，分別用3m鹽酸和氫氧化鈉溶液處理，再用二氯甲烷200ml萃取3次，無水硫酸鈉乾燥，旋幹，得到7g氨基端的產物(nh2-peg18-tbu)。核磁數據如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：3.702(t，j＝6.4hz，2h)；3.652～3.615(m，70h)；3.330(t，j＝4.8hz，2h)；2.853(t，j＝6.8hz，2h)；1.974(s，2h)；1.442(s，9h)；

(4)將50g生物素和24gnhs溶於400ml二甲基甲醯胺中，在冰浴下，分批緩慢加入46gdcc。升溫至50℃，攪拌10h。反應結束，冷卻至室溫，反應液緩慢倒入3l飽和食鹽水中，析出白色固體，抽濾，濾餅用甲醇洗2次，乾燥後得到40g產品(biotin-nhs)。核磁數據如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.499(s，1h)；6.429(s，1h)；4.350(t，j＝6.4hz，1h)；4.189(t，j＝4.8hz，1h)；3.156～3.109(m，1h)；2.880(t，j＝4.8hz，1h)；2.720(t，j＝7.2hz，2h)；2.621(d，j＝12.8hz，1h)；2.531(s，1h)；1.707～1.434(m，6h)；

(5)將23gbiotin-nhs和7gnh2-peg18-tbu溶於250ml二甲基甲醯胺中，加入8.8g三乙胺，並室溫攪拌12h。反應結束，反應液緩慢倒入1l飽和食鹽水中，500ml二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉乾燥，旋幹，粗產品用矽膠柱層析分離，得到20g產品，白色固體(biotin-peg3-tbu)。核磁數據如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.953(s，1h)；6.668(s，1h)；4.546(t，j＝6.4hz，1h)；4.354(t，j＝4.8hz，1h)；3.761(t，j＝6.0hz，2h)；3.629～3.435(m，72h)；3.189(t，j＝4.8hz，1h)；2.946(t，j＝4.8hz，2h)；2.780(d，j＝12.8hz，1h)；2.547(t，j＝5.2hz，2h)；2.282(t，j＝7.2hz，2h)；1.805～1.661(m，4h)；1.440(s，11h)；

(6)將20gbiotin-peg18-tbu溶於300ml二氯甲烷中，加入60ml三氟乙酸，並室溫攪拌5h。反應結束，用飽和碳酸鈉調ph為中性，再用二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉乾燥，旋幹，粗產品用矽膠柱層析分離，得到16g產品，白色固體(biotin-peg18-cooh)。核磁數據如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：7.870(s，1h)；6.465(s，1h)；6.402(s，1h)；4.346(t，j＝6.4hz，1h)；4.187(t，j＝4.8hz，1h)；3.651(t，j＝6.0hz，2h)；3.607～3.396(m，72h)；3.358(t，j＝4.8hz，1h)；3.180(t，j＝4.8hz，2h)；2.868(d，j＝12.8hz，1h)；2.616(t，j＝5.2hz，2h)；2.108(t，j＝7.2hz，2h)；1.661～1.271(m，6h)。

實施例5

(1)將10g二十四甘醇加入至100ml四氫呋喃中，稱取2mg碎的金屬鋰加入上述溶液中，並室溫攪拌1h。稱取0.8g丙烯酸叔丁酯滴加到上述反應液中，室溫攪拌12h。tlc顯示反應結束，加20ml水淬滅反應，旋除溶劑二氯甲烷，再加入100ml水，然後用200ml二氯甲烷萃取3次。無水硫酸鈉乾燥二氯甲烷相，旋幹，得到約9g粗產物(ho-peg24-tbu)；

(2)將步驟(1)得到的9g粗產物，2g三乙胺加入到100ml二氯甲烷中，攪拌，稱取1.9g對甲苯磺醯氯溶於20ml二氯甲烷，在冰水浴條件下滴加至反應體系中，滴畢，40℃反應10h。tlc顯示反應結束，加100ml水洗，分液，無水硫酸鈉乾燥有機相，旋幹，得到約10g磺醯化的粗產物(toso-peg24-tbu)；

(3)將步驟(2)得到的10g磺醯化的粗產物加入到50ml甲醇中，再加入50ml氫氧化銨，2g四丁基溴化銨，升溫到20℃，攪拌48h。反應結束，旋幹，分別用3m鹽酸和氫氧化鈉溶液處理，再用二氯甲烷200ml萃取3次，無水硫酸鈉乾燥，旋幹，得到5g氨基端的產物(nh2-peg24-tbu)。核磁數據如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：3.652(t，j＝6.4hz，2h)；3.612～3.555(m，94h)；3.301(t，j＝4.8hz，2h)；2.783(t，j＝6.8hz，2h)；1.915(s，2h)；1.422(s，9h)；

(4)將50g生物素和24gnhs溶於400ml二甲基甲醯胺中，在冰浴下，分批緩慢加入46g二環己基碳二亞胺。升溫至50℃，攪拌10h。反應結束，冷卻至室溫，反應液緩慢倒入3l飽和食鹽水中，析出白色固體，抽濾，濾餅用甲醇洗2次，乾燥後得到40g產品，biotin-nhs。核磁數據如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.499(s，1h)；6.429(s，1h)；4.350(t，j＝6.4hz，1h)；4.189(t，j＝4.8hz，1h)；3.156～3.109(m，1h)；2.880(t，j＝4.8hz，1h)；2.720(t，j＝7.2hz，2h)；2.621(d，j＝12.8hz，1h)；2.531(s，1h)；1.707～1.434(m，6h)；

(5)將1.5gbiotin-nhs和5gnh2-peg24-tbu溶於30ml二甲基甲醯胺中，加入0.7g三乙胺，並室溫攪拌12h。反應結束，反應液緩慢倒入200ml飽和食鹽水中，100ml二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉乾燥，旋幹，粗產品用矽膠柱層析分離，得到5g產品，白色固體(biotin-peg24-tbu)。核磁數據如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.961(s，1h)；6.653(s，1h)；4.516(t，j＝6.4hz，1h)；4.325(t，j＝4.8hz，1h)；3.710(t，j＝6.0hz，2h)；3.619～3.423(m，96h)；3.170(t，j＝4.8hz，1h)；2.915(t，j＝4.8hz，2h)；2.749(d，j＝12.8hz，1h)；2.518(t，j＝5.2hz，2h)；2.260(t，j＝7.2hz，2h)；1.788～1.638(m，4h)；1.445(s，11h)；

(6)將5gbiotin-peg24-tbu溶於50ml二氧六環中，加入10ml三氟乙酸，並室溫攪拌5h。反應結束，用飽和碳酸鈉調ph為中性，再二氧六環萃取，無水硫酸鈉乾燥，旋幹，粗產品用矽膠柱層析分離，得到4g產品，白色固體(biotin-peg24-cooh)。核磁數據如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：7.860(s，1h)；6.450(s，1h)；6.390(s，1h)；4.322(t，j＝6.4hz，1h)；4.169(t，j＝4.8hz，1h)；3.634(t，j＝6.0hz，2h)；3.589～3.376(m，96h)；3.338(t，j＝4.8hz，1h)；3.170(t，j＝4.8hz，2h)；2.851(d，j＝12.8hz，1h)；2.601(t，j＝5.2hz，2h)；2.105(t，j＝7.2hz，2h)；1.641～1.260(m，6h)。