一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的製備方法
2023-04-27 03:19:01
一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的製備方法
【專利摘要】本發明提供了一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體製備方法，包括以下步驟：步驟一，富集：將蠟樣芽孢桿菌活化後塗平板擴大培養；步驟二，固定：改良型沸水浴法使菌體表面成分固定，使抗原決定簇充分暴露；步驟三，乳化：用自組裝乳化器將佐劑和菌體混合物製成均勻乳化液；步驟四，免疫：採用背部多位點為主，外周位點為輔的方式，進行動物免疫；步驟五，抗血清效價：採用ELISA方法評估抗血清效價，進行加強免疫；步驟六，取全血：採用水合氯醛麻醉，頸部動脈取全血；步驟七，抗血清製備：將兔全血適宜溫度靜置自然層析，離心分離抗血清；步驟八，純化：利用正辛酸-硫酸銨法，純化抗血清製備多克隆抗體；該製備方法得到的多克隆抗體效價高、特異性好，靈敏度強具有極大的應用優勢。
【專利說明】一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，特別涉及一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的製備方法。【背景技術】
[0002]第一起蠟樣芽孢桿菌食物中毒早在1906年就有報告。但直至1950年才明確其病因，之後許多國家，特別是北歐、東歐國家也報告了類似的中毒症。1960~1968年間在匈牙利細菌性食物中毒中，蠟樣芽孢桿菌為第三個最常見的致病菌，該菌所致食物中毒為已報告食物中毒起數的84%，中毒人數佔總中毒人數的14.8%。1971年以來，英國報告過多起該菌食物中毒。我國南京市衛生防疫站於1973年首次報告了南京某託兒所兒童因進食泡飯引起嘔吐型蠟樣芽孢桿菌食物中毒。現今除西藏外，各省、市已相繼報告該菌食物中毒。蠟樣芽孢桿菌食物中毒涉及的食品種類多，在我國發生的蠟樣芽孢桿菌食物中毒多與米飯或澱粉類製品有關。據調查，食物的帶菌率最高可達70%，誤食帶有大量活菌及其腸毒素的食物後可引起嘔吐型或腹瀉型腸胃炎，對人類的健康有著極大的危害，為提高食品安全性，建立一種快速靈敏的檢測方法十分必要，具有極大的科研及應用價值。目前蠟樣芽孢桿菌復溶檢測方法主要有
[0003]細菌學檢測方法
[0004]傳統的細菌學檢測主要依據菌落的形態特徵和其生理特性，如菌落是否灰白色，不透明，表面較粗糙，似毛玻璃狀或融蠟狀，菌落較大等特徵進行甄別、檢測。根據這特性設計的一系列試驗均可對蠟樣芽孢桿菌進行鑑定，無需測試其它生化指標。但是需長時間進行選擇性增菌，整個過程耗時較長。。極大限制了在食品加工中對該菌汙染的有效監控。
[0005]免疫學檢測
[0006]傳統的血清學反應如單向/雙向擴散技術、間接血凝技術、對流免疫瓊脂凝膠泳技術，補體結合試驗等雖然操作簡便，但是影響因素因素太多，且費時，敏感差。因此，更多新的免疫學檢測技術應運而生，包括酶聯免疫吸附(ELISA)、疫螢光(III)、放射免疫法(RIA)、流式細胞分析(FCM)、免疫電化學發光(IECL)等。這些免疫學檢測方法都建立在抗原抗體特異結合的基礎上，同時利用螢光，放射性，酶標等顯色技術而達到檢測目的。這些方法特異性、重複性以及敏感性較好，且結合物高度穩定、有效期長、儀器設備簡單，因而廣泛應用於實驗室研究。而這些方法的基石在獲得一株特異性好靈敏度高的臘樣芽胞桿菌的抗體，本專利針對此問題建立了一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的製備方法，為蠟樣芽孢桿菌快速高特異性檢測方法的建立奠定基礎。
【發明內容】
[0007]發明目的:本發明的目的是提供一種高效的蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的製備方法。
[0008]技術方案:本發明提供的一種蠟樣芽孢桿菌的製備方法，包括以下步驟:
[0009]I)富集:首先將0.5~Iml的_80°C凍存的蠟樣芽孢桿菌的菌種加入到20~40mlLuria~Bertani液體培養基中，36~38°C恆溫搖床150~250rpm震蕩過夜，將蠟樣芽孢桿菌的菌種活化，取50~150ul活化好的菌種用塗布法將其均勻塗布在Luria~Bertani固體培養基表面，36~38°C恆溫培養箱，培養12~24h，當培養的蠟樣芽孢桿菌的菌體數量可以完全覆蓋平板時，用2~3ml濃度為0.9%的生理鹽水，藉助無菌的塗布棒輕輕刮板，避免將培養基刮下，收集洗滌液製備菌液，7000~9000rpm/min高速離心5~lOmin，棄上清，得到菌富集沉澱，0.9%的生理鹽水洗滌沉澱，洗滌次數為3~5次。
[0010]2)固定:指將菌沉澱首先浸潤於液氮5~lOmin，然後快速完全溶解於5ml濃度為
0.9%的生理鹽水，置於沸水浴變加熱邊震蕩15~20min，使得臘樣芽胞桿菌的表面成分固定，抗原決定簇充分暴露，製備得到菌抗原。
[0011]3)乳化:將一定濃度的固定好的蠟樣芽孢桿菌的生理鹽水懸浮液，分別添加一定劑量的氟氏佐劑及RIBI佐劑，利用自組裝乳化儀自組裝乳化儀將混合物處理30~50min得到均勻的乳化液。
[0012]4)免疫:將製備得到的乳化液，以氟氏完全佐劑組注射背部多位點為主，以RIBI佐劑組注射腹股溝、腋窩、腳蹼的外周位點為輔注射I~2月齡，重約2~3Kg雌性紐西蘭大白兔背部平行的八個位點，免疫注射菌抗原懸浮液的濃度為5X IO8~IOX IO8CfVmU量為0.5~2ml，每個位點注射200~300ul ;腹股溝、腋窩、腳蹼外周位點免疫注射菌抗原懸浮液的濃度為I X IO8~5X 108cfu/ml，用量為0.5~2ml ;免疫間隔設置為首次免疫與第二次免疫、第三次免疫、第四次免疫注射間隔時間為5~9d，2~4d，2~4d，2~4d。
[0013]5)抗血清效價:採用間接競爭ELISA方法評估抗血清效價，符合50~100萬標準後，對大白兔以腹腔注射 的方式進行加強免疫，注射劑是蠟樣芽孢桿菌的生理鹽水懸浮液，菌懸浮液的濃度為5 X IO8~IOX 108cfu/ml，注射劑量為I~2.5ml，7_14d後準備供全血；
[0014]6)取全血:採用5~15%水合氯醛以5~10ml/Kg體重的注射劑量對大白兔進行麻醉，待大白兔無肢體反應後，進行勁動脈剝離，利用採血針取全血；
[0015]7)抗血清製備:將兔全血在2~8°C，靜置I~3h，使抗血清自然層析，然後7000~1000Orpm高速離心10~20min將抗血清從全血中分離出來；
[0016]8)純化:利用正辛酸飽和硫酸銨法，將血清調pH為4~5後，微滴加入正辛酸，使用劑量為70~90ul/ml血清，然後將血清用I~3mol/ml NaOH調至為pH為7~8，然後在-2~2°C條件下加入(NH4)2SO4至終濃度為0.200g~0.300/ml ;從兔血清中製備得到抗蠟樣芽孢桿菌的多克隆抗體；
[0017]有益效果
[0018]本發明提供的蠟樣芽孢桿菌的多克隆抗體製備方法得到的多克隆抗體效價高、特異性好，靈敏度強具有極大的應用優勢。
[0019]該方法首先對優化了臘樣芽孢桿菌菌種的活化方法，採用Luria~Bertani液體培養基，並對菌種與培養基的添加比進行優化，並採用平板培養法對菌進行富集，用塗布棒輕刮表層菌體，並用生理鹽水收集富集菌體，減少了培養基的影響，獲得了高純度的菌體，為高純度菌抗原的製備奠定基礎。
[0020]該方法採用改良型沸水浴加熱方法對製備得到的高純度抗原進行表面抗原固定處理，與未普通沸水浴加熱法相比，其顯著優點是:液氮預浸潤菌沉澱使得菌表面組分迅速固定，極大的降低了傳統沸水浴加熱菌體滅活製備抗原時對表面組分的破壞，使得菌菌表面形態最大程度的與活菌有一致的表面學性質，使得製備得到的抗體可以特異靈敏的識別具有毒力的活菌。
[0021]該方法還優化了免疫的菌體的量(蠟樣芽孢桿菌懸浮液的濃度)最大程度的觸發動物免疫，既避免了大劑量導致的免疫抑制，又不會因為免疫劑量不足而使得免疫促發不足。
[0022]該方法創新的採用了背部多位點免疫方式為主，腹股溝、腋窩、腳蹼外周免疫注射為輔的新型免疫方式，結合雙佐劑，極大的促發了機體對菌抗原的免疫反應，在短時間內，得到了效價極高的抗血清，大大提到了血清中抗體的分泌量，且縮短了免疫周期。
[0023]該方法利用自主裝迷你乳化器，適合2~4ml小劑量乳化液的製備，較雙注射器交聯法，可以依靠迷你電機帶動自製迷你轉子轉動，大大節省人力，且可以實現3種抗原的同時乳化，大大提高注射乳化劑的製備效率。
[0024]該方法採用低濃度水合氯醛以腹腔注射方式對大白兔實施全身麻醉，使體積較大的大白兔有意識的深度昏迷，使得可以順利剝離勁動脈，最大量的取得兔全血。
[0025]該方法在製備抗血清時，首先將其在2~8°C靜置處理，使抗血清自行層析，最大程度上離心得到抗血清。
[0026]該方法在純化兔抗血清時，依據鼠抗血清純化方法，將正辛酸量提高了 I倍左右，使得兔血清中雜蛋白更優方式沉集。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1為蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的SDS~PAGE電泳圖
[0028]圖2為自主裝迷你乳化器示意圖；
[0029]圖3為免疫兔子時的免疫位點說明示意圖；
[0030]圖4為兔子頸動脈取全血位點示意圖。
具體實施方案
[0031]通過下面的實施例對本發明做進一步的詳細說明。
[0032]蠟樣芽孢桿菌抗原的製備
[0033]將本實驗室的蠟樣芽孢桿菌復甦活化。配置LB培養基(每升中稱取胰蛋白腖10g、酵母酵粉5g和NaCl 10g, pH7.0 )，在121°C下高壓滅菌20分鐘。在無菌環境條件下，將ImL~80°C保存的蠟樣芽孢桿菌添加到25mL液體培養基中，37°C，220rpm的培養箱中培養15h。配置固體LB培養基(每升中稱取胰蛋白腖10g、酵母酵粉5g、NaC110g和15g瓊脂粉，pH7.0),在121°C下高壓滅菌20分鐘，當溫度降到~50°C時，在無菌環境下，將培養基傾倒入已經高壓滅過菌的平皿中，平置待其凝固。取200 μ L上述液體培養活化的菌均勻的塗在已經凝固的培養基上，37°C靜置培養15h。配置無菌生理鹽水，稱取0.9gNaCl溶於IOOmL蒸餾水中，121°C下高壓滅菌20分鐘。用無菌生理鹽水將上述平皿上菌吹洗到IOmL無菌生理鹽水中，8000rpm離心5min,倒掉上清,用無菌生理鹽水吹洗沉澱3次,最後將沉澱溶於5mL的無菌生理鹽水中。沸水浴煮沸15min後4°C保存備用。
[0034]蠟樣芽孢桿菌抗原的乳化
[0035]乳化佐劑採 用氟氏佐劑及RIBI佐劑兩種，氟氏佐劑是用於背部多位點免疫注射，RIBI佐劑是用於腹股溝、腋窩、腳蹼外周位點免疫；兩種佐劑的用量均為50%，背部多位點免疫注射菌抗原懸浮液的濃度為6X108cfu/ml，用量為Iml ;外周免疫注射菌抗原懸浮液的濃度為3X108cfu/ml，用量為Iml ;乳化過程採用自組裝乳化儀包括迷你電機其可承受轉速為8000rpm，迷你變壓器其可將電壓220V轉換為1.0V的小電壓，乳化時間為40min。
[0036]3、蠟樣芽孢桿菌抗原的免疫程序
[0037]第1次免疫
[0038]將蠟樣芽孢抗原(濃度為6X108cfu/ml)均分為三份，其中兩份加等量氟氏完全佐劑(FCA)乳化完全後，採用背部皮下多位點(~6個位點)注射方式給每隻兔子，另外一份加等量RIBI佐劑乳化完全後，採用腹股溝、腋窩、腳蹼外周注射方式給每隻兔子。
[0039]第2次免疫
[0040]第1次免疫完成7天後，進行第2次免疫，免疫方案如上，只是將FCA換成氟氏不完全佐劑(FIA)且抗原濃度減半。
[0041]第3次免疫
[0042]第2次免疫完成3天後，進行第3次免疫，免疫方案同2)。
[0043]第4次免疫
[0044]第4次免疫完成3天後，進行第4次免疫，免疫方案同2)，第4次免疫完成7天後進行耳緣靜脈取血，取上清用ELISA測血清的效價，效價達到了 51.2萬。
[0045]第4次免疫(取血前加強免疫)
[0046]與最後一次免疫間隔712後，對兔子進行取血前的加強免疫，將濃度為6X108cfu/ml的菌抗原以腹腔注射的方式注入兔子體內，免疫量與第一次的免疫量一致。加強免疫完一周後進行頸部動脈採全血。
[0047]4、血清獲取
[0048]加強免疫完成後7天，進行全血採取。每隻兔子首先注射10%水合氯醛10ml/Kg體重，待大白兔無肢體反應後，進行勁動脈剝離，利用採血針取全血；取得全血4°C靜置lh，7000rpm，離心15min，將上清小心吸到新的離心管中，~20°C保存備用。
[0049]抗體的純化
[0050]首先採用正辛酸~硫酸銨法純化抗體。提前一天將凍存腹水4°C進行解凍，4°C，12000rpm,離心15min,收集上清,棄沉澱；x mL腹水與4倍體積的醋酸鹽緩衝液充分混合，調PH值至4.5~4.8 ;攪拌下緩慢加入正辛酸33 μ Ι/mL腹水，室溫混合30min，4°C靜置2h以上；4.?, 12000rpmin,5min,收集上清,棄沉澱；上清用0.25 μ m濾膜過濾後,加入1/10體積的0.1M pH值7.4的PBS (即10倍平時所用的PBS)，用2M NaOH調pH值至7.4 ;上清4°C預冷，於30min內加入硫酸銨至終濃度為0.277g/mL，4°C靜置2h ；4°C, 12000rpmin離心30min，棄上清；用1/10原腹水體積的PBS溶解沉澱；採用脫鹽柱對所得抗體進行脫鹽處理；置於~20°C進行預凍；凍幹保存。
[0051]所得抗體指標測定
[0052]濃度測定。採用微量蛋白紫外測定儀測定所得多克隆抗體的濃度，測定的濃度為33.1 μ g/mL。
[0053]SDS~PAGE電泳。將 樣品100°C煮沸5min，完全破壞IgG分子的二硫鍵，打開重鏈和輕鏈。用微量移液器加樣，樣品標準蛋白和純化後抗體各加10 μ L,腹水加2 μ L。電泳開始時，樣品進行濃縮，所需電壓為70V，當樣品濃縮完全後，電壓改變為120V進行分離。當樣品至分離膠底部，斷開電源。剝離凝膠，採用考馬斯亮藍染液進行染色30min，然後用脫色液脫色，放置於搖床上過夜，脫色完全後將凝膠拍照保存，結果見附圖。
[0054]抗體效價測定。
[0055](I)包被:包被緩衝液(ρΗ9.6)稀釋AHP~Ka濃度至2 μ g/mL,酶標板每孔滴加100yL，4°C過夜，甩幹，PBST洗板三次，扣幹；
[0056](2)封閉:酶標板每孔滴加200μ L封閉液，37°C溫育2h，甩幹，PBST洗板三次，扣幹;
[0057](3)抗原抗體反應:抗血清用PBST兩倍倍比稀釋，酶標板每孔滴加100 μ L,並做同等濃度的陰性和陽性對照，37°C溫育lh，甩幹，PBST洗板三次，扣幹；
[0058](4) 二抗反應:羊抗鼠IgG = HRP酶標二抗用PBST作1:10000稀釋，酶標板每孔滴加100 μ L，37°C溫育lh,甩幹，PBST洗滌六次，扣幹；
[0059](5)顯色反應:酶標板每孔滴加100 μ L底物顯色液，37°C避光溫育15min ；
[0060](6)終止反應:酶標板每孔滴加50 μ L反應終止液，於450nm處測定吸光值；
[0061](7)保存並分析數據，以待測孔0D450≥陰性孔0D450的2.1倍，判為陽性。
[0062]檢測效價結果為51.2萬。
[0063]
【權利要求】
1.一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的製備，其特徵在於，包括以下步驟: (1)富集:首先將蠟樣芽孢桿菌的菌種活化，利用培養基將活化的蠟樣芽孢桿菌菌種富集到一定的數量，洗滌製備菌液，高速離心，棄上清，得到菌富集沉澱，並用生理鹽水洗滌沉澱； (2)固定:使用改良型沸水浴加熱方法，使得蠟樣芽胞桿菌的表面成分固定，抗原決定簇充分暴露，製備得到菌抗原； (3)乳化:將固定好的蠟樣芽孢桿菌的生理鹽水懸浮液調至合適菌濃度，分別添加一定劑量的佐劑I及佐劑2，利用自組裝乳化儀處理分層混合物得到均勻的乳化液； (4)免疫:將製備得到的乳化液，以背部多位點為主，以腹股溝、腋窩、腳蹼的外周位點為輔的肌肉注射方式，及短免疫間隔方式，注射到紐西蘭大白兔體內； (5)抗血清效價:採用ELISA方法評估抗血清效價，符合標準後，對大白兔進行加強免疫，準備取全血； (6)取全血:採用水合氯醛對大白兔進行麻醉,從頸部動脈取全血； (7)抗血清製備:將兔全血在合適的溫度靜置，使抗血清自然層析，然後採用高速離心的方法將抗血清從全血中分離出來； (8)純化:利用正辛酸飽和硫酸銨法，從兔血清中製備得到抗蠟樣芽孢桿菌的多克隆抗體。
2.根據權利要求1所述的一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的製備，其特徵在於:步驟(1)中，所述的菌種活化方法是將0.5~ImL的_80°C凍存的蠟樣芽孢桿菌的菌種加入到20~40mL Luria~Bertani液體培養基中，36~38°C恆溫搖床150~250rpm震蕩過夜。富集活化菌種的培養基是Lur ia~Bertani固體培養基，富集方法是取50~150ul活化好的菌種用塗布法將其均勻塗布在Luria~Bertani固體培養基表面，36~38°C恆溫培養箱，培養12~24h。
3.根據權利要求1所述的一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的製備方法，其特徵在於:步驟(I)中，一定數量是指當培養的蠟樣芽孢桿菌的菌體數量可以完全覆蓋平板時，且菌層厚度為2~3mm ;洗滌用液是2~3mL濃度為0.9%的生理鹽水，洗滌方式是用無菌的塗布棒進行刮板，操作要輕，避免將培養基刮下，收集洗滌液。
4.根據權利要求1所述的一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的製備方法，其特徵在於:步驟(I)中，高速離心操作是指7000~9000rpm/min,離心5~IOmin,洗漆沉澱的方式是將菌沉澱輕輕彈起洗滌，洗滌次數為3~5次，洗滌液是濃度為0.9%的生理鹽水。
5.根據權利要求1所述的一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的製備方法，其特徵在於:步驟(2)中，改良型沸水浴加熱方法是指將菌沉澱首先浸潤於液氮5~lOmin，然後快速完全溶解於5mL-10mL濃度為0.9%的生理鹽水中，置於沸水浴邊加熱邊震蕩15~20min。
6.根據權利要求1所述的一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的製備方法，其特徵在於:步驟(3)中，佐劑I是氟氏佐劑，佐劑2是RIBI佐劑，氟氏完全佐劑是用於背部皮下多位點免疫，RIBI佐劑是用於腹股溝、腋窩、腳蹼外周位點免疫注射；兩種佐劑的用量均為0.5~2mL，背部多位點免疫注射菌抗原懸浮液的濃度為5 X IO8~IOX 108cfu/mL，用量為0.5~2mL ;腹股溝、腋窩、腳蹼外周位點免疫注射菌抗原懸浮液的濃度為I X IO8~5X 108cfu/mL，用量為0.5~2mL。
7.根據權利要求1所述的一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的製備方法，其特徵在於:步驟(3)中，短免疫間隔是指首次免疫與第二次免疫、第三次免疫、第四次免疫注射間隔時間為5~9d，2~4d，2~4d，2~4d。自組裝乳化儀包括迷你電機其可承受轉速為8000~12000rpm，迷你變壓器其可將220V電壓轉換為10~1.0V的小電壓、自製轉子具有反向齒輪、自製乳化管可以裝載2~7mL混合物體積；乳化時間為30~50min。
8.根據權利要求1所述的一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的製備方法，其特徵在於:步驟(4)中，紐西蘭大白兔為I~2月齡，重約2~3Kg的雌性大白兔，多位點為背部平行的八個位點，每個位點注射200~300ul。
9.根據權利要求1所述的一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的製備方法，其特徵在於:步驟(5)中，ELISA為間接競爭ELISA，效價標準為50~100萬，加強免疫時直接用製備好的蠟樣芽孢桿菌的生理鹽水懸浮液，菌懸浮液的濃度為5 X IO8~IOX 108cfu/mL，注射劑量為I~2.5mL，加強免疫的方式為腹腔注射。
10.根據權利要求1所述的一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的製備方法，其特徵在於:步驟(6)中，水合氯醛的濃度為5~15%，注射劑量為5~10mL/Kg體重，待大白兔無肢體反應後，進行勁動脈剝離，利用採血針取全血。
11.根據權利要求1所述的一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的製備方法，其特徵在於:步驟(7)中，兔全血的靜置溫度為2~8°C，靜置時間為I~3h。高速離心法是指，離心轉速為7000~lOOOOrpm，離心時間為10~20min。
12.根據權利要求1所述的一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的製備方法，其特徵在於:步驟(8)中，將血清調pH為4~5後，微滴加入正辛酸，使用劑量為70~90ul/mL血清，然後將血清用I~3mol/mL NaOH調至為pH為7~8，然後在-2~2°C條件下加入(NH4)2SO4至終濃度為0.200g~0.300 /mL。
【文檔編號】C07K16/12GK103804494SQ201410023622
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月19日 優先權日:2014年1月19日
【發明者】許文濤, 朱龍佼, 黃崑崙, 何景, 羅雲波, 翟百強, 董凱 申請人:北京福德安科技有限公司, 中國農業大學